ARTÍCULOS PRIMARIOS

Competencia del ovocito bovino obtenido por ovum pick-up valorado mediante el azul brillante de cresilo

Competence of the bovine oocyte obtained by ovum pick-up as evaluated by the bright cresyl blue test

 

Luis Ayala G.¹, Jorge Samaniego C.^1,3, Pedro Nieto E.¹, Ramiro Rodas C.¹, Jorge Dután S.¹, Guido Calle O.¹, Yury Murillo A.¹, Juan Vázquez M.¹, Daniel Argudo G.², Fernando Perea G.¹

1 Carrera de Medicina Veterinaria, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Cuenca, Ecuador

2 Laboratorio de Biotecnología Animal, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Cuenca, Ecuador

3 E-mail: jorgereivax@hotmail.com

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RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue valorar la prueba del azul brillante de cresilo (BCB) como método indirecto para seleccionar ovocitos competentes para la producción in vitro de embriones (PIV). Los complejos cúmulos-ovocitos (COC) fueron obtenidos de dos vaquillas criollas sometidas a dos tratamientos: T1 = COC recuperados por OPU (ovum pick-up) previa estimulación con FSH-LH; T2 = COC recuperados sin previa estimulación de la donante (testigo). Las dos vaquillas fueron alternadas en los dos tratamientos y se hicieron cinco repeticiones. Los COC recuperados fueron clasificados en tipos A, B, C y D. Luego se aplicó la prueba del BCB a cada uno de los tipos de COC para determinar si son BCB+ o BCB-. T1 permitió recuperar 5.2 más COC que T2 (p<0.05). Al aplicar la prueba del BCB se determinó que todos los ovocitos tipo A de T1 y T2 fueron BCB+; es decir, terminaron su crecimiento y se encontraban listos para iniciar el proceso de maduración in vitro; sin embargo, alrededor del 50% de los COC tipo B, C y D de T1 y T2 fueron BCB+. Se concluye que la selección de COC basado en las características morfológica es un método confiable únicamente para los de tipo A, y tiene un 50% de error para los COC de tipo B, C y D y, por lo tanto, la aplicación de la prueba del BCB permite mejorar esta selección de forma no invasiva.

Palabras clave: COC bovinos; morfología ovocitaria; BCB; G6PDH

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ABSTRACT

The objective of the present study was to evaluate the bright blue cresyl (BCB) test as an indirect method to select competent oocytes for the in vitro production of embryos (IVP). The cumulus-oocyte complexes (COC) were obtained from two Creole heifers subjected to two treatments: T1 = COC recovered by OPU (ovum pick-up) previous stimulation with FSH-LH; T2 = COC recovered from non-stimulated animals (control). The two heifers were alternated in the two treatments and five repetitions were done. Recovered COCs were classified into types A, B, C and D. Then the BCB test was applied to each of the COC types to determine if they were BCB+ or BCB-. T1 allowed to recover 5.2 more COC than T2 (p<0.05). When applying the BCB test, it was determined that all type A oocytes of T1 and T2 were BCB+; that is, they finished their growth and were ready to start the process of in vitro maturation; however, about 50% of the type B, C and D COCs of T1 and T2 were BCB+. It is concluded that the selection of COC based on morphological characteristics is a reliable method only for type A and has a 50% error for COC type B, C and D and, therefore, the application of the BCB test allows to improve this selection non-invasively.

Key words: bovine COC; oocyte morphology; BCB; G6PDH

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INTRODUCCIÓN

La clasificación morfológica de los COC (complejos cumulus ovocitos), junto a la determinación del diámetro folicular y ovocitario, han sido los métodos más utilizados para la selección de gametas de óptima calidad previo a la producción in vitro de embriones (PIV) (Marchal et al., 2002; Anguita et al., 2007; Carrasco, 2012). En un principio, los COC aptos para PIV fueron seleccionados mediante criterios morfológicos que proporcionaban pautas razonables para identificar el potencial de fertilización, tomando en cuenta el espesor (número de capas), la compactación del cumulus, la homogeneidad y la tonalidad del ooplasma (Gordon, 2003); lo cual en el bovino ha demostrado una alta variabilidad al momento de evaluar el citoplasma debido a su poca o nula traslucidez, situación que no sucede en otras especies en las cuales la clasificación morfológica se correlaciona directamente con una buena capacidad de desarrollo (Goovaerts et al., 2010). Sin embargo, en los últimos años se ha comprobado que estos métodos son ineficientes, ya que apenas el 60% de los COC seleccionados alcanzan la fase de blastocisto posterior a la fecundación (Alm et al., 2005).

