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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

versão impressa ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.30 no.2 Lima abr./jun. 2019

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v30i2.16181 

ARTÍCULOS PRIMARIOS

 

Efecto de la quercetina sobre la tasa de desarrollo y la viabilidad de embriones bovinos producidos in vitro

Effect of quercetin on the rate of development and viability of bovine embryos produced in vitro

 

Diana Maturana1,3, Jorge Gómez O.1, Giovanni Restrepo B.2

1 Grupo de Investigación en Biotecnología Animal (GIBA), Facultad de Ciencias Agrarias, Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, Medellín, Colombia

2 Grupo de Investigación en Biotecnología Animal (GIBA), Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Colombia, Medellín, Colombia

3 E-mail: dmmatura@unal.edu.co


RESUMEN

Las tasas de desarrollo y la calidad de los embriones bovinos producidos in vitro son menores que los producidos in vivo, debido al estrés oxidativo al que son sometidos durante su manipulación y las condiciones de cultivo. El objetivo de este estudio fue evaluar la producción, la celularidad y la vitalidad de los blastocistos bovinos producidos in vitro con diferentes concentraciones de quercetina. Un total de 2108 oocitos fueron madurados in vitro en medio 199 con 10% de SFB, 5.0 µg/ml de LH y 0.5 µg/ml de FSH. La fertilización se realizó en medio TALP con 2x106 espermatozoides/ml. Los posibles cigotos fueron cultivados a 38.7 °C con 5% de CO2en medio de cultivo SOF suple-mentado con seis concentraciones de quercetina (1, 5, 10, 15, 20, 50 µM) y como controles se utilizaron el medio SOF sin quercetina y suplementado con DMSO. Se determinaron las tasas de clivaje (día 2) y blastocistos (día 7), así como la celularidad y la viabilidad celular de los blastocistos. Se realizó un análisis de varianza y las medias de los tratamientos se compararon con la prueba de Tukey. Los tratamientos con 1 y 5 µM de quercetina fueron superiores para la tasa de blastocistos (p<0.05). Se observó una reducción en la tasa de clivaje, la tasa de blastocistos y la viabilidad celular para 20 y 50 µM, y se encontró una disminución en la celularidad para 15 µM. La quercetina utilizada a bajas concentraciones durante el cultivo in vitro de embriones bovinos produce un incremento en la tasa de blastocistos, mientras que el uso altas concentraciones de quercetina genera efectos deletéreos en los embriones bovinos.

Palabras clave: antioxidante; estrés oxidativo; fertilización in vitro; radical libre


ABSTRACT

The development rates and the quality of the bovine embryos produced in vitro are lower than those produced in vivo, due to the oxidative stress to which they are subjected during their manipulation and the culture conditions. The aim of this study was to evaluate the production, cellularity and vitality of bovine blastocysts produced in vitro with different concentrations of quercetin. A total of 2108 oocytes were matured in vitro in medium 199 with 10% FBS, 5.0 µg/ml LH and 0.5 µg/ml FSH. Fertilization was carried out in TALP medium with 2x106 spermatozoa/ml. Potential zygotes were cultured at 38.7 °C with5%CO2in SOF culture medium supplemented with six concentrations of quercetin (1, 5, 10, 15, 20, 50 µM) and as controls were used the SOF medium without quercetin and supplemented with DMSO. The rates of cleavage (day 2) and blastocysts (day 7) were determined, as well as the cellularity and cell viability of the blastocysts. An analysis of variance was performed, and the means of the treatments were compared with the Tukey test. Treatments with 1 and 5 µM of quercetin were higher for the blastocyst rate (p<0.05). A reduction in the cleavage rate, the blastocyst rate and cell viability were observed for 20 and 50 µM, and a decrease in cellularity for 15 µM was found. Quercetin used at low concentrations during the in vitro culture of bovine embryos produces an increase in the rate of blastocysts, while the use of high concentrations of quercetin generates deleterious effects in bovine embryos.

Key words: antioxidant; oxidative stress; in vitro fertilization; free radical


INTRODUCCIÓN

La producción de embriones in vitro ha permitido numerosos avances en el mejoramiento genético de los bovinos, y ha sido ampliamente utilizada a nivel mundial con fines investigativos y comerciales. No obstante, entre el 50 y el 70% de los posibles cigotos detienen su desarrollo a los 5-7 días del cultivo in vitro (Zullo et al., 2016). Las bajas tasas de desarrollo embrionario in vitro están asociadas a las subóptimas condiciones de los medios de cultivo, la manipulación excesiva, la concentración de oxígeno y la alta exposición a la luz, que generan un incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs) (Olson y Seidel, 2000; Machado et al., 2011; Merton et al., 2013).

