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Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú

versión impresa ISSN 1609-9117

Rev. investig. vet. Perú vol.30 no.3 Lima jul./set 2019

http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v30i3.15353 

ARTÍCULOS PRIMARIOS

 

Determinación de linfocitos T CD4, CD8 y Tγδ en la infección experimental con Brucella ovis

Determination of T CD4, CD8 and Tγδ lymphocytes in experimental infection with Brucella ovis

 

Víctor Manuel Sánchez-Parra1,2, Edgardo Soriano-Vargas1, Ruy Ortiz-Rodríguez2, Esvieta Tenorio Borroto1, Valente Velázquez-Ordoñez1, Martín Talavera-Rojas1, Jorge Acosta-Dibarrat1,3

1 Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma del Estado de México, México.

2 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Michoacán, México.

3 E-mail: jpacostad@uaemex.mx


RESUMEN

El objetivo de este estudio fue determinar la distribución sanguínea de linfocitos T CD4, CD8, LT γδ (WC1) en carneros infectados experimentalmente con Brucella ovis. Se utilizaron 18 carneros de 1 a 4 años y libres de B. ovis distribuidos en tres grupos: Control (n=6); Inoculado en las mucosas ocular y prepucial (n=6); Inoculados vía endovenosa (n=6). Se realizó el seguimiento serológico desde el día de la inoculación hasta el 189 dPI (día pos-inoculación). Se inmunotipificaron las poblaciones de linfocitos CD4 y CD8 a los 120, 150 y 189 y de WC1 (linfocitos Tγδ) a los 120 dPI por citometría de flujo. Los carneros, a partir del tercer dPI comenzaron a seroconvertir; a los 21 y 28 dPI todos los animales de los grupos inoculados por vía endovenosa y mucosa, respectivamente, resultaron positivos; asimismo, el 50% de los animales de los grupos desafiados se presentaron como positivos o sospechosos a la prueba de ELISA a los 189 dPI. Se encontraron diferencias en las Medias de Intensidad de Fluorescencia (MIF) de los linfocitos CD8 entre el grupo control (1027.4) y el grupo inoculado por vía endovenosa (499.6) a los 120 dPI (p<0.05) y en las MIF de los linfocitos CD4 entre grupos a los 189 dPI (p<0.05). Las poblaciones linfocitarias T γδ (WC1) presentaron diferencias en MIF entre el grupo control y los grupos inoculados a los 120 dPI (p<0.05). Los resultados indican que B. ovis puede modular la respuesta inmune del hospedero, que los linfocitos CD4 y CD8 son importantes para la defensa del hospedero ante esta infección, y que las poblaciones de CD4 como de CD8 pueden fluctuar durante el periodo de infección por B. ovis. Así mismo, la participación de los linfocitos T γδ podría ser un factor importante en el control de la infección causada por B. ovis.

Palabras clave: carneros; epididimitis ovina; Brucella ovis; linfocitos T; ELISA; citometría de flujo


ABSTRACT

The objective of this study was to determine the blood distribution of CD4, CD8, and T γδ lymphocytes (WC1) in rams experimentally infected with Brucella ovis. Eighteen rams from 1 to 4 years old and free from B. ovis were distributed in three groups: Control (n=6); Inoculated in the ocular and preputial mucosa (n=6); Inoculated intravenously (n=6). Serological follow-up was carried out from the day of inoculation until 189 dPI (post-inoculation day). CD4 and CD8 lymphocyte populations were immunotyped at 120, 150 and 189 and WC1 (Tγδ lymphocytes) at 120 dPI by flow cytometry. The rams, from the third dIP began to seroconvert; at 21 and 28 dPI all animals of the inoculated intravenously and in the mucosa groups, respectively, were positive; likewise, 50% of the animals of the challenged groups were presented as positive or suspect to the ELISA test at 189 dPI. Differences were found in the Mean Fluorescence Intensity (MFI) of the CD8 lymphocytes between the control group (1027.4) and the group inoculated intravenously (499.6) at 120 dPI (p<0.05) and in the MFI of the lymphocytes CD4 between groups at 189 dPI (p<0.05). The T γδ lymphocyte populations (WC1) presented differences in MFI between the control group and the groups inoculated at 120 dPI (p<0.05). The results indicated that B. ovis can modulate host immune response, that CD4 and CD8 lymphocytes are important for host defence against this infection, and that populations of CD4 and CD8 can fluctuate during the period of B. ovis infection. Besides, the participation of T γδ lymphocytes could be an important factor in the control of the infection caused by B. ovis.

