COMUNICACIÓN

 

Rhodococcus equi virulento aislado de potrillos Fina Sangre de Carrera en Chile

Virulent Rhodococcus equi isolated from thoroughbred foals in Chile

 

Jorge C. Lohse^1,2,5, Enrique Paredes², Danilo Vargas³, Shinji Takai⁴

1 Escuela de Ciencias Veterinarias, Universidad Viña del Mar, Viña del Mar, Chile

2 Instituto de Patología Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

3 Facultad de Ciencias Agropecuarias, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Pedro de Valdivia, Santiago, Chile.

4 School of Veterinary Medicine, Kitasato University, Towada, Aomori, Japan.

5 E-mail: lohse.j@gmail.com

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RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue establecer el diagnóstico y aislado de variantes virulentas de la cepa Rhodococcus equi y su asociación con trastornos respiratorios, digestivos o de ambos en potrillos Fina Sangre de Carrera. Se obtuvo muestras de sangre de 86 ejemplares entre 1 y 6 meses de edad con presencia de signos clínicos respiratorios y digestivos entre 2006 y 2008 en nueve haras de la Región Metropolitana, Chile. Todas las muestras se procesaron y analizaron mediante PCR para detección de presencia de R. equi y sus proteínas asociadas a la virulencia (Vap) (A, C, D, E, F, G, H). El 41.9% de los potrillos fueron positivos a R. equi. Los factores de virulencia detectados en potrillos con trastornos respiratorios fueron vapA, vapC y vapG en el 5.8% de la población muestreada, con valores de asociación de Spearman de r=0.885; r=0.976; r=0.885, respectivamente. No se identificaron variantes virulentas de R. equi en los potrillos con signos clínicos digestivos.

Palabras clave: Rhodococcus equi; potros; Vap; bronconeumonía

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ABSTRACT

The aim of this study was to establish the diagnosis and isolation of virulent variants of Rhodococcus equi strains and their association with respiratory and digestive disorders or both in Thoroughbred foals. Blood samples were collected from 86 foals ranging 1 to 6 months of age with presence of respiratory and digestive clinical signs between 2006 and 2008 in nine farms of the Metropolitan Region, Chile. All samples were processed and analysed by PCR to detect the presence of R. equi and its virulence-associated proteins (Vap) (A, C, D, E, F, G, H). Results showed that 41.9% of the foals were positive to R. equi. The virulence factors detected in foals with respiratory disorders were vapA, vapC and vapG in 5.8% of the sampled population, with Spearman’s association values of r = 0.885; r = 0.976; r = 0.885 respectively. No virulent variants of R.equi were identified in foals with digestive disorders.

Key words: Rhodococcus equi; foals; Vap; bronchopneumonia

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INTRODUCCIÓN

Rodococosis es una enfermedad causada por Rhodococcus equi, que provoca bronconeumonía aguda o crónica y enteritis en potrillos, siendo una de las mayores causas de morbilidad y mortalidad en potrillos (Ainsworth et al.,1997; Sellon et al., 2000; Meijer y Prescott, 2004; Son et al., 2006; Chhabra et al., 2015; Gressler et al., 2018). R. equi es una bacteria facultativa grampositiva, pleomorfa y patógeno intracelular facultativo de macrófagos y habitante saprofito del suelo, aerobio estricto, con pocos requerimientos para su crecimiento y desarrollo (McQueen et al., 2015). La infección por R. equi también se describe en otras especies (Bertone, 1998), y en el humano se asocia a neumonías, mayormente en pacientes inmunocomprometidos (Byrne et al., 2001). Las principales vías de infección son la inhalación (partículas de polvo) y la ingestión del organismo (Hondalus, 1997; Leadon et al., 2007).