El exceso de EROs conlleva a una condición de estrés oxidativo que puede conducir a daños en el ADN y a la peroxidación de los lípidos, lo cual afecta la viabilidad celular, y podría inducir la muerte programada de las células (Guérin et al., 2001). Por lo tanto, el desbalance de EROs en los cultivos de embriones in vitro está altamente relacionado con la baja la calidad de los blastocistos producidos, que a su vez está directamente relacionado a los bajos porcentajes de preñez (Kuwayama y Leibo, 2008; Caamaño et al., 2015; Zullo et al., 2016).

La adición de moléculas antioxidantes en las diferentes etapas de la producción de embriones, han mostrado un incremento en las tasas de blastocistos; entre estas, la carnitina, el resveratrol y la quercetina (Rahim et al., 2011; Guemra et al., 2013; Salzano et al., 2014; Kang et al., 2016; Truong y Gardner, 2017).

La carnitina es un antioxidante que se ha suplementado durante la maduración in vitro (MIV) de los ovocitos bovinos, mejorando la maduración nuclear y desarrollo de los embriones, pero la molécula no presenta ningún efecto benéfico cuando los embriones son vitrificados (Phongnimitr et al., 2013). Por otro lado, el resveratrol es un flavonoide que aumenta las tasas de blastocistos cuando se suplementa durante la maduración in vitro de oocitos bovinos (Wang et al., 2014; Torres et al., 2016; Kordowitzki et al., 2016; Sovernigo et al., 2017), porcinos (Kwak et al., 2012) y caprinos (Mukherjee et al., 2014). Además, aumenta el desarrollo embrionario durante el cultivo in vitro de embriones (Lee et al., 2010) y la criotolerancia de los blastocistos (Giaretta et al., 2013). Así mismo, Salzano et al. (2014) encontraron que la concentración de 0.5 µM aportó criotolerancia a los embriones, obteniendo mejores resultados en la sobrevivencia a la vitrificación. Sin embargo, las aplicaciones del uso del resveratrol podrían estar limitadas, ya que los precursores que se emplean para su obtención son costosos para aplicaciones industriales (Li et al., 2015), de allí la importancia de evaluar otras moléculas que puedan tener efectos similares o superiores al resveratrol a un menor costo.

Otro flavonoide perteneciente al grupo de los polifenoles que ha sido estudiado es la quercetina. Se han demostrado su eficacia para atrapar radicales libres en cultivos celulares, inclusive siendo superior a los antioxidantes tradicionales como las vitaminas C y E (Gordon y Roedig-Penman, 1998; Ishige et al., 2001; Geetha et al., 2005; Liu et al., 2010), y se le encuentra fácilmente en la naturaleza (Wang et al., 2016). Se han reportado resultados positivos sobre las tasas de maduración y producción de blastocistos al suplementar la quercetina a bajas concentraciones en el medio de maduración en diferentes especies; así, Banihosseini et al. (2018) la utilizaron en concentración de 16 y 30 µM, mejorando la maduración y el desarrollo de embriones murinos. Adicionalmente, Sovernigo et al. (2017) informaron que no hubo diferencia respecto a las tasas de clivaje de oocitos bovinos madurados en medios suplementados con quercetina, vitamina C, cisteamina, carnitina y resveratrol, ni para la eclosión de los blastocistos.

Se dispone de escasos reportes sobre el efecto de la quercetina en la producción in vitro de embriones bovinos. Sin embargo, se conoce que en la fase de maduración in vitro permite un incremento en la tasa de producción de blastocistos, al ser utilizada en concentraciones entre 2 y 10 µM (Guemra et al., 2013). El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de la quercetina sobre la tasa de desarrollo y la viabilidad de embriones bovinos producidos in vitro.

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de Oocitos

Se recolectaron ovarios de hembras bovinas faenadas en el frigorífico de la Central Ganadera S.A de Medellín, Colombia, y transportados durante 30 minutos en solución salina estéril al 0.9% a 35 °C hasta el laboratorio del Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, en la sede de Bello, Antioquía.

