ARTÍCULOS PRIMARIOS

 

Caracterización molecular ómica de una cepa de Bacillus amyloliquefaciens aislada de la microbiota del paiche Arapaima gigas con actividad antagonista contra bacterias patógenas de peces

Omic molecular characterization of a Bacillus amyloliquefaciens strain isolated from the paiche Arapaima gigas microbiota with antagonistic activity against fish pathogenic bacteria

 

Manuel Feria^1,5, Arnaldo Castañeda¹, Odalis Toledo¹, Deysy Castillo³ Mario Cueva³, Virna Cedeño^2,4

1 Universidad Nacional de Tumbes, Perú

2 Instituto de Investigación Inca’Biotec S.A.C, Tumbes, Perú

3 Cooperativa de Trabajadores BioteCoop, Tumbes, Perú

4 Concepto Azul, Guayaquil, Ecuador

5 E-mail: manuelfezevallos@gmail.com

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RESUMEN

Se analizaron las características de una cepa de Bacillus amyloliquefaciens aislada del intestino de Arapaima gigas, seleccionada por su capacidad para generar inhibición de múltiples bacterias patógenas de peces, mediante el uso de herramientas moleculares como PCR y espectrometría de masas MALDI TOF/TOF. Los resultados mostraron a través de PCR que esta cepa cuenta con genes claves para la generación de péptidos antimicrobianos como bmyB (bacillomycin L synthetase B), fenD (fengycin sintetasa), srfAA (subunidad 1 surfactin sintetasa), bacA (proteína de biosíntesis de bacilysin) e iturin (iturin A). Además, mediante el análisis por espectrometría de masas se detectaron bacteriocinas (plipastatin, gramicidin, fengycin, surfactin), proteínas de fijación al intestino (like-enolase), proteinas transportadoras de péptidos antimicrobianos (ABCtransporters) y proteínas de estimulación del sistema inmunitario como flagelin. También se detectaron proteínas tipo colagenasas, chitinasas y xilosa-isomerasas que contribuyen con el proceso de digestión y asimilación. Todos estos resultados permiten considerar los múltiples beneficios de esta cepa para ser utilizada como probiótico en el cultivo de peces.

Palabras clave: Bacillus amyloliquefaciens; MALDI TOF; probióticos; Arapaima gigas

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ABSTRACT

The characteristics of a strain of Bacillus amyloliquefaciens isolated from the intestine of Arapaima gigas, selected for its ability to generate inhibition of multiple pathogenic bacteria of fishes were analyzed by using molecular tools such as PCR and mass spectrometry MALDI TOF / TOFM. The results showed through PCR that this strain has key genes for the generation of antimicrobial peptides such as bmyB (bacillomycin L synthetase B), fenD (fengycin synthetase), srfAA (subunit 1 surfactin synthetase), bacA (bacilysin biosynthesis protein) and iturin (iturin A). In addition, by mass spectrometry analysis were detected bacteriocins (plipastatin, gramicidin, fengycin, surfactin), intestine binding proteins (like-enolase), antimicrobial peptide transport proteins (ABC-transporters) and immune system stimulation proteins like flagelin. Collagenase, chitinases and xylose-isomerases proteins were also detected that contribute to the digestion and assimilation process. All these results allow to consider the multiple benefits of this strain to be used as a probiotic in fish culture.

Key words: Bacillus amyloliquefaciens; MALDI TOF; probiotic; Arapaima gigas

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INTRODUCCIÓN

La acuicultura se ha convertido en una de las principales actividades productivas a nivel mundial, incluso superando por primera vez en 2014 la contribución de la pesca extractiva para el consumo humano (FAO, 2016). La presión de la demanda obliga a aumentar las densidades de los cultivos, lo que lleva a generar enormes riesgos, en lo que se refiere a la calidad del agua y al manejo del estrés animal. Estas condiciones pueden desencadenar brotes infecciosos que comprometen los niveles productivos (Telli et al., 2014; Banerjee y Ray, 2017).

