ARTÍCULOS PRIMARIOS

Concordancia entre las técnicas de hemaglutinación indirecta e inmunoabsorción ligado a enzimas en el diagnóstico de toxoplasmosis porcina

Concordance between indirect hemagglutination and enzyme-linked immunosorbent techniques in the diagnosis of porcine toxoplasmosis

 

Marlene Gonzales L.¹, Christian Luyo A.¹, Rosa Pinedo V.¹, Amanda Chávez V.¹, Eva Casas A.^1,2

1 Laboratorio de Microbiología y Parasitología Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

2 E-mail: evacasas99@gmail.com

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RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue determinar la concordancia entre las pruebas de hemaglutinación indirecta (HAI) y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para detectar IgG anti-Toxoplasma gondii en el diagnóstico de toxoplasmosis porcina. Se colectaron muestras de sangre de 407 cerdos en la fase de acabado, provenientes de crianzas porcinas ubicadas en la franja costera del departamento de Lima, Perú. La concordancia de las técnicas diagnósticas y la seroprevalencia correspondiente se evaluaron mediante el índice de Kappa y la prueba de McNemar. Los resultados indicaron que la concordancia entre las pruebas de HAI y ELISA a través del índice de Kappa fue de 26%, considerándose de tipo regular, con valores de 18.7 ± 3.8% por el método de HAI y 14.7 ± 3.4% por el método de ELISA; mientras que no se encontró diferencias significativas mediante la prueba de McNemar, lo cual podría sugerir que ambas técnicas son mutuamente reemplazables. No obstante, se concluye que, como la correlación es regular, no se recomienda su reemplazo.

Palabras clave: porcinos; Toxoplasma gondii; ELISA indirecta; HAI

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ABSTRACT

The aim of the present study was to determine the concordance between the indirect hemagglutination test (HAI) and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect anti-Toxoplasma gondii IgG in the diagnosis of porcine toxoplasmosis. Blood samples were collected from 407 pigs in the finishing phase, from pig farms located in the coastal strip of the department of Lima, Peru. The concordance of the diagnostic techniques and the corresponding seroprevalence were evaluated using the Kappa index and the McNemar test. The results indicated that the concordance between the HAI and ELISA tests through the Kappa index was 26%, considering the regular type, with values of 18.7 ± 3.8% by the HAI method and 14.7 ± 3.4% by the method of ELISA; while no significant differences were found by the McNemar test, which could suggest that both techniques are mutually replaceable. However, it is concluded that, since the correlation is regular, it is not recommended its replacement.

Key words: swine; Toxoplasma gondii; indirect ELISA; HAI

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INTRODUCCIÓN

Toxoplasma gondii es un protozoario intracelular obligado de distribución mundial que tiene a los felinos domésticos y silvestres como hospedadores definitivos y a una amplia gama de vertebrados como hospedadores intermediarios. La ingestión de carne cruda o mal cocida, infectada con quistes tisulares, o el consumo de alimentos y agua contaminados con ooquistes esporulados son las rutas más comunes de infección (López et al., 2005; Dubey y Jones, 2008).

La infección por T. gondii tiene manifestaciones clínicas diversas e inespecíficas, lo que hace difícil precisar el diagnóstico, por lo que se debe tener cuidado con el diagnóstico diferencial (Dubey, 2010). Como en muchas enfermedades infecciosas, sobre todo en aquellas que son clínicamente inaparentes, el diagnóstico se basa en pruebas indirectas como la serología, que consiste en la determinación de anticuerpos específicos contra el parásito (Bastien, 2002). Entre las pruebas serológicas disponibles para el diagnóstico de toxoplasmosis se tiene la Hemaglutinación Indirecta (HAI), el Ensayo de Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA) y la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) (Cortes y Mancera, 2009), la técnica de aglutinación modificada (MAT), considerada como referencia para la validación de otras pruebas serológicas (Klun et al., 2006; Sroka et al., 2011), y la técnica de Sabin-Feldman o Dye Test, conocida como prueba confirmatoria (Joynson y Wreghitt, 2001). Sin embargo, la prueba de Hemaglutinación Indirecta (HAI) es la que se utiliza para el diagnóstico de rutina en clínicas y hospitales veterinarios (Cerro et al., 2009), por ofrecer resultados rápidos y una mayor facilidad de ejecución e interpretación de resultados (Suárez et al., 2002).

