Artículos primarios

Genotipificación por RAPD-PCR de aislados de Yersinia ruckeri procedentes de truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) de la sierra del Perú

Genotyping by RAPD-PCR of Yersinia ruckeri isolates from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) of the highlands of Peru

 

Fernando Mesías V.¹, Enrique Serrano-Martínez^1,2, Luis Llanco A.¹

¹ Grupo SANIVET, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú

² E-mail: enrique.serrano@upch.pe

 

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RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue identificar genotipos de Y. ruckeri, según su procedencia, mediante RAPD-PCR. Se tomaron muestras asépticas de bazo y riñón de truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) con signos clínicos de yersiniosis, provenientes de piscigranjas de cuatro departamentos (Junín, Lima, Ancash y Puno) del Perú. Las cepas fueron cultivadas en agar tripticasa de soya a 25 °C por 24 horas y la identificación presuntiva de las colonias sospechosas de corresponder a Y. ruckeri se hizo mediante tinción Gram y pruebas bioquímicas de oxidasa y catalasa. Luego, se confirmó la identidad de Y. ruckeri por PCR. Se obtuvieron 63 aislados de Y. ruckeri y se analizaron mediante RAPD-PCR. El dendograma de diversidad genética agrupó a todos los aislados en un clúster, estrechamente relacionadas con la cepa control Y. ruckeri ATCC 29473 (96% de similitud). También se observó que todos los aislados eran genéticamente idénticos (clones). Se sugiere que las cepas podrían tener un origen común debido a que tuvieron diferentes procedencias geográficas y elevada similitud entre ellos.

Palabras clave: sanidad acuícola; RAPD-PCR; yersiniosis; aislamiento; Yersinia ruckeri

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ABSTRACT

The aim of this study was to identify Y. ruckeri genotypes, according to their origin, by RAPD-PCR. Aseptic samples of spleen and kidney were taken from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) with clinical signs of yersiniosis in fish farms of four departments (Junín, Lima, Ancash and Puno) of Peru. The strains were cultivated on trypticase soy agar at 25 °C for 24 hours and the presumptive identification of the colonies suspected of being Y. ruckeri was made by Gram stain and biochemical tests of oxidase and catalase. Then, the identity of Y. ruckeri was confirmed by PCR. In total, 63 isolates of Y. ruckeri were obtained and analyzed by RAPD-PCR. The dendogram of genetic diversity grouped all the isolates in one cluster, closely related to the control strain Y. ruckeri ATCC 29473 (96% similarity). It was also observed that all the isolates were genetically identical (clones). It is suggested that the strains could have a common origin because they had different geographical origins and high similarity between them.

Key words: fish health; RAPD-PCR; yersiniosis; isolation; Yersinia ruckeri

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INTRODUCCIÓN

La enfermedad de la boca roja que afecta a los salmónidos, principalmente a la trucha arcoíris, es producida por Yersinia ruckeri. Esta bacteria gramnegativa causa infecciones sistémicas de curso agudo a crónico y actualmente tiene una distribución mundial (AustinB yAustin D,2016).La enfermedad se caracteriza por ocasionar altas mortalidades y pérdidas económicas en las piscigranjas, junto con la presencia de hemorragias alrededor de la boca y el ano, base de las aletas y en la superficie de los órganos internos de los peces (Barnes, 2011; Kumar et al., 2015). Fue aislada por primera vez en una piscigranja de los EEUU a comienzos de la década de 1950 (Rucker, 1966). El primer reporte en Perú de este agente infeccioso fue en Junín (Bravo y Kojagura, 2004) y, posteriormente, en otras regiones como Lima, Huancavelica y Áncash (Sirvas et al., 2011; Flores, 2013).

Si bien Y. ruckeri ha sido descrita como una especie altamente homogénea respecto de sus características fenotípicas y bioquímicas (Altun et al., 2013; Sierralta et al., 2013; Calvez et al., 2014); el desarrollo de métodos de tipificación molecular ha permitido profundizar los conocimientos sobre la variabilidad genética de este patógeno. Entre estos métodos se incluyen la ribotipificación (García et al., 1998), ERIC-PCR y REPPCR (Bastardo et al., 2012a; Duman et al., 2017), electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) (Huang et al., 2013) y tipificación de secuencias en múltiples locus (MLST) (Bastardo et al., 2012b; Calvez et al., 2015). Hay estudios que describen la diversidad genética de Y. ruckeri como elevada (Bastardo et al., 2012b; Duman et al., 2017), o estrechamente relacionada (Huang et al., 2013; Calvez et al., 2015), independiente del origen geográfico, hospedero y la elección del marcador para evaluar su variabilidad. Entre otros métodos de tipificación molecular basado en PCR, el ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD-PCR) (Williams et al., 1990), ha sido utilizado con éxito para estudiar la diversidad genética microbiana con fines epidemiológicos, así como establecer asociaciones con características fenotípicas como virulencia y resistencia a antimicrobianos, entre otros. Lamentablemente, y a pesar de la importancia de Y. ruckeri para la acuicultura nacional, son pocos los estudios que han intentado caracterizar molecular-mente esta bacteria. Es así que el objetivo de este estudio fue caracterizar la variabilidad genotípica de aislados de Y. ruckeri de truchas arcoíris procedentes de cuatro departamentos del Perú mediante RAPD-PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA, por sus siglas en inglés).

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio fue de tipo observacional, analítico y transversal. El aislamiento e identificación bioquímica, así como la caracterización molecular y análisis genético de Y. ruckeri se realizó en el Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FAVEZ) de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH), Lima, Perú. El estudio fue aprobado por el comité de ética de la FAVEZ-UPCH.