Las enfermedades causadas por bacterias son las más comunes en el cultivo de peces de agua dulce (Mukherjee y Ghosh, 2016). Convencionalmente, el uso de los antibióticos se elige para controlar las enfermedades que atacan los cultivos, pero esta estrategia se encuentra cuestionada porque se considera una fuente de contaminación ambiental (Ayandiran et al., 2014), afecta a los microorganismos beneficiosos y genera un desequilibrio en el tracto gastrointestinal de los peces (Kesarcodi-Watson et al., 2008). Además, su uso no controlado genera bacterias resistentes a los antibióticos, pudiendo convertirse en un riesgo para la salud pública (Banerjee y Ray, 2017).

Estratégicamente, se propone el uso de probióticos, que se definen como organismos vivos que al ser administrados en cantidades adecuadas confieren beneficios a la salud del huésped (Araya et al., 2002). Estos microorganismos tienen múltiples ventajas para el animal, como promover el crecimiento (Midhun et al., 2017), mejorar la respuesta inmune, aumentar la actividad digestiva (Nayak, 2010), modular la colonización microbiana, controlar enfermedades y mejorar la calidad del agua (Chi et al., 2014).

Entre los géneros bacterianos con mayor atención para la investigación y desarrollo de probióticos, se encuentras especies del género Bacillus (Silva et al., 2015). Entre ellas, la especie Bacillus amyloliquefaciens es un antagonista de amplio espectro (Kaewklom et al., 2013) y tiene la capacidad de producir enzimas con actividad digestiva (Wang et al., 2008).

Actualmente, a través del uso de herramientas genómicas y enfoques dirigidos al análisis funcional, mediante la caracterización de las proteinas (proteómica, MALDI TOF TOF), se pueden identificar determinadas características que contribuyan a la selección de bacterias para su uso como probióticos en la acuicultura (Lippolis et al., 2011; Vinusha et al., 2018).

El objetivo del presente estudio fue conocer las características funcionales de mayor relevancia en una cepa de Bacillus amyloliquefaciens aislada a partir del tracto digestivo de paiche Arapaima gigas, mediante el uso de herramientas como la espectrometría de masas (shotgun MALDI TOF TOF) para conocer las principales proteinas producidas por esta cepa. Además, a través de técnicas como PCR, determinar la presencia de genes clave para la biosíntesis de péptidos antimicrobianos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepa Bacteriana y Condiciones de Cultivo

Bacillus amyloliquefaciens 11CI-2 fue aislada del intestino de Arapaima gigas «paiche» en un estudio previo (Castillo, 2017). La cepa almacenada en caldo soya tripticaseína (TSB) con 18% de glicerol a -20 °C fue subcultivada en medio solido agar de soja tríptico (TSA) a 37 °C durante 18 horas, y posteriormente transferida a caldo TSB a 37 °C en tubos de 1.5 ml, para su posterior utilización en los ensayos.

Actividad Antimicrobiana

Bacillus amyloliquefaciens 11CI-2 fue enfrentada a bacterias patógenas de peces tales como Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Plesiomonas shigelloides, Vibrio sp, Aeromonas veronii, Klebsiella sp, Citrobacter freundii. Se realizaron ensayos de enfrentamiento célula vs. célula, con extracto de proteínas del sobrenadante libre de células de un cultivo de la cepa B. amyloliquefaciens. Los ensayos fueron realizados mediante el método de difusión en agar modificado de Balcázar et al. (2008). El agar se perforó con una pipeta Pasteur estéril, generando un pocillo de 0.6 mm, donde se añadieron 20 µl del cultivo bacteriano o del extracto de proteína del sobrenadante libre de células (dependiendo del ensayo) a las placas previamente inoculadas con las bacterias patógenas. Se determinó la capacidad de inhibición a través de la medición del diámetro de la zona de inhibición. Se consideró como resultado negativo una capacidad de inhibición de 6 mm, como leve de 6 a 11 mm, como moderada entre 11 y 16 mm y como fuerte mayor a 16 mm.

Sensibilidad Antibiótica

La susceptibilidad se evaluó con seis antibióticos comerciales: vancomicina (30 µg), gentamicina (10 µg), eritromicina (15 µg), cloranfenicol (30 µg), amikacina (30 µg), amoxicilina + ácido clavulánico (30 µg). El procedimiento fue adaptado de (Ramesh et al., 2014). Para esto, se inoculó la cepa de B. amyloliquefaciens 11CI-2 (108 UFC/ml) en medio solido agar de soja tríptico (TSA) con un asa de Drigalski; posteriormente se colocaron los discos con antibióticos sobre el medio y se incubaron a 37 °C por 24 horas. La zona de inhibición fue registrada en milímetros (mm).