Key words: ovine epididymitis; Brucella ovis; AGID; ELISA; flow cytometry


INTRODUCCIÓN

La epididimitis causada por Brucella ovis (B. ovis) es una enfermedad contagiosa de transmisión venérea que causa falla reproductiva (Moustacas et al., 2013; Costa et al., 2016), y se caracteriza por producir epididimitis, subfertilidad e infertilidad en carel lipopolisacárido rugoso (LPS-R) y las proteínas de membrana externa (PME) (Jaques et al., 1992; Bowden et al., 1995). Por otro lado, estudios experimentales demostraron que la inmunidad humoral es tan importante como la inmunidad celular en la defensa contra la brucelosis, aunque se desconoce las células implicadas en la respuesta (Estein et al., 2004). El predominio de los isotipos IgG neros (Ovis aries) (Galindo et al., 2009b; e IgG en ratón permitiría inferir que B. ovis Ridler et al., 2014). En los carneros, las lesiones crónicas causadas por B. ovis se restringen al aparato genital, específicamente al epidídimo y eventualmente testículos y glándulas asociadas al aparato reproductor (Xavier et al., 2010).

El carácter intracelular facultativo de Brucella condiciona la respuesta inmune del hospedador. Se trat a de una r espuest a inmunitaria mixta, de tipo humoral y celular. La respuesta inmunitaria humoral a B. ovis se encuentra dirigida principalmente contra induce la población de linfocitos T colaboradores del tipo 1 (LTh1) productores de interferón γ (Galindo et al., 2009a; Praud et al., 2012).

Las células T CD4 se describen generalmente como células «auxiliares». Tienen un papel importante en el control y regulación del sistema inmune colaborando en la activación de las células B y en la generación de células T CD8 citotóxicas (Allen y Maizels, 1997; Cunnusamy et al., 2010). La heterogeneidad de las células T se describió por primera vez hace dos décadas con la descripción de las células TH1 y TH2 (Issuree et al., 2017; Cobbold et al., 2018). Las células TH1 están involucradas en la defensa del huésped contra patógenos intracelulares y células tumorales produciendo altos niveles de IFN-γ, TNF-α e IL-2. Las células TH2 son responsables de coordinar la inmunidad humoral e inflamación eosinofílica y están involucradas en la defensa del huésped contra parásitos extracelulares, secretando IL4, IL-5, IL-10 y IL-13. Nuevos subconjuntos (TH9, TH22, TH17, THFH, NKT, células Treg) han sido descritos confirmando la heterogeneidad de la familia de células T CD4 (Mucida y Cheroutre, 2010; Hawkins et al., 2013). Varios estudios en ratones y humanos han reportado un potencial citotóxico de las células T CD4 (van der Veken et al., 2005).

