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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

versión impresa ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.30 no.3 Lima jul./set 2019

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v30i3.15400 

ARTÍCULOS PRIMARIOS

 

Caracterización de la secuencia del gen de la proteín transportadora de péptidos (PepT1) en alevines de paiche Arapaima gigas

Characterization of the gene sequence of the peptide transport protein (PepT1) in paiche Arapaima gigas fingerlings

 

Odalis E. Toledo1,2,4, Arnaldo E. Castañeda1,2, Manuel A. Feria1,2, Pedro Masías2, Mario Cueva3, Emmerik Motte2

1 Facultad de Pesquería, Universidad Nacional de Tumbes, Tumbes, Perú

2 Empresa de Formación e Investigación en Biotecnología Molecular, INCABIOTEC SAC, Tumbes, Perú

3 Cooperativa de Trabajadores Biotecoop, Tumbes, Perú

4 E-mail: Odat68@gmail.com


RESUMEN

El objetivo del estudio fue caracterizar el PepT1 del paiche Arapaima gigas mediante herramientas genómicas y proteómicas. Se realizó un análisis transcriptómico y proteómico a partir de secciones del intestino, bazo, hígado y riñón de alevines. El análisis transcriptómico permitió obtener dos secuencias consenso de 357 y 459 pb. Ambos fragmentos presentaron un alto grado de homología (78 y 80%), principalmente con secuencias de nucleótidos codificantes del PepT1 de Scleropages formosus del mismo Orden que el paiche. El análisis proteómico por espectrometría de doble masa MALDI TOF/TOF permitió identificar quince secuencias peptídicas del PepT1 en paiche. Como conclusión se logró caracterizar parcialmente el PepT1 en el intestino del paiche, las cuales podrán ser usadas para posteriores estudios sobre la evaluación de su expresión.

Palabras clave: Arapaima gigas; proteína transportadora de péptido; PepT1; proteómica; espectrometría de masas; MALDI TOF/TOF


ABSTRACT

The aim of this study was to characterize the PepT1 of pirarucu Arapaima gigas through genomic and proteomic tools. A transcriptomic and proteomic analysis was made from sections of the intestine, spleen, liver and kidney of fingerlings. The transcriptomic analysis allowed obtaining two consensus sequences of 357 and 459 bp. Both fragments showed a high degree of homology (78 and 80%), mainly with nucleotide sequences coding for the PepT1 of Scleropages formosus of the same Order as A. gigas. The proteomic analysis by double mass spectrometry MALDI TOF/TOF allowed to identify 15 peptide sequences of PepT1 in pirarucu. In conclusion, PepT1 was partially characterized in the intestine of pirarucu, which could be used for further studies on the evaluation of its expression.

Key words: Arapaima gigas; peptide transporter; PepT1; proteomic; mass spectrometry; MALDI TOF/TOF.


INTRODUCCIÓN

El paiche Arapaima gigas (Cuvier, 1829), es una especie importante de la ictiofauna amazónica que pertenece a la familia Osteoglossidae. Se caracteriza por su elevada tasa de crecimiento (10-15 kg por año) y excelente sabor de su carne (Rebaza et al., 2010), convirtiéndose en una especie con gran potencial en la acuicultura peruana. No obstante, una de las principales limitantes para su producción sostenible e intensiva es la nutrición (Oeda et al., 2015), de allí que se realizan estudios sobre la tasa de ingestión y digestión para el desarrollo y formulación de dietas, utilizando fuentes alternas de nutrientes (DIDIT, 2017).

Los peces, en especial los alevinos, requieren de altas cantidades de proteínas que, asimiladas de manera eficiente una vez reducidas a dipéptidos y tripéptidos, son empleados para su crecimiento y fuente de energía (Gatlin et al., 2007; Verri et al., 2011; Liu et al., 2013). Las proteínas son sometidas a un proceso de digestión en el estómago, cuyos productos ingresan al intestino delgado para ser degradados por las enzima s pancreáticas generando productos como aminoácidos, oligopéptidos absorbibles y ditri péptidos (Kiela y Grishan, 2016), que son llevados por proteínas transportadores de péptidos (Verri et al., 2011) a través de la membrana celular de los enterocitos (Gilbert et al., 2008).