Los complejos cúmulus oocitos (COCs) fueron obtenidos mediante la aspiración de folículos con diámetros entre 2 y 6 mm, usando una jeringa de 5 ml y una aguja hipodérmica estéril calibre 18 (González et al., 1992; Coelho et al., 2002; Moraes et al., 2002; Calegari et al., 2012). El líquido folicular fue depositado en tubos estériles de 50 ml, mantenidos en baño maría a 35 °C durante el proceso de aspiración. Los complejos COCs fueron recuperados mediante un filtro de 70 µm (Falcon™, EEUU) y depositados en Solución Buffer Fosfato (PBS) para ser seleccionados y clasificados. Los COCs aptos para la maduración se evaluaron teniendo en cuenta tres parámetros: citoplasma homogéneo, morfología homogénea y mínimo tres capas de células de la granulosa (Leibfried y First, 1979).

Maduración in vitro (MIV)

Los CCOs fueron incubados en gotas de 70 µl de medio de maduración (Gibco 11150-059) suplementado con 0.33 mM de piruvato de sodio (Sigma, EEUU), 1 µg/mL de estradiol (Sigma, EEUU), 10% de suero fetal bovino (SFB) (Sigma), 83.4 µg/ml de amikacina (Genfar®, Colombia), 50 UI/ml LH (Chorulon®), 1 µg/ml de FSH (Bioniche, Canadá). Las gotas fueron cubiertas con aceite mineral (Sigma) e incubadas a 38.7 ºC, 5% de CO2 en aire con 90% de humedad relativa por 24 horas (Guemra et al., 2013).

Fertilización in vitro

Para la fertilización in vitro (FIV) de los COCs previamente madurados se utilizó semen criopreservado de un donante de la raza Blanco Orejinegro. El semen fue descongelado en agua a 37 °C durante 1 minuto. Los espermatozoides móviles fueron seleccionados por un gradiente discontinuo de Percoll® 45% -90% adicionando 250 µl en un tubo de 1.5 ml. El semen fue adicionado en la parte superior del gradiente de Percoll® (Sigma), el cual fue sometido a centrifugación a 800 g por 5 minutos (Eppendorf®, Alemania). El sobrenadante fue retirado y el pellet fue resuspendido en 400 µl de medio Fert-TALP y luego centrifugado por 3 minutos a 400 g (Parrish, 2014).

El medio de FIV fue suplementado con 2 µM de penicilamina (Sigma), 1 µM de hipotaurina (Sigma), 250 µM de epinefrina (Sigma), 20 µg/mL de heparina (Sigma) y 6 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma). Los gametos fueron incubados durante 18 horas en gotas de 60 µl de medio FIV cubiertas con aceite mineral (Sigma), con una concentración de 2x106 espermatozoides/ml (Guemra et al., 2013).

Cultivo in vitro

Pasadas las 18 horas de la fertilización, se retiraron las células del cúmulus por pipeteo y los posibles cigotos fueron transferidos al medio fluido sintético oviductal (SOF) (Holm et al., 1999), el cual fue suplementado con 0.33 mM de piruvato de sodio (Sigma), 3% de aminoácidos esenciales (Sigma), 1% de no esenciales (Sigma), 0.34 mM de tricitrato de sodio (Sigma), 2.7 mM de mioinositol (Sigma) (Holm et al., 1999), 5% de SFB (Gibco, EE.UU), 5 mg/ml de BSA y quercetina (Sigma) diluida en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma) a diferentes concentraciones (1, 5, 10, 15, 20, 50 µM). Como controles se empleó el medio SOF sin antioxidante y SOF con DMSO a una relación 1 µl/ml, debido a que fue el solvente utilizado para diluir el antioxidante.

El cultivo se realizó en gotas de 70 µl cubiertas de aceite mineral. El medio fue mantenido en incubadora a 38.7 ºC y 5% de CO2. Pasadas 48 horas se determinó el porcentaje de división y se realizó el recambio del 50% del medio de cultivo. En el día 6 de desarrollo se realizó un último recambio del 50% del medio de cultivo y en el día 7 se determinaron las tasas de producción de embriones.

