ARTÍCULOS PRIMARIOS

Eficacia antimicrobiana del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris) sobre una cepa de Staphylococcus aureus

Antimicrobial efficacy of thyme essential oil (Thymus vulgaris) on a Staphylococcus aureus strain

 

Mayra Montero-Recalde^1,2, Juan Carlos Mira¹, Diana Avilés-Esquivel¹, Pilar Pazmiño-Miranda¹, Ramiro Erazo-Gutiérrez¹

¹ Universidad Técnica Ambato, Campus Querochaca, Cevallos, Tungurahua, Ecuador

² E-mail: ma.montero@uta.edu.ec

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RESUMEN

El trabajo de investigación tuvo como objetivo evaluar la eficacia antimicrobiana in vitro del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris) sobre Staphylococcus aureus. Se evaluaron concentraciones al 1, 5, 10, 30, 50, 70 y 90% en dilución en etanol al 96.8%. Se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria mediante el método de microdilución en caldo. El inóculo bacteriano se estandarizó al 0.5 de la escala de MacFarland en espectofotómetro, teniendo como resultado que el tubo al 1% de aceite de tomillo no presentó turbidez. Este, al ser sembrado en agar Mueller-Hinton determinó la Concentración Bactericida Mínima donde no se observó crecimiento de colonias. Los resultados indican que los tratamientos al 5 y 10% no son significativamente diferentes (p<0.05) con valores de halos de inhibición de 15.35 mm y 15.9 mm, respectivamente, en comparación al 1% que presentó 12.2 mm de halo de inhibición.

Palabras clave: concentración mínima bactericida; concentración mínima inhibitoria; MacFarland

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ABSTRACT

The objective of this study was to evaluate the in vitro antimicrobial efficacy of thyme essential oil (Thymus vulgaris) on Staphylococcus aureus. Concentrations at 1, 5, 10, 30, 50, 70 and 90% were evaluated in 96.8% dilution in ethanol. The Minimum Inhibitory Concentration was determined by the broth microdilution method. The bacterial inoculum was standardized to 0.5 of the MacFarland scale in spectrophotometer, with the result that the 1% tube of thyme oil did not present turbidity. This, when cultured on Mueller-Hinton agar, determined the Minimum Bactericidal Concentration where no colony growth was observed. The results indicate that treatments at 5 and 10% were not significantly different (p<0.05) with values of inhibition halos of 15.35 mm and 15.9 mm, respetively compared to 1% concentration that presented 12.2 mm of halo of inhibition.

Keywords: minimum bactericidal concentration; minimum inhibitory concentration; MacFarland

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INTRODUCCIÓN

Staphylococcus aureus se encuentra mayormente en los conductos nasales, pero también se le encuentra en la piel, tracto gastrointestinal y en la cavidad oral (Todar, 2017). Es una bacteria gram-positiva esférica (Grijalva et al., 2014) que al ser observada en el microscopio presenta una forma de racimo (Arteaga-Delgado et al., 2016). Esta bacteria patógena es causante de una gran cantidad de infecciones cutáneas de tejidos blandos, pleuropulmonares y osteoarticulares (Tong et al., 2015).

Se ha demostrado que S. aureus es resistente a antibióticos como la meticilina (Aires-de-Sousa, 2017), haciéndose cada vez más necesario el uso de nuevas alternativas para su control, como podría ser el uso de extractos vegetales (Pereira Arantes et al., 2016).

El aceite de Thymus vulgaris muestra actividad antifúngica y antimicrobiana (Matiz et al., 2015) por su componente mayoritario que es el 1,8-cineol en un 21.5%, seguido del B-pineno con 20% y el o-cimeno con 17.9% (Coy y Acosta, 2013), variando su composición de acuerdo al genotipo, localización geográfica, periodo de cosecha y método de extracción (Nevas et al., 2004). Diversos estudios demuestran su acción contra S. aureus a una concentración mínima inhibitoria del 0.03% v/v (Reyes et al., 2014).

El trabajo de investigación tuvo como objetivo evaluar la eficacia antimicrobiana in vitro del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris) sobre Staphylococcus aureus.

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se realizó en el Laboratorio de Bacteriología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Técnica de Ambato (Campus Querochaca), ubicada en el cantón Cevallos, Tungurahua, Ecuador, a 2883 msnm. El laboratorio estuvo bajo ambiente controlado a 29 ºC y 40% de humedad.

Se adquirió 5 kg de tomillo en un mercado de la ciudad de Riobamba, provincia de Chimborazo. El material fue lavado con agua destilada y secado en un lugar ventilado y obscuro por 24 horas. El aceite fue obtenido mediante destilación por arrastre de vapor en equipo tipo Clevenger, para lo que se añadió 1.5 litros de agua destilada por kilo de material vegetal. Las concentraciones del aceite esencial de tomillo utilizadas fueron de 1, 5, 10, 30, 50, 70 y 90% (v/v), utilizando como solvente el etanol al 96.8%, calculadas de manera porcentual, en 5 ml de volumen total para cada concentración.