El péptido transportador 1 (PepT1), categorizado como miembro de la familia 15, portadoras de soluto A1 (SLC15A1), es el principal conductor de nutrientes debido a su transporte no selectivo y alta capacidad de función para tri y di péptidos a partir del lumen intestinal hacia el interior de los enterocitos (Segura et al., 2010). El PepT1 se localiza principalmente en el borde de cepillo de las células epiteliales del intestino (Wang et al., 2017), posee un tamaño de aproximadamente 700 aminoácidos (2100 nucleótidos) en vertebrados superiores, mientras que en la mayoría de los vertebrados inferiores es usualmente más grande (Ostaszewska et al., 2010). Sin embargo, la secuencia de aminoácidos como de nucleótidos son altamente conservadas en comparación con los vertebrados superiores (Ronnestad et al., 2014). Además, posee 12 dominios transmembrana, con los terminales carboxilo y amino en el sitio citoplasmático (Daniel, 2004), y dos isoformas: PepT1a y PepT1b (Bucking y Schulte, 2012).

El PepT1 se expresa principalmente en el intestino anterior (Ronnestad et al., 2007; Bakke et al., 2010), pero también ha sido detectado en otros tejidos como branquias, cerebro, corazón, hígado, bazo y riñón en niveles muy bajos (Wang, 2017). Además, es regulada por una variedad de hormonas como factores de crecimiento epidermal, ritmo diurno y principalmente por el contenido de proteína en la dieta (Liu et al., 2013). Estudios sobre el Pept1 se han dirigido principalmente a su secuencia, estructura, función, expresión, lugar de distribución (tejido/órgano), y factores ambientales en diferentes variedades de especies de peces (Bakke et al., 2010), tales como Anguilla anguilla (Storelli et al., 1989; Thamotharan et al., 1996), pez zebra Danio rerio (Verri et al., 2003), carpa común Cyprinus carpio (Ostaszewska et al., 2009), salmón del atlántico Salmo salar (Ronnestad et al., 2010) y trucha Oncorhynchus mykiss (Ostaszewska et al., 2010). Sin embargo, hasta la fecha, no existe investigaciones sobre la caracterización del PepT1 en el tracto gastrointestinal del paiche A. gigas.

Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue caracterizar molecularmente la proteína transportadora de péptidos (PepT1) del intestino de paiche A. gigas mediante técnicas genómicas y proteómicas, para generar una base de datos para posteriores estudios sobre la regulación de su expresión, y el potencial en la formulación de alimentos para el paiche.

MATERIALES Y MÉTODOS

Alineamiento de Secuencias y Diseño de Cebadores

Se recopilaron 16 secuencias de ADNc del PepT1 de teleósteos evolutivamente cercanos con el paiche (Cuadro 1), a partir de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/). La homología entre secuencias se analizó mediante Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) y el alineamiento múltiple mediante el programa Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/Tolls/msa/clustalw2/). A partir de la secuencia conservada se realizó el diseño de los iniciadores degenerados (Cuadro 2), los cuales fueron sintetizados por la empresa Integrated DNA Technologies (IDT, USA).

Muestras y Preparación de Tejidos

Se utilizaron 15 alevines de paiche de aproximadamente 15 cm de longitud, obtenidos de una empresa local, ubicada en el departamento de Tumbes, Perú. Los peces fueron eutanasiados, previa sedación con eugenol (Acuestrol®) en solución al 1% del stock. Se realizó una apertura en la cavidad abdominal y se hizo un raspado del epitelio intestinal de las regiones anterior, medio y posterior. Además, se colectaron muestras de riñón, hígado y bazo (<0.5 cm). Los tejidos fueron preservados en RNAlater (Ambion, Austin, TX, USA) y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis.

Extracción de ARN Total y Síntesis de ADNc

La extracción de ARN total de los tejidos se realizó con el kit GeneJET RNA Purification (Thermo Fisher Scientific, USA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La cadena de ADNc fue sintetizada utilizan do el kit Reverdt Aid TM Reverse Transcriptase (Fermentas®) en presencia del iniciador Oligo dT18 en una reacción de 20 µl, siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante y sujeto a tratamiento con DNase (DNase I, Thermo Fisher Scientific).

Optimización de PCR para Iniciadores Degenerados

El ADNc fue amplificado en volúmenes de 25 µl, conteniendo 0.04 Unidades de Hot Start Taq DNA polimerasa (Thermo Fischer Scientific), solución de tampón de la polimerasa a 1X, 2 mM de MgCl, 0.2 mM de cada dNTPs, 0.6 y 1.2 µM para los iniciadores degenerados y el control interno 18S rRNA, respectivamente, ADNc y agua libre de nucleasas (AUP). Se determinó la temperatura de hibridación óptima para cada juego de iniciadores de acuerdo con las temperaturas de fusión (melting) (Cuadro 3) y los productos amplificados fueron separados por migración electroforética en gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio y sumergido en una solución TAE 1X, para ser revelado en un transluminador. Los productos amplificados fueron secuenciados por la empresa Macrogen (USA).