Viabilidad de los Embriones

Los blastocistos expandidos fueron transferidos durante 1 minuto a tubos de 0.6 ml que contenían medio SOF con pronasa (5 IU/ml) (Sigma) (Sifer et al., 2006). Fueron transferidos a 50 µl de medio SOF que contenía 5 µg/ml de Hoechst 33258 (Sigma) se incubaron a 37 °C durante 8 minutos. Luego se adicionaron 5 µl de ioduro de propidio (Sigma) para una concentración final de 100 µg/ml y se incubó durante 8 minutos en condiciones de oscuridad. Posteriormente, se lavaron los embriones en 100 µl de medio SOF y se evaluaron mediante la visualización en el microscopio de epifluorescencia E200 con HBO (Nikon Eclipse, EEUU), mediante un filtro UV-2A para las longitudes de onda entre 495/617 nm. Se realizó registro fotográfico de cada embrión y posteriormente se realizó el conteo de células vivas (azules) y muertas (rojas).

Análisis Estadístico

Se realizó un análisis de varianza, para el cual fueron evaluados previamente los supuestos de normalidad mediante la prueba Shapiro-Wilk y la homogeneidad de las varianzas mediante la prueba de Levene. La comparación de las medias se realizó mediante la prueba de Tukey. Todos los análisis se realizaron a través del programa SIGMA STAT (Systat Software, USA), considerando como significativo un valor p<0.05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los valores encontrados para la producción de embriones bovinos in vitro (Cuadro 1) muestran un efecto de la quercetina dependiente de la concentración suplementada. Las dosis mayores afectaron las tasas de división y de blastocistos, aunque esto no se manifestó en el estadio de desarrollo de 4 o más células. Se ha reportado que las bajas dosis de quercetina (2-10 µM) están asociadas con la protección contra las lesiones oxidantes, mientras que las altas dosis tienen un efecto opuesto (Johnson y Loo, 2000; Kang et al., 2013).

Aunque los flavonoides se caracterizan por presentar actividad antioxidante, bajo algunas circunstancias pueden formar un radical aroxilo o de un complejo flavonoide hierro redox, resultando en una autooxidación del radical aroxilo, el cual produce un anión superóxido (O2-) y, este a su vez, genera el radical hidroxilo (OH-), que puede tener efectos mutagénicos y citotóxicos (Hodnick et al., 1988; Hanasaki et al., 1994) inducidos por las altas concentraciones (Laughton et al., 1991; da Silva et al., 2002). Cao et al. (1997) revelaron que la quercetina en presencia de Cu2+ o Fe2+ libres actúa como prooxidante. Esto fue evidente en los resultados del presente estudio y consistente con lo hallado por Yu et al. (2014), quienes encontraron que la quercetina a 50 µM disminuyó significativamente el desarrollo embrionario, actuando como un prooxidante. Entre tanto, Yu et al. (2014) y Sameni et al. (2018) afirman que la quercetina promueve el desarrollo de los embriones de ratón cuando se trabaja a 5 µM.

Cabe señalar que existen pocos reportes sobre el efecto de la quercetina en la producción in vitro de embriones bovinos; sin embargo, este antioxidante ha sido suplementado en la fase de maduración in vitro con éxito relativo (Gemra et al., 2013; Sovernigo et al., 2017). Así, Gemra et al. (2013) encontraron que la suplementación de los medios de maduración con quercetina (2 µM) no mejoró las tasas de maduración nuclear ni de clivaje; mientras que Sovernigo et al. (2017) obtuvieron mayores tasas de producción de blastocistos y una reducción de EROs en los oocitos. La suplementación del medio de maduración con quercetina podría actuar como un mecanismo de defensa contra las EROs y podría contribuir a mantener el sistema glutatión (GSH) (Kovacic y Somanathan, 2010; Jeong y Joo, 2016). Sin embargo, no se ha reportado un incremento en los niveles de GSH utilizando quercetina en el medio de maduración (Gemra et al., 2013; Sovernigo et al., 2017). En cuanto al DMSO usado para disolver la quercetina, no se encontró un efecto significativo en las tasas de producción de blastocistos respecto al control con el medio SOF (Yu et al., 2014; Banihosseini et al., 2018).

