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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

versión impresa ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.30 no.2 Lima abr./jun. 2019

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v30i2.16094 

ARTÍCULOS PRIMARIOS

 

Efecto de células alimentadoras inactivadas de dos segmentos del oviducto en el desarrollo in vitro de embriones bovinos

Effect of inactivated feeder cells of two segments of the oviduct on the in vitro development of bovine embryos

 

Gleni T. Segura1,3, Marigeidy Santiago2, Jenin V. Cortez1, Nilton L. Murga1

1 Laboratorio de Biotecnología Animal, Reproducción y Mejoramiento Genético, Instituto de Investigación en Ganadería y Biotecnología, Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza, Chachapoyas, Perú

2 Facultad de Ingeniería Zootecnista, Agronegocios y Biotecnología, Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza, Chachapoyas, Perú

3 E-mail: glenytatty@gmail.com


RESUMEN

El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de células alimentadoras inactivadas (sistema feeder layer) provenientes de dos segmentos del oviducto bovino (istmo y ámpula) en el desarrollo in vitro de embriones bovinos. Se generaron líneas celulares de segmentos del istmo y ámpula para posteriormente ser inactivadas con mitomicina C (40 µg/ml) para inhibir su capacidad de división y eliminar la competencia por nutrientes con los embriones. Se maduraron in vitro ovocitos bovinos por 24 h y fueron fertilizados por 18 h en cultivo convencional con semen bovino Brangus. Los ovocitos supuestamente fertilizados fueron cultivados por siete días en el sistema feeder layer con células de istmo y ámpula separadamente a una concentración de 1.44 x 105 células/ml. Se obtuvo mejores resultados de producción de embriones bovinos in vitro con células ampulares (280/84; 30%) en comparación con las células del istmo (278/75; 26.9%) y el grupo control (275/73; 26.5%) realizado en un sistema convencional. Se concluye que las células del oviducto pueden cumplir funciones similares a las que cumple el oviducto en el proceso in vivo, mejorando la producción in vitro de embriones.

Palabras clave: mitomicina C; células oviductuales; sistema con capa de alimentación; inactivación celular


ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effect of inactivated feeder cells (feeder layer system) from two segments of the bovine oviduct (isthmus and ampulla) in the in vitro development of bovine embryos. Cell lines from segments of the isthmus and ampulla were generated and subsequently inactivated with mitomycin C (40 µg/ml) to inhibit their ability to divide and eliminate competition for nutrients with embryos. Bovine oocytes were matured in vitro for 24 h and were fertilized for 18 h in conventional culture with Brangus bovine semen. The expected fertilized oocytes were cultured for seven days in the feeder layer system with isthmus and ampulla cells separately at a concentration of 1.44 x 10 5 cells/ml. The best results in the production of in vitro bovine embryos were obtained with ampullary cells (280/84, 30%) in comparison with the isthmus cells (278/75, 26.9%) and the control group (275/73, 26.5%) in a conventional system. It is concluded that the cells of the oviduct can fulfill functions like those that the oviduct fulfills in the in vivo process, improving the in vitro production of embryos.

Key words: mitomycin C; oviductual cells; feeder layer system; cellular inactivation


INTRODUCCIÓN

El cultivo con células alimentadoras, también conocido como sistemas de feeder layer es una idea atractiva de cultivar embriones tempranos en una monocapa de células oviductales o células uterinas. Este concepto supone que la monocapa proporciona algún estímulo específico al desarrollo del embrión o de alguna manera regula el ambiente para el desarrollo (Ellington et al., 1990). También sugiere que las células monocapa en cultivo deberían reflejar la actividad del mismo tipo de célula in vivo (Eyestone y First, 1989).

El uso de células alimentadoras en cultivo de embriones proporciona un estímulo para el desarrollo de los embriones, siendo los más utilizados el cultivo con vesículas extracelulares y células oviductuales (Hamdi, 2013), técnica que ha sido utilizado con células del tracto reproductivo para cultivar embriones in vitro no solo en bovinos sino también en ovinos (Dashti et al., 2016).

Existen estudios con células alimentadoras de oviducto las cuales han sido utilizadas en ovinos y bovinos con el objetivo de mejorar el desarrollo in vitro de los embriones y comprender los mecanismos de apoyo que brindan las células en el desarrollo embrionario (Ellington et al., 1990). El cultivo con células alimentadoras (sistema feeder layer) puede disminuir el estrés oxidativo a través de las funciones químicas benéficas que estas células producen (Mermillod et al., 1993). Es así que el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de células alimentadoras inactivadas provenientes de dos segmentos del oviducto bovino (istmo y ámpula) en el desarrollo in vitro de embriones bovinos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Localización del Estudio

El estudio se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Animal, Reproducción y Mejoramiento Genético del Instituto en Ganadería y Biotecnología, Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza, región Amazonas, Perú.