Actividad Proteolítica

Este ensayo se realizó para demostrar la producción de componentes enzimáticos con actividad proteolítica. En agar Skim Milk (10%) se realizaron orificios de 6 mm de diámetro y se inocularon 30 µl de la cepa bacteriana. Se incubó por 24 horas a 37 °C. La actividad proteolítica se vio revelada en la aparición de zonas claras alrededor de la zona de inhibición.

Análisis Genómico

La cepa bacteriana fue cultivada en caldo soya tripticaseína (TSB) durante 24 horas a 30 °C. Posteriormente se hizo la extracción de ADN con el método de bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) basado en el protocolo de Worden (2009). La amplificación de los genes claves para la biosíntesis de péptidos antimicrobianos (surfactin, bacylisin, bacylomicin, fengycin e iturin A) fue realizada mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de punto final. Para cada reacción se utilizó 2.5 µl de buffer 10X, 1 µl de cloruro de magnesio (MgCl ) a 50 mM, 0.1 unidad de Taq polimerasa recombinante (Gen-On), 0.5 µl de una mezcla de dNTPs a una concentración de 10 mM, 0.6 µl de cada cebador a 15 pmol, en un volumen final de 25 µl y 100 ng de ADN genómico molde. La detección de los principales genes de biosíntesis de péptidos antimicrobianos fue realizada con iniciadores específicos, los cuales son descritos por Mora et al. (2011) y Ramarathnam et al. (2007). Las secuencias elegidas correspondieron a bmyB (bacillomycin L synthetase B), fenD (fengycin sintetasa), ituA (iturin A), srfAA (subunidad 1 surfactin sintetasa), bacA (proteína de biosíntesis de bacilysin). Las condiciones de ciclos para la amplificación de todos los genes fueron las siguientes: 95 °C por 5 min, 35 ciclos de 95 °C por 30 s, temperatura de alineamiento por 45 s y 72 °C por 45 s. Un paso de extensión final a 72 °C por 5 min seguido por uno de conservación a 4 °C. La temperatura de alineamiento fue a 58 °C para bmyB, fenD, srfAA, y bacA, mientras que para ituA fue 55 °C. La amplificación de los genes estudiados se hizo con los cebadores detallados en el Cuadro 1. Los productos obtenidos por PCR fueron secuenciados por la empresa MACROGEN (https://www.macrogenusa.com, Rockville, USA) y las secuencias obtenidas fueron alineadas en la base de datos libre NCBIBLAST.

Extracción de Proteínas Celulares

Las proteínas celulares fueron obtenidas siguiendo las indicaciones de Sharifuzzaman et al. (2011) con algunas modificaciones. El cultivo bacteriano se realizó añadiendo 150 µl de un precultivo de 18 horas a 37 °C de la cepa de Bacillus amyloliquefaciens 11CI-2 en un matraz de 50 ml que contenía 15 ml de caldo TSB y se incubó a 37 °C a 4 g y fue cosechado cuando alcanzó su fase de crecimiento exponencial en 0.D 600 de 1.0. El componente celular fue recuperado mediante centrifugación a 1792 g a 4 °C por 20 min. La extracción de proteínas se realizó con el Kit QIAGEN, 2011, siguiendo las indicaciones del fabricante.

Extracción de Proteínas Extracelulares

Siguiendo el método de Sharifuzzaman et al. (2011) y Shankar et al. (2012) modificado, se extrajeron las proteínas presentes en el sobrenadante de un cultivo de 24 h a 4 g y 37 °C de la cepa de B. amyloliquefaciens 11CI-2 en un matraz de 250 ml que contenía 50 ml de caldo TSB. Los sobrenadantes se separaron de los sedimentos bacterianos mediante centrifugación (1792 g, 15 min, 4 °C) y pasaje a través de un filtro Milipor de 0.22 ìm. Las proteínas de la fracción libre de células se precipitaron mediante la adición de ácido tricloacético (TCA) al 100%, helado (concentración final 10% w/v) y fenil metilsulfonil fluoruro (PMSF), un inhibidor de proteasa a una concentración final de 1 mM. La precipitación se realizó durante la noche a 4 ºC. Los sedimentos de proteína se suspendieron y se lavaron dos veces mediante centrifugación metanol y fueron secados al ambiente. Finalmente, el sedimento se resuspende en agua de grado HPLC con TFA al 0.1% y se almacena a -20 ° C para su posterior uso.