Banihosseini et al. (2018) encontraron que las bajas concentraciones de quercetina en los medios de maduración in vitro aumentaron la formación de blastocistos de ratón; de forma similar a lo reportado por Kang et al. (2013) en porcinos. Así mismo, Guemra et al. (2013), informaron un incremento en las tasas de desarrollo cuando los oocitos bovinos fueron cultivados en medios con presencia de quercetina a bajas concentraciones (2-10 µM), mientras que una alta concentración (50 µM) causó un efecto deletéreo. Lo anterior ha sido asociado a su efecto prooxidante o antioxidante, el cual es dependiente de la concentración (Yu et al., 2014). Se ha reportado que las altas concentraciones de EROs pueden generar estrés oxidativo que resulta en la inducción de la apoptosis en varios tipos de células (Bayir et al., 2008); sin embargo, los oocitos que son tratados con quercetina a bajas concentraciones presentan una reducción en los niveles de EROs (Banihosseini et al., 2018; Wang et al., 2017).

Kang et al. (2013) y Banihosseini et al. (2018) no hallaron diferencias en el número de células totales de los blastocistos porcinos producidos in vitro con quercetina, lo cual es similar a los resultados encontrados en esta investigación, donde solo se observó un efecto de la concentración de 15 µM sobre la celularidad y no se observó dicho efecto a concentraciones superiores (20 y 50 µM) (Cuadro 2). Esto muestra que la quercetina es benéfica para la formación de blastocistos e interfiere poco en la celularidad de estos.A diferencia de este resultado, otros antioxidantes como el resveratrol (Lee et al., 2010) y la melatonina (Liang et al., 2017) han mostrado un efecto positivo sobre la celularidad.

Se ha demostrado que la quercetina puede inducir selectivamente la apoptosis en células cancerosas y evitarla en células normales (Liang et al., 2011; Park y Min do, 2011). Esto se ha probado tanto en fetos (Wang et al., 2016) como en blastocistos de ratón producidos in vitro, generando un mayor número de células viables (Yu et al., 2014). Por su parte, Sameni et al. (2018) afirman que la quercetina promueve el desarrollo de los embriones de ratón y reduce la apoptosis en las blastómeras cuando se trabaja a 5 µM. Lo anterior concuerda con los resultados del presente estudio, donde a bajas concentraciones no hay alteraciones en el número de células viables comparadas con el control, mientras que altas concentraciones resultan en un incremento de células muertas (Figuras 1 y 2), habiéndose sugerido que se debe a su efecto antioxidante (Heim et al., 2002). El mecanismo antioxidante de la quercetina se debe a su estructura polifenólica que son bien conocidos por su capacidad de interactuar con las EROs y ERNs mediante la transferencia de electrones (SET) y la transferencia de un átomo de hidrogeno (HAT); en el primer caso se cede un electrón al radical y en el segundo, el antioxidante cede un átomo de hidrógeno que estabiliza el radical (Zapata et al., 2014).

En el presente estudio se encontró que a altas concentraciones de quercetina se genera una reducción de la viabilidad celular en los blastocistos; a su vez, las bajas concentraciones no tienen efecto sobre la proporción de células muertas (Figura 1). En este sentido, otras investigaciones evidencian que la quercetina, al igual que otros antioxidantes, interfiere con la expresión de genes relacionados con la apoptosis y la calidad embrionaria (Bax, Blc-2, TP53, Oct-4, Cx43, IGF-1 y Glut-1 (Elamaran et al., 2012; You et al., 2012; Choi et al., 2013; Mukherjee et al., 2014; Kawashima et al., 2015). Es oportuno recalcar que todos los experimentos corroboran los efectos benéficos sobre la producción y calidad de embriones al suple-mentar la quercetina a bajas concentraciones en la fase de cultivo in vitro. Por lo tanto, sería importante determinar si la suplementación de quercetina durante todo el proceso de producción de embriones in vitro generaría mejores resultados.

CONCLUSIONES

  • La suplementación del medio de cultivo con quercetina a 1 µM y 5 µM genera un incremento en la producción de embriones bovinos in vitro.

  • El uso de bajas concentraciones de quercetina en la fase de cultivo no interfiere con la celularidad y la viabilidad celular de los blastocistos bovinos producidos in vitro.

  • El uso de altas concentraciones de quercetina en la fase de cultivo genera efectos deletéreos sobre la producción in vitro de embriones bovinos.

 

Agradecimientos

Al Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid y la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, por la financiación de esta investigación.

 

LITERATURA CITADA

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Recibido: 9 de noviembre de 2018

Aceptado para publicación: 5 de mayo de 2019

 

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