Recolección del Tejido

La muestra de tejido del istmo y ámpula del oviducto se recolectó del útero de una vaca cruzada Brown Swiss x criollo, mayor a dos partos, en condición corporal 3 y con actividad reproductiva (ciclando). El útero fue retirado luego del beneficio del animal y fue colocado en un recipiente isotérmico con solución salina 0.9% y a temperatura de 3537 °C para su transporte al laboratorio.

Obtención de las células alimentadoras (feeder layer)

Los productos químicos y los medios de cultivo utilizados fueron adquiridos de Sigma Chemical Co. (EEUU) y los materiales de plástico desechable de Nunc (Roskilde, Dinamarca) a menos que se especifique lo contrario.

En el laboratorio se retiró el tejido conectivo de los dos segmentos. Cada extremo del oviducto fue cerrado por una sutura quirúrgica estéril. Se lavó y desinfectó con etanol cada segmento del oviducto. Se retiró la capa externa de cada segmento y la capa interna fue colocada en una placa petri dentro de la cabina de bioseguridad, donde se realizó una digestión mecánica. Luego se procedió a realizar múltiples lavados con buffer fosfato salino (PBS) y antibióticos y se sometió a digestión enzimática por 18 h en 10 ml de colagenasa (1 mg/ml en medio DMEMF12 suplementado con 0.025 mg/ml de estreptomicina y 10% SFB) a 37 °C y con agitación orbital. Luego se agitó vigorosamente para desprender células que aún pudieran encontrarse adheridas al mismo. Se dejó reposar por 3 min y se recuperó el sobrenadante, siendo sembrado en placas petri de 35 mm estériles. El volumen del cultivo se completó a 2 ml con medio DMEM-F12 suplementado con 1 mM de glutamina, 0.2 mM de piruvato, 10 ng/ml de EGF (epidermal growth factor) y 30% de suero fetal bovino (SFB) y fue puesto en una incubadora (CCL-170B-8, ESCO) de CO a 38 °C para el desarrollo de las células.

Congelación de las Células Alimentadoras

Cuando el crecimiento de las células llenó toda la placa de cultivo, se procedió a la identificación de aquellas placas donde las células tuvieron rápida división. Se inicio el proceso de congelación donde se sacó todo el medio de cultivo de las placas con células y se lavó varias veces con PBS, luego se agregó tripsina-EDTA al 0.025% para despegar las células crecidas, y posteriormente se inactivó la tripsina adicionando DMEN F12 suplementado con 10% SFB. Cuando las células se despegaron, todo el contenido fue puesto en tubos de 15 ml y centrifugado por 489 g por 5 min; se cogió el pelet y se colocó en una placa de 60 mm en medio DMEN F12 suplementado con 10% de SFB y 8% de DMSO (dimetil sulfóxido). Luego se colocó a razón de 1 ml en viales Nalgene de 2 ml (Nalgene, Dinamarca) a una concentración de 3x106 células/ml. La congelación se llevó a cabo mediante un gradiente de -1 C°/min, empleando el sistema Mister Frosty (Nalgene, Dinamarca) en el interior de un congelador comercial de -80 °C. Luego de 4 h los viales fueron introducidos a un tanque de nitrógeno líquido (-196 °C).

Recolección de Ovarios

Se recolectaron 20 ovarios por repetición por semana del centro de beneficio de Chachapoyas, Amazonas. Las vacas eran Brown Swiss x criollo, de dos a más partos y con condición corporal de 2.5-4.0. Los ovarios fueron transportados al laboratorio en cloruro de sodio (NaCl) al 0.9% (wt/vol) con 0.025 mg/ml de estreptomicina, temperado a 3537 °C.

Maduración in vitro de Ovocitos (MIV)

Los folículos de 2 a 6 mm fueron aspirados con aguja 18 G acoplada a una jeringa.

El líquido folicular fue colectado en tubos de 15 ml y mantenido por 15 min a 37 °C para sedimentar. Para la búsqueda de los ovocitos se retiró el sedimento y se mezcló con medio de manipulación (TCM-199 suplementado con 4 mM de bicarbonato, 18 mM de Hepes, 10% de SFB y 50 µg/ml de gentamicina).

Se seleccionaron los ovocitos en clasificación 1 y 2, que son aquellos que presentan abundantes células de cúmulos y coloración homogénea del citoplasma (Liebfried y First, 1979; Sato et al., 1990). Para la maduración, se colocaron 25 ovocitos por pocillo por 24 h en una atmósfera humidificada con cionando DMEN F12 suplementado con 10% SFB.

Fecundación in vitro de Ovocitos (FIV)

Los ovocitos madurados fueron juntados en una incubadora por 18 h en una atmosfera humidificada a 38.5 oC y 5% CO con los espermatozoides lavados, seleccionados y capacitados por el método de Percoll (Parrish et al., 1995) de un toro Brangus en medio de fecundación TALP-FIV (Vajta, 2000), suplementado con 2 mM de piruvato de sodio, 50 µg/ml de gentamicina, 0.03 mg/ml de heparina y 3 mg/ml de BSA-FAF.