A diferencia de la mayoría de los R. equi aislados del medioambiente, aquellos aislados de potrillos con neumonía poseen un plásmido que codifica una proteína altamente inmunogénica y lipomodificada asociada a virulencia (Vap), (Takai et al., 2000; Byrne et al., 2001; Valero-Rello et al., 2015). El genoma de R. equi posee un total 5 043 170 pb, contiene ADN cromosómico genéticamente estable y un plásmido de virulencia de 80 a 90 kb, que es el principal determinante de la patogenicidad (Letek et al., 2010; Giguère et al., 2011). La virulencia de R. equi se basa en la capacidad del organismo para replicarse en macrófagos, que depende de su capacidad para interferir con la maduración endosomal después de la fagocitosis y para prevenir la acidificación de la vacuola en la que reside (Hondalous y Mosser, 1994; Toyooka et al., 2005).

Este plásmido presenta una isla de patogenicidad adquirida (PAI), que le confiere capacidad de infectar macrófagos (Hondalus y Mosser, 1994; Giguère et al., 1999; Takai et al., 2000; Coulson et al., 2015). En vap PAI existe un conjunto de genes homólogos que codifican para una familia de proteínas de Vap asociados estrechamente, designados como VapA, VapC, VapD, VapE, VapG, and VapH. También contiene un número de genes no-vap, en particular el operón vir albergando dos reguladores (virR y virS) que activan la expresión de la PAI (Byrne et al., 2001). Adicionalmente hay tres pseudogenes vapF, vapI and vapX. Se desconoce el rol de estos genes adicionales Vap y si codifican proteínas con funciones superpuestas o redundantes (Okoko et al., 2015). El vapA se considera esencial en la patogénesis de la rodococosis (Valero-Rello et al., 2015) y se describe como una proteína inmunodominante en los aislados clínicos (Takai et al., 1991a,b; Tan et al., 1995).

Actualmente, muchos criaderos con alta prevalencia de neumonía por R. equi examinan a los potrillos utilizando técnicas como el recuento de glóbulos blancos, determinación de la concentración plasmática de fibrinógeno, radiografía y ultrasonido de tórax para poder detectar casos subclínicos (Giguère et al., 2003; Vener et al., 2012). El diagnóstico definitivo de rodococosis es a través del cultivo bacteriológico y la amplificación de los genes vap por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en aspirados traqueobronqueales (ATB) de potrillos con signos clínicos de tracto respiratorio inferior, o evidencia citológica de inflamación séptica de vías aéreas y/o evidencia radiológica o de ultrasonido de bronconeumonía (Sellon et al., 2001; Giguère et al., 2011).

El ensayo de PCR multiplex para la familia del gen de vap ha permitido la identificación y caracterización de aislados virulentos en una reacción simple en un solo paso (Chhabra et al., 2015). La formulación de una vacuna efectiva contra la infección por R. equi se encuentra aún en proceso. Actualmente, el uso de una vacuna oral viva ha generado resultados prometedores in vivo, al igual que vectores bacterianos en modelo murino (Dawson et al., 2010; Giles et al., 2015). La inmunidad celular mediada es considerada crucial para superar una infección causada por este patógeno (Giles et al., 2015).

En Chile se ha aislado la bacteria y se le ha diagnosticado por PCR en equinos (Paredes et al., 2000; Miranda, 2003; Márquez, 2006). El presente estudio tuvo como objetivo identificar cepas virulentas de R. equi mediante PCR, así como determinar la asociación entre cepas de variantes virulentas y signos clínicos respiratorios, digestivos o ambos en potrillos Fina Sangre de Carrera en la zona central de Chile.

MATERIALES Y MÉTODOS

Este estudio fue realizado entre los años 2006 y 2008. Se colectaron muestras de sangre de 86 potrillos Fina Sangre de Carrera (FSC), entre 1 y 6 meses de edad, pertenecientes a nueve haras de la Región Metropolitana, Chile. El criterio de inclusión fue la presencia de signos clínicos respiratorios, gastrointestinales o de ambos. Las muestras de sangre fueron obtenidas por punción de la vena yugular utilizando tubos EDTA K Vacutainer® y almacenadas a 4 °C hasta su procesamiento. La extracción de ADN, a partir de muestras de sangre, se efectuó según lo descrito por Hoos y Paabo (1993). La cuantificación del ADN extraído de las bacterias se efectuó mediante un espectofotómetro (UV-VIS, Agilent Technologies®), por absorción a 260 y 280 nm, donde una unidad de densidad óptica equivale a 50 µg/ml de ADN de doble hebra (Sambroock et al., 1989). Para establecer el Índice de Pureza (IP) del ADN se utilizaron los cocientes de absorbancia (DO) a 260 y 280 nm, según lo descrito por Sambrook et al. (1989): IP = DO a 260 nm / DO a 280 nm.