Por otro lado, el ELISA ha mostrado claras ventajas sobre otras pruebas, dado que se pueden analizar muchas muestras en forma simultánea con equipos de fácil uso, comparado con la prueba de inmunofluorescencia, y los resultados obtenidos ofrecen mayor confiabilidad que las obtenidas con la hemaglutinación (Dubey, 2010). Además, posee alta sensibilidad y especificidad detectando tanto infecciones recientes como latentes (Steinparzer et al., 2014). Es así que el objetivo del presente estudio fue determinar la concordancia entre las pruebas de HAI y el ELISA para el diagnóstico de Toxoplasma gondii en cerdos.

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se realizó en siete granjas porcinas tecnificadas y en 10 granjas no tecnificadas localizadas en los distritos de Huacho, Huaral, Ventanilla, Villa El Salvador, Lurín y Chilca, todos ellos en la franja costera del departamento de Lima, Perú, entre los meses de enero y marzo de 2014 y 2015. Se realizó el seguimiento de los animales en los camales de beneficio para la posterior toma de muestra de sangre, previo consentimiento informado. El procesamiento de las muestras se llevó a cabo en el Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, distrito de San Borja, Lima.

El tamaño muestral se determinó mediante la fórmula de proporción de poblaciones finitas con 95% de confianza y 5% de precisión (Daniel, 1996). Se utilizó en el cálculo el tamaño de la población porcina de Lima (388 793 animales) (INEI, 2013) y 32.3% como prevalencia referencial (SuárezAranda et al., 2000), lo que dio como resultado un mínimo de 407 muestras. Para el efecto del estudio, se trabajó con 264 cerdos de cinco meses de granjas tecnificadas y con 143 cerdos >7 meses de criaderos no tecnificados, en ambos casos sin distinción de sexo y en etapa de acabado.

Los productores firmaron el Consentimiento Informado previo a la toma de las muestras. Estas fueron tomadas al momento del sacrificio, durante el proceso de degüello, en tubos de boca ancha sin anticoagulante. Se tomó aproximadamente 5-8 ml de muestra de sangre que fueron llevadas al laboratorio donde se obtuvieron los sueros por centrifugación a 1500 rpm durante 5 min, conservándose en viales a -20 ºC hasta su procesamiento y análisis serológico.

Se utilizó el «kit» comercial PrioCHECK Porcine Toxoplasma Ab (Prionics Ag, Suiza), siguiendo las instrucciones de acuerdo con el protocolo del fabricante. El kit posee una sensibilidad de 98.9% y una especificidad de 92.7% (Basso et al., 2013). La lectu-

Para la técnica de hemaglutinación indirecta (HAI) se utilizó un kit comercial (Toxotest) para uso humano, siguiendo las instrucciones de acuerdo con el protocolo del fabricante (Wienner Lab, 2000). El kit posee una sensibilidad de 91.0% y una especificidad de 96.4% en sueros de humanos (Diaz et al., 2001; Dabanch, 2003). Se prepararon diluciones de las muestras de 1:16 a 1:2048, considerándose como positivo títulos iguales o mayores a 1/64, basado en estudios previos (Romero y Sogbe, 2005; Romero et al., 2007). Se siguieron las instrucciones de acuerdo a lo establecido por el fabricante.

Se evaluó el grado de concordancia mediante el índice de Kappa, considerándose la interpretación establecida por Landis y Koch (1977) de 0: pobre; >0-0.2: leve; 0.21-

0.40: regular; 0.41-0.60: moderada; 0.61-0.8: buena; 0.81-1: perfecta. Asimismo, se utilizó la prueba de Mc Nemar para determinar si las pruebas son mutuamente reemplazables.

RESULTADOS

La seroprevalencia de Toxoplasma gondii en cerdos de Lima mediante las técnicas de HAI y ELISA indirecto fue de 18.7± 3.8% (76/407) y de 14.7 ± 3.4% (60/407), respectivamente.

En el Cuadro 1 se presentan los resultados serológicos de los sueros de cerdos mediante las técnicas de ELISA indirecto y HAI, agrupados de acuerdo con su concordancia. La prueba de Kappa arroja un valor de concordancia regular de 0.26, mientras que la prueba de McNemar no detectó diferencia significativa entre las técnicas, ya que el coeficiente calculado fue de 3.28, siendo menor que el de tabla, demostrando que una prueba puede ser reemplazada por la otra, pero con una correlación débil, de allí que no se recomienda.