Ensayos realizados han demostrado que COC inmaduros sintetizan una variedad de proteínas durante su crecimiento, entre ellas la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PDH), la cual es sintetizada en la mitad de la primera fase (S) de crecimiento ovocitario y que disminuye conforme el ovocito termina su fase de crecimiento (Wassarman, 1988). Autores como Ericsson et al. (1993) y Roca et al. (1998) describieron que la tinción con azul brillante de cresilo (BCB) permite seleccionar de una manera no invasiva y perturbadora a los COC más homogéneos y competentes para la PIV; esto debido a que permite cuantificar la actividad de la enzima G6PDH, considerando a ovocitos que retienen la tinción como aquellos que terminaron su crecimiento (BCB+; G6PDH inactiva) y ovocitos incoloros a aquellos que se encuentran en crecimiento (BCB-; G6PDH activa) (Pujol et al., 2004).

Al ser considerada como una técnica relativamente nueva, existe poca documentación y mucha controversia en las diferentes especies de interés zootécnico; así, Mirshamsi et al. (2013) establecieron que un 54.3% de COC bovinos morfológicamente compactos eran BCB+ y podría ser utilizado para PIV; esto es corroborado por Pujol et al. (2004) quienes encontraron un porcentaje mayor de COC BCB+ en ovocitos de grado 1 (78.6%) a comparación de COC grado 2 (66.2%) y grado 3 (51.1%). Sin embargo, en otras especies, Katska-Ksiazkiewicz et al. (2007) señalaron que no existe diferencia en la competencia de desarrollo entre ovocitos BCB+ y ovocitos clasificados como grado 1 (control) obtenidos de cabras. El presente estudio tuvo como objetivo utilizar la prueba del azul brillante de cresilo como método indirecto para seleccionar ovocitos de mayor competencia para la PIV.

MATERIALES Y MÉTODOS

Colección de los COC

Se utilizaron dos vaquillas criollas como donadoras de ovocitos, que fueron alternadas en dos tratamientos (T1: COC recuperados de vaquillas estimuladas; T2: COC recuperados de vaquillas no estimuladas [testigo]), cada uno con cinco repeticiones. Las hembras fueron sometidas al proceso de estimulación hormonal propuesto por Ruiz et al. (2013): Día 0: GnRH (Conceptal®, Intervet), 0.2 mg i.m.; Día 2: 500 UI FSHLH (Pluset®, Laboratorios Calier, Barcelona); y 48 h después Ovum Pick-up (OPU).

Todos los folículos >4 mm y >8 mm fueron aspirados con el apoyo de un ecógrafo portátil (Prosound 2, Aloka, Japón) con un transductor sectorial de 5 MHz. Este último fue ensamblado en un soporte para sonda, que contenía la guía de punción conformada por una aguja (1.2x75 mm) conectada a una bomba de vacío (BV-003D, WTA, Brasil) con una presión de aspiración de 70 mmHg. Los COC recuperados fueron transportados en solución tampón fosfato salino (PBS) a 37 °C al laboratorio de biotecnología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Cuenca, Ecuador,

Clasificación

Los COC fueron clasificados morfológicamente según los criterios descritos por Le Guienne (1999) en: A = ovocito de apariencia compacta con más de cuatro capas de células del cumulus, citoplasma granular uniforme y transparente; B = ovocito con 1 a 3 capas de células del cumulus que cubren la zona pelúcida, con citoplasma opaco, total o parcialmente homogéneo y finamente granulado; C = ovocitos totalmente denudados, y/o citoplasma con zonas oscuras irregulares y D = ovocitos deformados con células de la granulosa que cubren parcial o totalmente la zona pelúcida o completamente expandidos con cumulus disperso y descolorido.

Prueba del Azul Brillante de Cresilo (BCB)

Todos los ovocitos seleccionados como A, B, C y D fueron colocados en 26 µM de BCB (B-5388, Sigma-Aldrich) diluido en PBS de Dulbecco durante 90 minutos a 38 °C y CO al 5%. Luego, cada grupo de ovocitos fue lavado tres veces en una solución atemperada de PBS y examinado bajo estereoscopía para determinar si habían terminado su crecimiento (BCB+) o no (BCB-) (Pujol et al., 2004).

Diseño Experimental

Como criterio de inclusión se consideraron ovocitos provenientes de folículos con diámetro entre 4 y 8 mm y como criterio de exclusión a ovocitos contaminados con bacterias durante el cultivo. La punción folicular se realizó una vez por semana entre diciembre de 2016 y marzo de 2017. Todas las punciones fueron realizadas por el mismo Médico Veterinario.