Separación por SDS PAGE y Digestión Enzimática Directa

Las muestras de proteínas, tanto celulares como extracelulares, fueron sometidas a dos procesos. En uno se realizó la separación de las proteínas totales mediante un gel de poliacrilamida (SDSPAGE) al 15% con un campo eléctrico de 90 V por 2-3 horas. Las bandas seleccionadas se cortan manualmente con ayuda de un bisturí estéril, y son sometidas al tratamiento de tripsinización, siguiendo el protocolo de Shevchenko et al. (2007). Por otro lado, los extractos totales de las proteínas celulares y extracelulares fueron además digeridos de manera directa mediante un tratamiento con tripsina, siguiendo el protocolo de Schmidt et al. (2009).

Procesamiento y Análisis de Datos

El análisis de proteínas se obtuvo a partir de un sistema analizador proteómico MALDITOF/TOF (5800, AB SCIEX System). Los espectros fueron captados en modo MS Reflector Positivo con un láser de Nd: YAD de 349 nm de longitud de onda, con una intensidad de laser de 2800 y una velocidad de 600 µm/ segundo y 750 disparos. Para el análisis de doble tiempo de vuelo (TOF/TOF), los precursores fueron acelerados a 8 kV y se seleccionaron en la puerta de entrada de iones. Todos los fragmentos peptídicos generados por la colisión de los precursores en la cámara de disociación inducida (CID) se aceleraron a 15 kV en la fuente 2 y las masas se analizaron después de pasar por el reflector de iones.

El análisis de los datos se realizó de manera automática por el programa 4000 Series Explorer v. 3.5.3 (Applied Biosystem). Todos los datos obtenidos por MS/MS fueron procesados y analizados por el software ProteinPilotTM 4.5, basado en el algoritmo Paragon™ 4.5.0.0 (Matrix Science, Boston, MA), usando el GPS Explorer software v. 3.6, que permite la búsqueda no redundante de proteínas. Para los análisis se consideró las condiciones de alquilación con iodoacetamida y digestión con tripsina. Las bases de datos asociadas al género Bacillus fueron descargados de los repositorios virtuales libres como UniProt (http://www.uniprot.org/) y de la base virtual del Centro Nacional de Información Biotec-nológicaNCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins)

RESULTADOS

Actividad Antimicrobiana

La cepa B. amyloliquefaciens demostró tener capacidad de inhibir la mayoría bacterias patógenas de peces seleccionadas de estudios anteriores y que pertenecen al cepario de bacterias de IncaBiotec S.A.C. La cepa solo no mostró inhibición contra Pseudomonas putida (Cuadro 2.)

Sensibilidad Antibiótica y Actividad Proteolítica

La cepa fue susceptible a todos los antibióticos contra los que fue evaluada. Los antibióticos con mayor inhibición fueron eritromicina y vancomicina (Cuadro 3). Por otro lado, la cepa B. amyloliquefaciens 11CI2 mostró una fuerte capacidad proteolítica, mostrada en los halos claros formados en el medio sólido alrededor del pocillo donde fue inoculada la cepa (19 mm).

Identificación de Genes de Biosíntesis

Se obtuvieron cinco productos correspondientes a los tamaños de ituA (647 bp), bacA (498 bp), bmyB (370 bp), fenD (269 bp), srfAA (200 pb) (Figura 1). Las secuencias analizadas por BLAST obtuvieron más del 90% de cobertura e identidad en la búsqueda de homología con sus respectivos genes de biosíntesis; por lo que se determinó la presencia de genes clave para la producción de péptidos antimicrobianos como iturin A (código accesión GenBank KP967589.1), bacillomicina L sintetasa B (bmyB) (código accesión GenBank KY111359.1), la proteína de biosíntesis de bacilisina (bacA) (código accesión GenBank MF098752.1), fengycin sintetasa (fenD) (código accesión GenBank KP453873.1) y la subunidad 1 de la surfactin sintetasa (srfAA) (código accesión GenBank KY051728.1).