Aunque la inmunidad innata es capaz de controlar las brucellas, la inmunidad específica es necesaria para montar una fuerte respuesta inmune en etapas tardías de la infección (Baldwin y Goenka, 2006). Se ha descrito ampliamente que la respuesta TH1 mediadas por IFN-γ son esenciales para el aclaramiento del patógeno. De hecho, IFN-γ producido por células T CD4 y las células T γδ han demostrado activar las propiedades bactericidas en macrófagos para dificultar la supervivencia intrahuésped de la Brucella, mientras que IFN-γ producido por células T CD8 y la inmunidad humoral relacionada con las células B tienen roles modestos contra la infección por Brucella en ratones (Skyberg et al., 2011; Vitry et al., 2012). En otros estudios se demostró que los isotipos de

Con respecto a la distribución de los linfocitos T γδ, se considera que su proporción con respecto a otros linfocitos es reducida en los órganos linfoides; sin embargo, aumentan su proporción en la piel y superficies mucosas, lo que sugiere que tienen un papel importante en la vigilancia y repuesta inmediata a los patógenos invasores (Dudal et al., 2006; Plattner y Hostetter, 2011; Acosta-Dibarrat et al., 2014, 2016). Los linfocitos T γδ representan entre 1 y 10% de los linfocitos T circulantes en humanos adultos y ratones. En el caso de los ovinos es del 17% y en bovinos adultos entre 10 y 25%, aunque pueden llegar al 40% en terneros jóvenes (Plattner y Hostetter, 2011; Ni et al., 2012). Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue caracterizar la distribución en sangre de linfocitos T CD4, CD8, LT γδ (WC1) en carneros con infección experimental crónica con Brucella ovis por vía endovenosa y por mucosa.

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se realizó en el Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal de la Universidad Autónoma del estado de México (UAEM) (40°24´59,87" N), entre los meses de marzo y noviembre de 2012. El estudio fue aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UAEM.

Animales

Se emplearon 18 carneros de las razas anticuerpos tipo TH1, tales como IgG IgG Columbia, Romanov y Pelibuey, con edad opsonizan la Brucella para facilitar la fagocitosis y la liberación bacteriana en compartimentos endocíticos degradativos (Goenka et al., 2011). En los seres humanos, las células T CD4 productoras de IFN-γ, las células T CD8 y las células T γδ han sido implicadas en el control de la brucelosis (Bessoles et al., 2011; Cannella et al., 2012).

entre 1 y 4 años. Los carneros procedían de un establecimiento libre de B. ovis. Se constató que los animales no presentaran signos de epididimitis mediante el examen clínico. Además, se les tomó muestras para el análisis serológico de immunodifusión en gel de agar (IGDA) y ELISA, así como cultivo bacteriológico del semen y del lavado prepucial, dando resultados negativos en todos los casos. Los animales fueron alimentados ad libitum con heno de avena (Avena sativa) y alimento comercial (14% de proteína cruda).

Los carneros se distribuyeron aleatoriamente en tres grupos (n= 6): Grupo 1: control n egat ivo, se le administróinstilación conjuntival y prepucial de 0.5 ml de solución salina al 0.9% (SS); Grupo 2: inoculación en mucosas: instilación de B. ovis en la mucosa conjuntival y prepucial con 0.5 ml de inóculo con una concentración de 3.9x109 UFC (unidades formadoras de colonias) en ambas mucosas; Grupo 3: vía intravenosa, 1 ml del inóculo en la vena yugular a la misma concentración. La instilación en conjuntiva se realizó en el ojo izquierdo, mientras que para la administración prepucial se colocó el inóculo o la SS usando una jeringa sin aguja y posterior masaje con la abertura prepucial cerrada.

Inóculo de Desafío

Se inocularon placas de agar sangre con la cepa de campo B. ovis 01Zac-INIFAP obtenida del epidídimo de un carnero con epididimitis en el estado de Zacatecas, México. Se incubaron a 37 °C durante 48 h, en una atmósfera con 10% de CO . Se cosecharon con SS. Al inóculo se le realizó conteo de UFC (Miles et al., 1938) y se estandarizó a una concentración de 3.9x109 UFC/ml.

Muestreo

Se colectaron muestras de sueros y de semen de todos los carneros para realizar pruebas serológicas de ELISA y detectar B. ovis por PCR durante seis meses (días 0, 3, 7, 13, 21, 28, 42, 56, 70, 80, 120, 150 y 189).