Análisis in silico

Las secuencias de nucleótidos se analizaron con el programa CodonCode Aligner. Las secuencias de aminoácidos fueron predichas utilizando lo programas ExPASy Translate Tool (http://web.expasy.org/translate/).

Extracción de Proteínas y Migración en Gel de Poliacrilamida

En la extracción de proteínas intestinales se utilizó el reactivo Trizol® (Invitrogen, Carlsbad, USA), siguiendo el protocolo del fabricante. Las proteínas extraídas fueron separadas por electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y policrilamida (SDS–PAGE) mediante un sistema vertical mini OmniPAGE(Cleaver Scientific®, Wrwickshire, UK) durante 3 h a 90v al 12% de gel.

Purificación y Digestión de Péptidos

Las bandas fueron extraídas y digeridas siguiendo el protocolo descrito por Shevchenko et. al. (2007) modificado. Las muestras fueron hidratadas con agua grado HPLC con TFA y se les adicionó el mismo volumen de matriz R-cyano-4 hydroxycynnamic (á-CHCA, Sigma Aldrich) (10 mg/ml) (V/V), se homogenizaron cuidadosamente y fueron colocadas en el spot de la Opti TOF® placa MALDI.

Análisis por MALDI TOF/TOF

La identificación de los péptidos se realizó con un espectrómetro de masas MALDI TO F/T OF 5800 (Applied Bi osys tems, SCIEX) en modo ion reflector positivo, con una intensidad de láser Nd:YAG de λ a 335 nm, frecuencia 200 Hz, 750 disparos por espectro y analizados dentro de un rango de masas entre 800 a 4000 m/z. Los péptidos obtenidos del procesamiento por doble fragmentación (MS/MS) fueron analizados mediante el software ProteinPilot 4.0. Las secuencias obtenidas fueron alineadas utilizando la base de dato libre NCBI Blast a través de la plataforma protien blast.

RESULTADOS

PCR del PepT1 de Paiche

Todas las temperaturas de hibridación y los ciclos térmicos utilizados resultaron en productos del tamaño esperado para cada juego de iniciadores, excepto el último iniciador (Cuadro 2). Se observaron bandas definidas de 200 pb para los iniciadores controles 18S ARNr F y 18S ARNr R (Figura 1a). Se observaron bandas definidas de 697 pb para los iniciadores degenerados PepT1 F3 y PepT1 R1 en todas las temperaturas hibridación probadas (Figura 1b). También se observó hibridación para los iniciadores degenerados PepT1 F2 y PepT1 R3 mostrando un producto de 914 pb (Figura 1c).

Identificación del PepT1 en Tejidos

Se observaron bandas definidas correspondientes a productos de 914 pb, que fueron amplificados a partir del aislamiento de ARNm del intestino anterior, medio y posterior. No hubo presencia del producto en bazo, hígado y riñón (Figura 2).

Análisis Bioinformático de las Secuencias

Los fragmentos de ADNc del PepT1 del paiche fueron secuenciados, analizados y traducidos en sus secuencias de aminoácidos potenciales. Se determinaron dos secuencias consenso de tamaño de 357 pb (118 aa) y 459 pb (152 aa), como se muestra en la Figura 3.

Las secuencias parciales de nucleótidos exhibieron una alta similitud de secuencia con el PepT 1 del S cleropagesfor mosus (GenBank XM_018729534.1). En particular, el primer fragmento del gen de ADNc del PepT1 que exhibió un 84% de similitud con el sfPepT1, y de aproximadamente 78% de similitud con los demás teleósteos. Similarmente, el segundo fragmento exhibió un 73% de similitud con el sfPepT1. Además, las secuencias de aminoácidos predichas a partir de los fragmentos exhibieron una similitud de 81% con la secuencia de aminoácido del sfPepT1 (Cuadro 4).

Identificación por MALDI TOF/TOF PepT1

El análisis por MALDI TOF/TOF mostró un total de 15 secuencias correspondientes al Pept1, en particular las secuencias IRNIKFGDVVAKPEEGANAIR, NVIISYGNETTNELLNVMGK y TYEIFKDIKTKPEEGANAIR por el nivel de identidad 100% y un valor de E. de 3 e-12, al ser comparada con la secuencia de Poecilia reticulata, Pelodiscus sinensis y Paralichthys olivaceus, respectivamente, de la base de datos de Protein BLAST. Los resultados resumidos se presentan en el Cuadro 5.