Análisis MALDI TOF-TOF

Mediante espectrometría de masas doble TOF se pudo identificar secuencias de las proteínas claves involucradas en funciones como la biosíntesis de péptidos antimicrobianos no ribosomales del grupo de lipopéptidos antimicrobianos como surfactin, bacillomycin D, fengycin e iturin; del grupo de policétidos antibióticos como bacillaene y el dipeptido antimicrobiano bacylisin; y de bacteriocinas como gramicidin, bacteriocina tipo streptolysin (SagD) y lantibióticos como subtilin (Cuadros 4 y 5). Por otro lado, se encontraron además proteínas relacionadas a otras características como la capacidad de la cepa bacteriana a fijarse en el epitelio intestinal como enolase, y proteina de capa S (S-layer). También se encontraron proteínas relacionadas a la digestión de chitina (chitinasa), colagenasa y del aprovechamiento de azucares a través de xilosa isomerasa (Cuadros 4 y 5).

La esporulación es un mecanismo clave para que una bacteria sea considerada para su uso en la alimentación animal. Mediante el uso de la espectrometría de masas MALDI TOF TOF se reconocieron proteínas claves para realizar procesos celulares como la proteína de esporulación YqfD, YabP y proteína R del estado V. Además, se pudieron detectar componentes esenciales para el microorganismo y su supervivencia en ambientes ácidos como bacillithiol (Cuadros 4 y 5). Así mismo, con esta técnica se pudieron identificar moléculas claves en la estimulación del sistema inmunitario del hospedero como flagellin, así como una sintasa de óxido nítrico, la cual funciona como una principal molécula de respuesta celular y protección de la mucosa intestinal. Además, se identificaron secuencias correspondientes a proteínas cristalinas, clave para la inhibición de insectos patógenos (Cuadros 4 y 5).

DISCUSIÓN

Diversas características son tomadas en cuenta para la selección de una cepa como probiótica. Entre estas, la capacidad para generar inhibición contra bacterias patógenas (Thankappan et al. 2015; Nandi et al., 2017). El aislado bacteriano identificado como Bacillus amyloliquefaciens 11CI-2 fue probado in vitro contra bacterias patógenas de importancia en la piscultura, como Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeuruginosa y Citrobacter freundii (Eissa et al., 2010; Thanigaivel et al., 2015; Thankappan et al., 2015), demostrando tener capacidad antagónica frente a todas las cepas patógenas.

La sensibilidad frente a antibióticos es una característica resaltante en cepas probióticas, pues evita la posible transferencia de genes de resistencia entre cepas probióticas y patógenas que podrían habitar al hospedero; considerando además a la cadena alimentaria como una vía de transferencia de bacterias patógenas antibióticos resistentes a los humanos (do Vale Pereira et al., 2017). Los resultados demostraron que la cepa Bacillus amyloliquefaciens 11CI-2 es susceptible a todos los antibióticos contra la que fue probada, semejante a lo mostrado por Kadaikunnan et al. (2015).

Los componentes antimicrobianos producidos por bacterias son abundantes y diversos, y la capacidad de producirlos es considerada una característica principal cuando se trata de selección de bacterias probióticas. Estas bacteriocinas favorecen el establecimiento del probiótico dentro del tracto intestinal, la inhibición de cepas patógenas invasoras y la modulación de la microbiota hospedera. La determinación de los genes claves para la biosíntesis de bacteriocinas como surfactin, fengycin, bacyllomicin, bacylisin e iturin A, mediante la prueba de PCR, al igual que en los estudios con Bacillus spp de Koumoutsi et al. (2004), Ramarathnam et al. (2007) y Athukorala et al. (2009) permitieron confirmar la presencia de estos genes en la cepa aislada B. amyloliquefaciens 11CI-2.

La capacidad de las bacterias para producir enzimas proteolíticas es muy importante desde el punto de vista nutricional. Estas proteasas potencian la digestión, y están involucradas en los mecanismos de defensa contra agentes patógenos (Thankappan et al., 2015); por lo tanto, mediante el crecimiento sobre agar Skim Milk se demostró la capacidad proteolítica de la cepa B. amyloliquefaciens 11CI-2 coincidiendo con múltiples antecedentes sobre la evaluación de bacterias del género Bacillus (Bairagi et al., 2002; Ray et al., 2012; Banerjee et al., 2013; Nandi et al. 2017; Kavitha et al., 2018).