Inactivación de Células Alimentadoras

Las células del istmo y ámpula fueron descongeladas bajo inmersión en baño maría a 37 °C, y se esperó a tener las células al 90% de confluencia (Figura 1), para ser inactivadas mediante incubación en una atmosfera humidificada a 38.5 oC y 5% CO con 40 µg/ml de mitomicina C (MCC) durante 5 h. Después de la inactivación, se retiró el medio que contenía las placas y las células se lavaron dos veces con PBS, para luego ser disociadas con tripsina-EDTA al 0.025%. Luego se inactivó la tripsina adiadicionando DMEN F12 suplementado con 10% SFB.;

Cultivo de Células Alimentadoras Inactivadas (sistema feeder layer)

Las células despegadas e inactivadas se sembraron en placas de cuatro pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca), a una densidad de 1.44 x 105 células/pocillo (Goméz et al., 2010) en medio DMEN F12. Pasadas las 24 h de cultivo el medio DMEN F12 fue remplazado con el medio SOF base (Vajta et al., 2000) suplementado con 0.044 g/l de piruvato de sodio, 0.039 g/l de L-glutamina, 3.0 mg/ml de suero albúmina bovina (BSA-FAF), 1X de amino ácidos esenciales, 1X de amino ácidos no esenciales, 10 mg/ml de EGF, 0.1 mg/ml de ácido cítrico, 0.5 mg/ml de myo-inositol, 50 µg/ml de gentamicina y 2% de SFB.

Cultivo de Cigotos en el Sistema Feeder Layer

Los presuntos cigotos fueron desnudados por pipeteo y colocados en las placas de cuatro pocillos que contenían las células de istmo y ámpula inactivadas en el medio de cultivo SOF mencionado anteriormente. Luego fueron incubadas a 38.5 °C, 90% de humedad y mezcla de gases (90% N, 5% CO , 5% O ) en bolsas herméticas.

RESULTADOS

Se obtuvieron 500 ovocitos clasificados como 1 y 2 por cada tratamiento, los cuales pasaron por un proceso de maduración y fecundación. La evaluación a las 48 horas no demostró diferencia significativa en el porcentaje de clivaje de embriones (Cuadro 1). No obstante, en el desarrollo in vitro de los embriones (Figura 2; Cuadro 2) se encontró un porcentaje mayor de blastocistos al día 7 con el uso células alimentadoras inactivadas de ámpula en la etapa de cultivo en comparación al cultivo con células alimentadoras inactivadas de istmo y con el grupo control (p<0.05).

DISCUSIÓN

Las células utilizadas como capa alimentadora (feeder layer) son unidades orgánicas que están en constante división y para lo cual consumen gran cantidad de nutrientes del medio de cultivo por lo que es muy importante utilizar un método que detenga el crecimiento de las células, pero que metabólicamente sigan activas. En el presente trabajo se utilizó mitomicina C como aditivo capaz de detener el crecimiento celular (Llames et al., 2015).

Se tenía la idea de que el embrión era el único responsable de su desarrollo; sin embargo, actualmente se conoce que el ambiente que le proporciona el oviducto en el transcurso de su desarrollo tiene fundamental importancia (Watkins et al., 2008), lo cual se puede observar en los resultados del estudio, donde el uso de células que forman parte de la estructura del oviducto (istmo y ámpula) han permitido obtener embriones por encima del promedio (26.5%) del control en un sistema convencional.

La aplicabilidad y beneficios que tiene el uso de células alimentadoras inactivadas en la producción de embriones in vitro en diversas especies es notorio. Dashti et al. (2016) utilizaron células alimentadoras de istmo y ámpula en su cultivo de producción de embriones in vitro en ovinos obteniendo mejores resultados en porcentaje de producción de blastocistos con células de istmo (45.4%) que con el uso de células de ámpula (36.6%), mientras que Hamdi (2013) no encontró diferencia al evaluar células de toda la estructura del oviducto bovino en la producción y calidad de embriones in vitro en bovinos. En el presente estudio, las células alimentadoras de ámpula presentaron un mejor efecto en la producción de embriones in vitro en bovinos (30.0% ± 2.3) que las células del istmo (26.9% ± 2.2)

CONCLUSIONES

La utilización de células del ámpula del oviducto como células alimentadoras en el proceso de producción de embriones in vitro en bovinos aumenta el porcentaje de producción de embriones.

 

Agradecimientos

Los autores agradecen al Instituto de Investigación en Ganadería y Biotecnología de la Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza de Amazonas por autorizar la investigación en los ambientes del Laboratorio de Biotecnología Animal Reproducción y Mejoramiento Genético.

 

Literatura citada

1. Dashti S, Shahneh AZ, Kohram H, Zhandi M, Davachi ND. 2016. Differential inûuence of ovine oviduct ampullary and isthmic derived epithelial cells on in vitro early embryo development and kinetic. Small Ruminant Res 136: 197-201. doi: 10.1016/j.smallrumres.2016.02.007        [ Links ]

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Recibido: 20 de septiembre de 2018

Aceptado para publicación: 12 de febrero de 2019

 

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