DISCUSIÓN

La proteína transportadora de péptidos (PepT1) es responsable de la absorción de aminoácidos y oligopéptidos en el intestino, siendo importante en el crecimiento de peces (Verri et al., 2011; Romano et al., 2014); además de ser confirmada como marcador del metabolismo, especialmente de las proteínas (Liu, 2014), habiendo sido identificada en varias especies; sin embargo, su presencia en el paiche A. gigas era desconocida. En el presente estudio se logró identificar por primera vez las secuencias nucleotídicas parciales de la proteína transportadora PepT1 del intestino de esta especie.

En el presente estudio, se optimizaron los iniciadores degenerados PepT1 F3, PepT1 R1 y PepT1 F2, PepT1 R3, apreciándose bandas definidas a todas las temperaturas probadas. Esto se explica porque las temperaturas escogidas se encontraban 5 °C por encima o debajo de la temperatura de fusión (Tm). Así mismo, se sabe que temperaturas muy altas causan un mal alineamiento entre iniciadores provocando poco ADN amplificado y temperaturas muy bajas causan la amplificación de ADN inespecífico (Sambrook y Russell, 2001). Por otro lado, se consideró el uso de 18S ARNr como control interno para asegurar la correcta extracción de ARN y PCR de la muestra y así evitar los falsos negativos. Estudios indican que entre los controles internos más utilizados se encuentran el EFA, B-actina, GAPDH y 18 S ARNr siendo este último el menos variable (Fernandes et al., 2008; Su et al., 2011).

Se determinó la presencia del ARN mensajero del PepT1 en intestino (anterior, medio y posterior) del paiche evidenciada en bandas del tamaño de 914 pb; sin embargo, no se identificó en riñón, hígado y bazo. Resultados similares fueron presentados por Verri et al. (2011), quienes indican que la distribución del PepT1 en peces teleósteos se da principalmente en el intestino y en menor grado en riñón, hígado, bazo y otros órganos o tejidos, pudiendo diferir significativamente de un grupo de peces a otro. Además, se puede observar una disminución de intensidad de bandas a lo largo del segmento del intestino (del anterior al posterior), pudiendo diferir con otros estudios que indican que la expresión del PepT1 disminuye a lo largo del segmento proximal al distal del lumen intestinal, representando la diferencia entre los segmentos en la absorción de proteínas (Shen et al., 2001; Terova et al., 2009; Ostaszewska et al., 2010). Sin embargo, estudios cuantitativos basados en qPCR en tiempo real son necesarios para completar el estudio.

Las secuencias consenso del fragmento 1 y 2 mostraron una identidad con la sec u enc i a d e l AR Nm del P ep T 1 de l Scleropages formosus de 84 y 73%, respectivamente. Esto demuestra una alta similitud de nucleótidos con el paiche, confirmando de esta manera su parentesco familiar Osteoglossidae. Además, estos datos constituyen una primera evidencia de la presencia del producto de ARNm relacionado con el PepT1 en la mucosa intestinal en el paiche.

La proteómica busca estudiar las proteínas totales presentes en una célula, tejido o fluido corporal en un momento dado, ya sea por abundancia, actividad, estructura, estado de modificación postraduccional o de otro tipo (Kusman et al., 2006; Wright et al., 2011). Los hallazgos del presente estudio a través de la espectrometría de masas MALDI TOF/ TOF confirmaron la presencia de la proteína transportadora de péptidos (PepT1) al obtener secuencias peptídicas homólogas al PepT1 de varias especies de peces. Esta técnica fue utilizada por Zhang et al. (2016) quienes identificaron proteínas diferenciales en las vellosidades y criptas del intestino entre ratones knockout y wildtype para el PepT1. Por otro lado, Cueva (2016) utilizó esta herramienta, la que le permitió identificar neurohormonas involucradas en la reproducción, así como identificación de proteínas asociadas a la inmunidad y estrés en paiche, abriendo la vía para futuros trabajos de caracterización de otras proteínas de interés.

CONCLUSIONES

  • Se logró identificar y caracterizar parcialmente la proteína transportadora de péptidos PepT1 en el intestino de paiche A. gigas.

  • La identificación del pept1 mediante la espectrometría de masas MALDI TOF/ TOF puede ser una buena alternativa a los métodos tradicionales, ya que es sensible, y su alta precisión en la medición de las masas y la secuenciación masiva de péptidos reduce los problemas de identificación de proteínas y péptidos.

 

Agradecimientos

Los autores agradecen a la empresa Acuicultura de Huaura S.A.C por brindar el material biológico. Al MSc Max Salvatierra Alor por el apoyo brindado. Circulo de investigación en biotecnología molecular para el desarrollo y la sostenibilidad de los sectores acuícolas del Perú (132-2015-FONDECYT.

 

LITERATURA CITADA

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Recibido: 2 de noviembre de 2018

Aceptado para publicación: 28 de mayo de 2019.

 

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