Actualmente, las comunidades bacterianas que componen la microbiota asociada al tracto digestivo de animales y humanos se encuentra bastante estudiada a partir de herramientas de secuenciamiento masivo del ADN (metagenómica); sin embargo, la información obtenida no ayuda a caracterizar la funcionalidad microbiana (Vinusha et al., 2018), la cual podría ser descrita haciendo uso de herramientas de análisis de transcritos o de proteínas; así pues, el análisis proteómico de cepas potencialmente probióticas puede dar información sobre los potenciales beneficios de una cepa de este tipo (Ruíz et al., 2016). En esta investigación, a través del uso de la espectrometría de masas MALDI TOF TOF se identificaron las características de mayor importancia en las cepas potencialmente probióticas a través del análisis de su proteoma celular y extracelular.

Debido a la producción de péptidos con capacidad de inhibir cepas patógenas, diversos trabajos se han centrado en la investigación de cepas de Bacillus capaces de sintetizar lipopéptidos antimicrobianos y antivirales como surfactin (Athukorala et al., 2009; Sajitha et al., 2016); iturin y fengycin (Kim et al., 2010), bacillomycin D (Ramarathnam et al., 2007) y el dipéptido bacilysin (Wu et al., 2014). Aparte de estos péptidos identificados por MALDI TOF TOF y PCR, se pudo demostrar la presencia de proteínas claves para la biosíntesis de bacilleane, gramicidin y subtilin, componentes antimicrobianos previamente descritos (Moldenhauer et al. 2007; Liou et al. 2015; Chen et al., 2018).

Otras moléculas fueron además detectadas mediante espectrometría de masas como las sintasas de óxido nítrico, moléculas clave para la generación de óxido nítrico (NO), el cual está relacionado a la activación del sistema inmunitario a través de la regulación de la comunicación de células de defensa del huésped (Wang et al., 2010). Así mismo, se identificó flagellin, una proteína capaz de incrementar la producción de péptidos defensinas (β-defensin 2) (Schlee et al., 2007).

La capacidad de aprovechar y degradar componentes como la chitina, es una característica muy útil para mejorar el proceso de digestión y asimilación en peces, a través de su microbiota asociada (Dutta et al., 2015). En el presente estudio, se logró identificar mediante proteómica la presencia de enzimas chitinasas de la cepa de B. amyloliquefaciens 11 CI-2. Además, se identificaron enzimas colagenasas y xilosa isomerasa, involucradas en la nutrición de los peces (Ray et al., 2012).

Para que una bacteria con características probióticas pueda prosperar en un ambiente difícil como el tracto digestivo, es necesario que resista las condiciones de estrés, y para esto, mecanismos como la esporulación son muy importantes (Elshaghabee et al., 2017). En el presente estudio se identificaron proteínas claves para la esporulación como YqfD (Wemhoff y Meinhardt, 2013) y proteínas claves para la biosíntesis de bacillithiol y bacilliredoxin, que sirven como mecanismos de resistencia a estrés ácido (Gaballa et al., 2010; Chi et al., 2011; Chandrangsu et al., 2017). Por otro lado, la cepa probiótica debe poseer características que le permitan fijarse al tracto digestivo y prosperar, como por ejemplo proteínas de anclaje y comunicación celular (Castaldo et al., 2009), para interactuar con proteínas como la fibronectina de la matriz extracellular y proteínas de capa S (S-layer) (Sánchez et al., 2009).Ambas proteínas pudieron ser identificadas en este estudio a través del análisis por MALDI TOF TOF.

CONCLUSIONES

Los datos obtenidos de la cepa Bacillus amyloliquefaciens 11 CI-2 aislada de tracto digestivo de paiche Arapaima gigas, ponen en evidencia las buenas características de esta cepa para ser considerada como probiótico para su empleo en la acuicultura de peces.

 

Agradecimiento

«Círculo de Investigación en biotecnología molecular para el desarrollo y sostenibilidad de los sectores acuícolas del Perú». Código 132-2015.

 

Literatura citada

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Recibido: 6 de noviembre de 2018

Aceptado para publicación: 2 de mayo de 2019