Las muestras de sangre (5 ml), se obtuvieron en tubos estériles (BD Franklin Lake NJ, USA), se separó el suero por centrifugación (Becton Dickinson Clay Adams, USA) y se conservaron a -80 °C (Thermo Fisher Scientific/ Revco, ULT1786-3-A40, USA).

Se tomaron 4-5 ml de muestras de sangre a los carneros para realizar la fenotipificación de CD4 y CD8 a los 120, 150 y 189 días y de WC1 (linfocitos Tγδ) a los 120 días del desafío. Las muestras se llevaron al laboratorio y se mantuvieron a 4 °C hasta su procesamiento dentro de las 12 h posteriores a la extracción utilizando citometría de flujo.

Prueba de ELISA

Se utilizó el kit de ELISA (CHEKIT Brucella ovis, IDEXX) para detección de anticuerpos de B. ovis en suero, siguiendo las recomendaciones del fabricante. El kit posee placas de 96 pozos sensibilizadas con el antígeno, sueros controles positivo y negativo, solución tampón para lavado y la dilución de los sueros (anticuerpo anti-IgG ovina conjugado con peroxidasa), sustrato y solución de paro de la reacción.

Inmunofenotipificación de Poblaciones Linfocitarias

Se obtuvieron 500 µl de sangre periférica que se diluyeron en 500 µl de PBS-BSA (1:1). La separación de los linfocitos se hizo empleando 3 ml de Lymphoprep (Stemcell, Canadá) a 4 °C. El anillo obtenido se centrifugó a 80 g durante 20 minutos. El tapón linfocitario fue suspendido en 2 ml de PBS-BCA para su lavado. Las células leucocitarias fueron suspendidas en 1000 µl de PBS-BSA a 4 °C. Para el marcaje se tomó 150 µl de la muestra y se adicionó 50 µl de los anticuerpos monoclonales (CD4 Alexa Fluor, CD8 PE, WC 1 F ITC , Labo rat ori o S ero tec ) c on reactividad para ovino (Navarro et al., 1996). Esto se repitió en cada uno de los muestreos de los carneros de los tres grupos.

Análisis Estadístico

El análisis de las poblaciones (medido en Medias de Intensidad de Fluorescencia – MIF) de los linfocitos durante la fase experimental se realizó a través de la metodología de mediciones repetidas utilizando para el modelo de efectos fijos y las diferencias entre grupos y tiempo se obtuvieron mediante la prueba de medias de mínimos cuadrados a un α=0.05 (Littell et al., 1998). Se empleó el software InfoStat.

RESULTADOS

Serología

Las Figuras 1 y 2 muestran los resultados de las pruebas serológicas para los grupos con inoculación experimental. Los animales del grupo control resultaron negativos durante todo el desarrollo del experimento. Se observó una respuesta de seroconversión a partir del tercer dPI, resultando positivos todos los animales de los grupos intravenoso y de mucosas a los 21 y 28 días. Hubo una disminución de la seropositividad a los 56 y 80 dPI para los carneros de la vía mucosas y endovenosa (66 y 50% de seropositividad, respectivamente). Al final del experimento (189 dPI), el 50% de los animales de los grupos desafiados se presentaron como positivos o sospechosos a la prueba de ELISA.

El Cuadro 1 muestra las diferencias en la comparación de MIF a los 120 dPI entre el grupo control y el grupo vía endovenosa para CD4, encontrándose valores de p=0.03, con rangos de 509.4 para el grupo control y de 604.7 para el endovenoso. Lo mismo ocurrió en los carneros del grupo control (1027.4) y el de vía endovenosa (499.6) para CD8 (p<0.05). Por otro lado, no se encontraron diferencias por efecto de grupo sobre las poblaciones de linfocitos CD4 ni CD8 a los 150 días.