La mezcla de reacción que se utilizó en la identificación de R. equi desde muestras biológicas, es la descrita por Miranda (2003) y el programa de termociclado fue el descrito por Takai et al. (1995). La estandarización de PCR se efectuó según lo descrito por Miranda (2003). La resolución de los productos de amplificación (amplicones) se realizó por electroforesis en gel de agarosa (1% p/v) teñido con bromuro de etidio (0.005 µg/ml) en tampón de corrida TBE (0.09M tris-borato; 0.002M EDTA, pH 8.0). La observación de las bandas de ADN amplificado se efectuó por medio de un transiluminador de luz ultravioleta (50 watts, Vilber Lourmat®, Francia) y los resultados se registraron por fotografías con cámara Olympus® N° C-5060 para su posterior interpretación. La confirmación del genoma de R. equi se efectuó por purificación y posterior secuenciación del ADN amplificado.

Además, se utilizaron los cebadores empleados por Byrne et al. (2001) para R. equi obtenidos del plásmido virulento ATCC 33701 al igual que para la variante virulenta vapA. Los cebadores desde vapC al vapH fueron preparados por la empresa Invitrogen (Cuadro 1). La cuantificación del ADN se efectuó según procedimiento descrito por Sambrook et al. (1989). El programa de termociclación que se utilizó es el descrito por Takai et al. (1999), con 30 ciclos de amplificación. Las condiciones cíclicas fueron: desnaturalización 90 s a 94 °C, hibridación 1 min a 55 °C y extensión 2 min a 72 °C.

La resolución de las muestras de ADN amplificadas se efectuó por cámara de electroforesis horizontal (Wide Mini-Sub®, BIO-RAD) en gel de agarosa al 1% P/V, teñido con bromuro de etidio (0.005%), según procedimiento estándar, utilizando como solución amortiguadora de corrida TBE 0.5 X (0.09 M Tris-Borato, 0.002M EDTA pH 8.0). La resolución del amplicón característico de R. equi se efectuó por electroforesis en gel de agarosa 1%P/ V, según lo descrito por Sambrook et al. (1989), con marcadores de peso molecular Ladder de 100 pares de base (pb) Gybco BRL®. Para el amplicón de 441 pb se utilizaron los cebadores descritos por Sellon et al. (2001).

Análisis Estadístico

Se realizó un análisis estadístico descriptivo. Los resultados se expresaron en porcentaje. El coeficiente de correlación de Spearman fue usado para determinar asociación entre rodococosis y los genes vap encontrados con el tipo de trastorno digestivo y/o respiratorio. Se utilizó el programa estadístico IBM SPSS® y un nivel de significancia de p<0.05.

RESULTADOS

Se colectaron muestras de 86 potrillos. De estos, 64 presentaron signos clínicos respiratorios, 17 con signos gastrointestinales y 5 con ambos tipos de signos clínicos. La mayoría de las muestras fueron tomadas durante la época de verano, en el mes de febrero (52%). Las muestras de ADN promediaron una concentración de 133 ng/µl, con un IP de 1.8.

Se encontraron 36 potrillos (41.9%) positivos a R. equi, siendo 5.8% vapA (5/86), 1.2% vapC (1/86) y 5.8% vapG (5/86) (Figuras 1-3). Por otra parte, solo en 1.2% (1/86) de las muestras se observó presencia de vapA, vapC y vapG, y en 4.6% (4/86) vapA y vapG. Los Vap D, E, F, H no fueron identificados en la población de estudio. Las muestras positivas a Vap se observaron únicamente en potrillos con signos clínicos respiratorios.

El coeficiente de correlación de Spearman entre vapA, vapC, vapG y signos clínicos de desordenes respiratorios fue de r=0.885, r=0.976 y r=0.885, respectivamente; asociación alta y positiva que indica alta confiabilidad.