Se utilizó un modelo lineal general a través del PROC GLM en el SAS v. 9.3 (SAS, 2013). Las diferencias entre medias se compararon mediante la prueba de TukeyKramer.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El Cuadro 1 muestra la relación entre el número de folículos visualizados por ecografía y el número de COC recuperados por OPU. Como era de esperarse, el tratamiento 1 (con estimulación) permitió recuperar 5.2 más COC que el grupo testigo (sin estimulación) (p<0.05). La tasa de recuperación en T1 fue 17.1% superior a T2 (p<0.05). El porcentaje de recuperación denota la eficiencia alcanzada en la técnica del OPU, en tanto que la diferencia entre tratamientos podría ser explicada por el protocolo de estimulación utilizado, que permite obtener folículos más homogéneos que facilitan la punción ecoguiada (Pieterse et al., 1988; De Roover et al., 2005; Torres et al., 2008). Asimismo, los resultados obtenidos concuerdan con De Roover et al. (2005), quienes señalan que un animal estimulado hormonalmente antes del OPU aumenta significativamente el número de folículos visualizados y COC recuperados con respecto a aquellos que no recibieron estimulación.

En el Cuadro 2 se puede observar que del total de COC recuperados (9.0 ± 0.63) de animales estimulados hormonalmente, el 26.7% corresponden al tipo A, 34.4% al B, 21.1% al C y 17.8% al D, mientras que para T2, el 13.8% fueron clasificados como A, 25.0% como B, 47.4% como y 13.8% como D, siendo las frecuencias en los tipos A, B y D significativamente diferentes (p<0.05).

Diversos autores consideran a ovocitos de las categorías A y B como aptos para PIV y a C y D como no aptos para esta biotecnología (Humblot et al., 2005; Ireland et al., 2007 ; Katska-Ksiazkiewicz et al., 2007). Es así, que se puede decir que en el 61.1% de los ovocitos en T1 serían considerados como aptos y en solo el 38.8% en T2 serían aptos. Esto es corroborado por Restrepo et al. (2011) quienes describen que este comportamiento se debe al efecto de la FSH y LH, que no solo permite el reclutamiento y crecimiento de un mayor número de folículos (efecto FSH) sino que, además, ejerce un efecto favorable sobre la calidad de los COC recuperados (efecto LH). Blondin et al. (2012) señalaron que ovocitos provenientes de hembras no estimuladas hormonalmente tuvieron menor competencia que ovocitos de hembras estimuladas, lo cual concuerda con los resultados de esta investigación.

Al realizar la prueba del BCB, se determinó que el 100% de los ovocitos de tipo A, tanto de T1 como de T2, son BCB+; es decir, terminaron su crecimiento y pueden continuar con su proceso de maduración. Este resultado es mayor al obtenido por Pujol et al. (2004) quienes determinaron un 78.6% de BCB+ en ovocitos de tipo 1. Esta diferencia puede ser explicada por la procedencia de los ovocitos que en su investigación fueron de ovarios de matadero. Rodríguez et al. (2002) y Alm et al. (2005) ratifican que la prueba de BCB se ve influenciada directamente por el grado morfológico de los ovocitos.

Alrededor del 55% de los ovocitos de tipo B son BCB+, lo que permite argumentar de que no todos los ovocitos de tipo B están listos para continuar con el proceso de maduración. Este comportamiento fue observado por Pujol et al. (2004), quienes demostraron que un 34% de los ovocitos seleccionados para PIV, según criterios morfológicos (grados 1 al 3), no han terminado su crecimiento; es decir, eran BCB-. Así mismo, se encontró un porcentaje mayor de BCB+ en COC de grado 1 en comparación con COC grado 2, e igual comportamiento fue observado entre COC de grado 2 y 3.

Por otra parte, al analizar los ovocitos de tipo C y D en conjunto no se observan diferencias entre tratamientos, pero se determinó que alrededor del 60% habían culminado su crecimiento (BCB+). En cuanto a los COC de tipo C (COC denudados), un alto porcentaje (aprox. 61%) fue BCB+. Este comportamiento pudo ser efecto indirecto de factores técnicos relacionados con la geometría de la aguja (diámetro, longitud, afilado, ángulo, etc.) o la presión de aspiración que produjo pérdida de las células del cúmulo (Ruiz, 2010; Boni, 2012). En cuanto a los ovocitos de tipo D, su comportamiento BCB+ se debe a que morfológicamente son maduros; es decir, terminaron su crecimiento y, es por eso que, diversos investigadores excluyen a estos ovocitos de la PIV, al ser considerados como no aptos para esta biotecnología (Pujol et al., 2004; Alm et al., 2005; Chaubal et al., 2006; Ireland et al., 2007 ; Ding et al., 2008). Por otra parte, se observa que alrededor del 50% de los ovocitos tipo D son BCB-, y se considera que estos son ovocitos producto de folículos en fase de atresia.

CONCLUSIONES

La selección de COC apoyada en la prueba no invasiva del azul brillante de cresilo (BCB) permite mejorar la selección de gametos que tradicionalmente se fundamenta en la morfología y características del citoplasma del ovocito.

 

LITERATURA CITADA

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Recibido: 17 de octubre de 2017

Aceptado para publicación: 16 de febrero de 2018