La cepa certificada Staphylococcus aureus ATCC® BAA-976™* fue adquirida del distribuidor en Ecuador MEDIBAC (Corporate Headquarters, Minnesota, EEUU). Para determinar la concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida se colocó la cepa en agar Manitol y con un asa bacteriológica se realizó el estriamiento por el método escocés e incubó a 37 °C durante 24 h. Se siguió la metodología descrita por García (2006) utilizando el método de microdilución en caldo o de Kirby-Bauer, en donde se tomaron cinco colonias aisladas de la cepa certificada y se las transfirió a 5 ml de caldo Cerebro-Corazón, estandarizado en el espectrofotómetro con el fin de obtener un valor de 0.4 de absorbancia. La solución resultante tuvo 1x10⁸ Unidades Formadoras de Colonias (UFC). Se colocó 1 ml de la escala estandarizada en tubos de ensayo más 1 ml de las concentraciones del aceite esencial de tomillo y fueron incubados a 37 °C durante 24 h, estableciendo la menor turbidez como la concentración mínima inhibitoria. Luego, al realizar la siembra de los tubos que presentaron menor turbidez en agar MacConkey se determinó la concentración mínima bactericida y su interpretación valorada a través del cero crecimiento de colonias en placa.

Para la prueba de difusión por disco, se tomaron cinco colonias de la cepa certificada cultivada previamente por 24 h en agar Manitol salado y se inocularon en 5 ml de caldo Cerebro-Corazón. Se incubaron a 37 °C durante 2-3 h hasta que apareció una turbidez semejante al tubo N.° 0.5 de la escala de MacFarland. La solución resultante tuvo 1x10⁸ UFC. Una vez estandarizada la cepa se cultivó por estriado múltiple en agar Mueller Hinton, dejando reposar por 10 min antes de colocar los discos de sensibilidad OXOID impregnados con las dosis de aceite de tomillo y etanol al 96.8 % como testigo. Se colocaron cuatro discos de sensibilidad en la superficie del agar de cada placa y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Posteriormente se midieron los halos de inhibición usando una regleta.

RESULTADOS

El comportamiento de la cepa Staphylococcus aureus ATCC® BAA976™* frente al incremento en las concentraciones de tomillo mostró actividad específica observada en la turbidez de las muestras, demostrando que, desde la concentración de 1% en adelante no presentó turbidez y, por tanto, no existió crecimiento bacteriano.

En la concentración bactericida mínima no se apreció crecimiento de colonias en agar Mueller Hinton, por lo tanto, las concentraciones de aceite de tomillo al 1, 5, 10, 30, 50, 70 y 90% no permitieron el desarrollo bacteriano de la cepa de Staphylococcus auerus ATCC® BAA-976™**

En el Cuadro 1 se observa que los resultados de las diluciones de los tratamientos al 5 y 10% fueron estadísticamente similares, en tanto que el halo de inhibición en la concentración de 1% fue significativamente menor (p<0.05). Es importante indicar que no se pudo determinar la sensibilidad a las concentraciones de 30, 50, 70 y 90% ya que el crecimiento bacteriano en placa quedó totalmente inhibido.

DISCUSIÓN

El aceite esencial de tomillo resultó altamente eficaz sobre la cepa Staphylococcus aureus, en forma similar a otros estudios (Sartoratto et al., 2004; Imelouane et al., 2009; Coy y Acosta, 2013; Fahimi et al., 2014) donde se utilizó aceite esencial de Thymus vulgaris como antimicrobiano contra S. aureus. No obstante, el extracto acuoso de tomillo no fue efectivo en el estudio de Herrera y García (2006), indicando que este tipo de extracto funciona mejor en condiciones anaerobias, mientras que Hammad et al. (2007) señalan que la efectividad antimicrobiana del tomillo en estado acuoso varía en función de la concentración.

La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) evidenció un efecto claramente marcado a partir del 1% del aceite esencial de tomillo sobre la cepa de S. aureus, resultados similares a los obtenidos con el 1.23% por De Souza et al. (2008) y con 0.3% por Hammad et al. (1999) y Sadiki et al. (2014). Por otro lado, García (2006) determinó una CMI de 2.77%, haciendo mención que la variación se debió al empleo de extracto alcohólico, el cual necesita de mayor concentración para inhibir el crecimiento bacteriano. La comparación de datos obtenidos en este estudio con respecto a resultados de otros estudios resulta compleja. Asi, Hammer et al. (1999) mencionan que la composición de aceites y extractos de T. vulgaris cambia según las condiciones climáticas y ambientales de cada región.

Los resultados de la prueba de sensibilidad antimicrobiana del aceite esencial de T. vulgaris sobre S. aureus se asemejan a los obtenidos por Zeghad y Merghem (2013), quienes utilizaron aceite esencial de T. vulgaris al 30%, obteniendo halos de inhibición entre 10 y 15 mm. De igual manera, Acosta et al. (2000), reportaron halos de 8 y 20 mm en concentraciones al 5 y 10%, respectivamente.

CONCLUSIONES

• El aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris) demostró una alta eficacia antimicrobiana in vitro sobre la cepa de Staphylococcus aureus.

• La concentración mínima bactericida de aceite esencial de tomillo que impidió el desarrollo de colonias bacterianas fue de 1%.

• Concentraciones de 30% y mayores de aceite esencial de tomillo inhibieron totalmente el crecimiento bacteriano.

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Recibido: 19 de octubre de 2017

Aceptado para publicación: 2 de marzo de 2018