DISCUSIÓN

Este estudio demuestra la presencia en Chile de variantes virulentas de R. equi en potrillos FSC con trastornos respiratorios en la zona central de Chile, siendo las variantes virulentas encontradas VapA, VapC y VapG. El 41.9% de los potrillos fue positivo a R. equi, porcentaje mayor del 35% encontrado por Miranda (2003) en una población de potrillos con y sin signos clínicos de tipo respiratorio y digestivo y del 33% reportado por Márquez (2006).

R. equi había sido reportado en el país mediante cultivo desde absceso pulmonar en un potrillo FSC (Paredes et al., 2000) y confirmado mediante PCR desde muestra de sangre y secreción nasofaríngea (Miranda, 2003). Así mismo, Marquez (2006) identificó una variante VapA por PCR desde muestra sanguínea en potrillos FSC clínicamente sanos. Gressler et al. (2018) también identificaron R. equi en cavidad nasal mediante la técnica PCR múltiple en equinos clínicamente sanos, indicando que está presente como parte de la flora bacteriana normal de la cavidad nasal en ejemplares criados en pasturas.

Los ejemplares positivos a Vap presentaron edades entre 3 y 4 meses de edad, rango etario en que la concentración de anticuerpos disminuye y, por lo tanto, los potrillos son más susceptibles a contraer la enfermedad (Vivrette, 1992). Los resultados encontrados de acuerdo con la época del año coinciden con Meijer y Prescott (2004), quienes mencionan como factores predisponentes a los ambientes calurosos, secos, polvorientos. En este estudio, las muestras fueron obtenidas de criaderos que poseen una alta densidad de población equina, lo que concuerda con lo descrito por Chaffin et al. (2003), quienes correlacionan positivamente densidad poblacional con R. equi patógeno.

La asociación obtenida en este estudio de potrillos con R. equi con variantes VapA, VapC y VapG con signos clínicos respiratorios fue significativa y positiva y de alta confiabilidad, no encontrando Vap en potrillos con trastornos gastrointestinales. Se describe que puede existir trastornos extrapulmonares en potros con neumonía por R. equi, encontrándose hasta un 74% de potros afectados (Johns, 2013). Estos trastornos pueden ser: artritis séptica, osteomielitis, absceso abdominal o colitis, o como consecuencia de una reacción inmune mediada, uveítis, sinovitis no séptica (típicamente de articulaciones múltiples), y anemia hemolítica inmuno mediada.

El plásmido de virulencia de R. equi ha sido reconocido por su asociación con la enfermedad causada por esta bacteria, y el plásmido VapA se indica como factor primario determinante en la virulencia de rodococosis (Okoko et al., 2015; Valero-Rello et al., 2015). Makrai et al. (2002) mostraron que el 88% de los aislamientos de R. equi en potros tienen VapA.

Se ha descrito que el cultivo microbiológico de muestras obtenida por ATB ha sido utilizado para el diagnóstico clínico de neumonía causada por R. equi, pero su sensibilidad es baja y se describen falsos negativos (Sweeney et al., 1987; Woolcock et al., 1987). El análisis de sangre e imagenología también se usan para loa diagnósticos presuntivos clínicos (Giguère et al., 2011). El diagnóstico serológico ha sido propuesto, pero con limitaciones (Arriaga et al., 2002). La técnica de PCR no solo es aplicable a secreciones de ATB, sino también a muestras de sangre (Bell et al., 1996; Sellon et al., 1997), saliva o exudados, evitando de esta manera el empleo de cultivos bacteriológicos (Bell et al., 1996). Se han estudiado otros métodos como el PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR) en muestras fecales para el diagnóstico temprano de neumonía en potrillos con R. equi (Madrigal et al., 2016); sin embargo, debe evaluarse la posibilidad de extrapolar resultados de estos análisis a otras poblaciones (Shaw et al., 2015).

 

LITERATURA CITADA

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Recibido: 19 de octubre de 2018

Aceptado para publicación: 29 de junio de 2019