DISCUSIÓN

El diagnóstico de infección por T. gondii en porcinos se basa usualmente en la detección de anticuerpos específico, habiendo varios kits comerciales (Jiang et al., 2008) con grandes diferencias en sensibilidad y especificidad (Huerta et al., 2006), cuyo uso depende de las facilidades de equipos y reactivos disponibles en el laboratorio.

La técnica de ELISA es una prueba para la detección cualitativa y cuantitativa de anticuerpos IgG contra T. gondii (Romero et al., 1995). Se disponen de varios kits comerciales con diferentes antígenos y puntos de corte (Dubey, 2009), así como niveles de sensibilidad (57.3-65.2%) y especificidad (97.4-99.4%) (Basso et al., 2013; Steinparzer et al., 2014).

La técnica de HAI emplea glóbulos rojos de carnero sensibilizados (Balfour et al., 1982) con antígenos citoplasmáticos y de superficie del parásito para detectar anticuerpos totales (IgG e IgM), incrementando la sensibilidad de la prueba. Por lo tanto, permite la detección precoz de la infección (Wiener Lab, 2000). La técnica presenta una sensibilidad de 29.4% y una especificidad de 98.3% (Dubey et al., 1995) y se viene utilizando en clínicas y hospitales veterinarios (Suárez et al., 2002).

El 26% de coeficiente de concordancia Kappa fue relativamente similar al 36.6% obtenido por Suárez et al. (2002) en cerdos, donde consideraron al ELISA como prueba de referencia; sin embargo, en el presente estudio la prueba de McNemar no demostró significancia, pero dado que el índice Kappa presentó una concordancia regular, indica que estas pruebas no son mutuamente reemplazables.

Las técnicas de HAI y ELISA han venido siendo comparadas con muestras de diferentes especies y agentes infecciosos (Figueiredo et al., 2001), observando ventajas de la técnica HAI sobre el ELISA, pues es una prueba simple y confiable, dado que posee la facilidad de evaluar cada muestra de forma independiente con pequeña cantidad de suero (Suárez et al., 2002). Además, permite detectar el título de anticuerpo tomando la mayor dilución en la cual se observa hemaglutinación franca, utilizando punto de corte de 1:16 (Triolo-Mieses y TraviezoValles, 2006) y 1:64 (Zou et al., 2009).

La técnica de ELISA por su parte presenta ventajas respecto al HAI, pues permite un diagnóstico rápido, con disponibilidad de una gran variedad de kits comerciales que determinan IgM e IgG independientemente, el cual es eficaz para realizar monitoreos de rutina en un hato porcino (Handman et al., 1980; Kasper et al., 1983). Por ejemplo, Lind et al. (1997) encontraron IgM de corta duración (2 semanas) y posteriormente IgG, que se mantuvo durante 3-4 meses. Para el caso del presente estudio, mediante la técnica utilizada se detectó IgG a las 2 semanas posinfección y un incremento de los niveles de anticuerpos a las 11 semanas posteriores.

La técnica de ELISA enfocada en el diagnóstico de toxoplasmosis porcina varía en cuanto a la sensibilidad y especificidad dependiendo del antígeno utilizado. Así, Gamble et al. (2005), utilizando un ELISA comercial de antígeno P30 reportan una sensibilidad de 85.7-88.6% y una especificidad de 94.6- 98.0%, mientras que Basso et al. (2013), utilizando el mismo tipo de kit del presente estudio determinaron una sensibilidad de 88.9% y una especificidad de 92.7%.

CONCLUSIONES

El grado de concordancia en el diagnóstico de toxoplasmosis porcina entre las pruebas de HAI (18.7%) y ELISA (14.7%) mostraron valores de 26.0% para Índice de Kappa y 3.28 para Mc Nemar, demostrándose que ambas pruebas pueden ser reemplazables, pero debido a que la correlación es regular, no se recomienda su reemplazo, por el contrario, ambas pruebas se pueden complementar a fin de obtener un diagnóstico preciso.

 

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Recibido: 13 de marzo de 2018

Aceptado para publicación: 8 de noviembre de 2018