En cuanto a las MIF a los 189 días posinfección para CD4 y CD8, se encontraron diferencias entre los carneros del grupo control y el endovenoso (p<0.05), no así para el grupo control y el mucosal. Así mismo, se encontraron diferencias entre los grupos mucosal y endovenoso para CD4 a los 189 días pos-infección (p<0.05), en tanto que no se encontró diferencia significativa para CD8 entre los grupos en ese periodo.

Se encontraron diferencias en las MIF entre tiempos de infección a los 120, 150 y 189 dPI en el grupo control (p<0.05) en el caso de CD4, pero en CD8 solo se observaron diferencias significativas (p<0.05) entre los días 120 y 189 dPI (Cuadro 2). Por otro lado, se encontraron diferencias en el grupo mucosal, tanto para CD4 como para CD8, entre el grupo control y los grupos mucosal y endovenoso (p<0.05). En el grupo endovenoso se encontró diferencia significativa (p<0.05) por efecto de tiempo entre los grupos control y mucosal entre los 120 dPI y los 150 y 189 dPI tanto para CD4 como para CD8 (p<0.05).

Las poblaciones linfocitarias T γδ también fueron marcadas con WC1 a los 120 dPI, habiéndose encontrado diferencia significativa entre el grupo control y el grupo mucosal (p<0.05), mientras que entre los carneros del grupo control y el endovenoso no existió diferencia por efecto de grupo a los
120 días pos-infección (Cuadro 3).

En la Figura 3 se muestra la inmunofenotipificación de linfocitos T γδ en carneros a los 120 dPI. Se observa la positividad de los CD8 en el cuadrante inferior derecho y la positividad de los linfocitos T γδ en el cuadrante izquierdo superior. Se destaca una similitud en el número de linfocitos T γδ para ambas vías de infección, de allí que no hubiera diferencias significativas a los 120 dPI en las MIF de estas poblaciones entre las dos vías de inoculación.

La Figura 4 muestra los porcentajes de poblaciones linfocitarias que mostraron positividad a los marcadores CD4-Alexa flúor y CD8-Pe a los 120, 150 y 189 dPI. Se observa que 23% de la población linfocitaria a los 120 dPI de la inoculación a través de las mucosas corresponde a linfocitos CD4, mientras que el 15% corresponde a linfocitos CD8. En el caso de la inoculación por vía endovenosa, el 15% corresponde a linfocitos CD4 y el 11% a linfocitos CD8. A los 150 dPI, los linfocitos CD4 del grupo inoculado a través de las mucosas representa el 19% de la población linfocitaria y los linfocitos CD8 representan el 14%; en tanto que el 14% corresponde a CD4 y 7% a linfocitos CD8 en el grupo inoculado vía endovenosa. A los 189 dPI, la población de linfocitos CD4 y CD8 de carneros infectados a través de las mucosas representan el 15 y 20%, respectivamente, en tanto que las poblaciones CD4 y CD8 de los carneros infectados vía endovenosa representan 18 y 12%, respectivamente.

En términos generales, se observa que con el transcurso del tiempo disminuyen las poblaciones de linfocitos CD4 de los carneros infectados por las mucosas; sin embargo, se observó un ligero aumento entre el día 120 al 189 en la población de CD8. Por otro lado, el comportamiento de los linfocitos CD4 y CD8 en carnero sin oculados por vía endovenosa fue más variable.

DISCUSIÓN

Las bacterias del género Brucella se multiplican dentro de los macrófagos del hospedador, lo que le permite evadir la respuesta inmune y complica el diagnóstico, ya que exhiben una gran variabilidad en la presentación de antígenos como en sus propiedades inmunomodul adoras (Baldwi n y Goenka, 2006). Silva et al. (2013) trabajaron con IGDA encontrando respuesta positiva en todos los animales a los 30 días de la infección, tal y como ocurrió en el presente trabajo En forma similar, encontraron 50% de positividad en los carneros a los 168 días de la infección, siendo similar al resultado de 50% a los 189 dPI en ambos grupos inoculados de este estudio.

Las proteínas de membrana de las bacterias del género Brucella son antígenos potencialmente inmunogénicos que inducen repuesta inmune humoral y celular en ovinos (Cassataro et al., 2005) y tal como ocurre en otras infecciones causada por microorganismos intracelulares, tanto la participación de linfocitos CD4 y CD8 como la respuesta de anticuerpos median la inmunidad adquirida (Arranz-Solís et al., 2016).

La protección contra la brucelosis depende principalmente de la inmunidad mediada por células tales como los macrófagos, células dendríticas y linfocitos T, tanto CD4 como CD8 (Cassataro et al., 2005). El IFN-γ que es secretado por CD4 regula la actividad de los macrófagos, mientras que los linfocitos CD8 causan lisis en las células infectadas por las brucellas (Koch et al., 2012).

Al parecer, la participación de los linfocitos CD4 y CD8 puede variar dependiendo del transcurso de la infección y la modulación de la respuesta inmune acorde a la función de los linfocitos. Los CD4 demandan la repetición de la exposición de los antígenos para la proliferación y diferenciación de las células efectoras productoras de citoquinas (Bajénoff et al., 2002). Por otro lado, está demostrada la importancia de los linfocitos CD8 al producir un efecto citotóxico en células infectadas por virus (Sánchez-Cordón et al., 2015) y otros microorganismos intracelulares (Arranz-Solís et al., 2016).

En este trabajo se encontraron diferencias en las MIF de las poblaciones linfocitarias CD8 del grupo control con los grupos inoculados en diferentes días pos-infección, lo que demuestra que la participación de CD4 y CD8 en los procesos crónicos de B. ovis puede ser determinante para el control de la infección (Díaz et al., 2013; Costa et al., 2016).

En el caso de infección por B. abortus, los linfocitos CD4 participan en el control y regulación del sistema inmune dependiendo de los perfiles de secreción de citoquinas, tanto proinflamatorios como antiinflamatorios (Martirosyan et al., 2013; Issuree et al., 2017). Con base a esto, se podría deducir que la fluctuación observada en este trabajo sea causada por l os difer ent es perfi l es de citoquinas presentes en el tiempo que dura la infección; en tanto que la participación de CD8, al ser citotóxica, tendría menor variación.

En este trabajo se observaron diferencias en las MIF a los 120 dPI en linfocitos T γδ, lo cual demuestra su participación en esta infección, tal como se ha reportado en humanos para otras brucellas (van der Veken et al., 2005, Skendros et al., 2011). Estas poblaciones son importantes para el control de la infección con B. ovis en carneros donde el porcentaje de los linfocitos T γδ es mayor al 15% (Skyberg et al., 2011). De acuerdo con lo reportado por otros autores, se deben realizar investigaciones adicionales para dilucidar el comportamiento de estos linfocitos.

CONCLUSIONES

  • Brucella ovis puede modular la respuesta inmune del hospedero, donde los linfocitos CD4 y CD8 son importantes para la defensa del hospedero ante este tipo de infección

  • Las poblaciones de CD4 y CD8 pueden fluctuar a lo largo de la infección por B. ovis.

  • La participación de los linfocitos T γδ podría ser un factor importante en el control de la infección causada por B. ovis.

Agradecimientos

Este trabajo de investigación fue financiado por el proyecto PROMEP/103.5/10/4368 y por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), bajo el Programa de Consolidación Institucional de Grupos de Investigación. Retención Ref: 09-01.117071. Los autores agradecen al Dr. Efren Dia Aparicio del CENID Microbiología México por el suministro de la cepa de Brucella ovis.

 

LITERATURA CITADA

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Recibido: 16 de octubre de 2018

Aceptado para publicación: 3 de julio de 2019

 

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