Se muestrearon 240 truchas arcoíris (30 peces por piscigranja) con signos clínicos de yersiniosis, colectadas entre febrero y agosto de 2018, procedentes de ocho piscigranjas de Junín, Ancash, Lima y Puno, ubicadas entre los 3200 y 4400 msnm. Los peces fueron llevados en cajas de tecnopor hasta el laboratorio dentro de bolsas plásticas con agua y oxígeno, en relación de 2 a 1, y cubiertas con gel packs para mantener la temperatura durante el transporte.

Los peces se anestesiaron mediante sobredosis de eugenol (3 ml/l de agua) y se procedió con la eutanasia por corte medular (CCAC, 2010), para realizar la necropsia, según la metodología descrita por Meyers (2009). Se tomaron muestras de bazo y riñón anterior de cada individuo, la cuales se sembraron por estriado en placas con agar tripticasa de soya (TSA) (Liofilchem, Italia) e incubados a 25 °C por 24 h. La identificación presuntiva de las colonias sospechosas de ser Y. ruckeri fue realizada mediante tinción de Gram (bacilos gramnegativos) y las pruebas bioquímicas de oxidasa y catalasa. A continuación, se realizó PCR convencional para confirmar la identidad de Y. ruckeri. Para esto, se extrajo el ADN bacteriano de colonias crecidas en caldo infusión cerebro corazón (BHI), utilizando un kit comercial (DNeasyBlood &Tissuekit, QIAGEN,Alemania). Los cebadores, para detectar el gen rRNA 16S, y las condiciones de la reacción de PCR fueron realizadas según el protocolo de Gibello et al. (1999). El producto fue analizado en gel de agarosa con TBE al 1%, corrido a 90v durante 1 h, teñido con bromuro de etidio (1 µg/ml) y digitalizado. La cepa ATTC 29473 de Y. ruckeri fue utilizada como control positivo y agua libre de DNAsas como control negativo. El 100 bp DNA ladder (Invitrogen, Brasil) fue utilizado como marcador de peso molecular. El resultado positivo se dio por la observación de un amplicón de 575 pares de bases (pb).

Para la tipificación molecular por RAPD-PCR se utilizaron los iniciadores arbitrarios: OPA 3, 9, 12, 17 y 18. En un termociclador (Eppendorf, Mastercycler), en volumen final de 20 µl se adicionó 50 ng de ADN bacteriano, 10 pmol del cebador, 2 mM de cada desoxinucleósido trifosfato (dNTP), 5 µl de buffer de Taq polimerasa y 5 U/µl de Taq polimerasa. Se utilizaron como control externo el ADN de E. coli ATCC 25922 y como control interno el de Y. ruckeri ATCC 29473. La reacción de PCR se realizó siguiendo un paso inicial de desnaturalización (94 °C durante 5 min), luego 35 ciclos de desnaturalización (94 °C durante 1 min), hibridación (42 °C durante 2 min) y extensión (72 °C durante 2 min), seguidos por una extensión final a 72 °C durante 10 min. Los productos amplificados se separaron electroforéticamente a 80 v durante 90 min en geles de agarosa al 1.2%, con solución amortiguadora TAE 1X. Los geles fueron teñidos con solución de bromuro de etidio (1 µg/ml) durante 15 min y posteriormente visualizados con luz UV.

Los patrones de bandas generados por RAPD-PCR fueron inspeccionados de manera visual y se generó una matriz binaria (presencia/ausencia). El análisis se realizó con base al coeficiente de similitud de Dice y el dendograma se generó con el software NTSYSpc v. 2.21, utilizando el método de agrupación UPMGA (unweighted pair group method with arithmetic mean, por sus siglas en inglés) (Applied Biostatistics, USA).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se obtuvieron 63 aislados de Y. ruckeri de 43 truchas, siendo 432 de bazo y 31 del riñón anterior, los cuales fueron confirmados molecularmente mediante PCR convencional al obtener una banda única del tamaño esperado. En el Perú se han reportado varios brotes de yersiniosis en piscigranjas de Lima, Áncash, Huancavelica y Puno (Sirvas et al., 2011; Flores; 2013; Sandoval et al., 2016), y más recientemente en Pasco, Cajamarca y Amazonas (Cerro et al., 2017; Castro et al., 2017). En el presente estudio, se aisló Y. ruckeri de bazo y riñón de truchas arcoíris son signos clínicos de enfermedad, procedentes de Puno, Áncash, Junín y Lima. Esto demostraría la persistencia de esta bacteria en centros productivos de truchas arcoíris.

De los cinco cebadores probados, solo OPA-18, generó perfiles RAPD en los 63 aislados de Y. ruckeri y en la cepa tipo de Y. ruckeri ATCC 29473. Se generaron 11 bandas en el rango de 300-3500 pb (Figura 1). El dendograma agrupó a las Y. ruckeri en un eran genéticamente idénticos y ligeramente distintos de la cepa tipo de Y. ruckeri ATCC 29473 (similitud de 96%) y muy distantes de la cepa de E. coli ATCC 25922 (similitud de 33%, no mostrada). Este resultado es similar al de investigaciones realizadas por Onuk et al. (2011) y Altun et al. (2013), quienes al analizar 97 y 15 aislados de Y. ruckeri, respectivamente, usando RAPD-PCR, encontraron pocos, pero homogéneos grupos clonales.

En otros estudios, donde se utilizó la técnica de RAPD-PCR, pero con otras especies del género Yersinia, se encontró tanto una baja (Leal et al., 1999;Akhila et al., 2013; Shanmugapriya et al., 2014) como alta homogeneidad entre los diversos aislados (Franzin y Cabodi, 2003; Soto et al., 2013). La mayoría de estos estudios recomiendan el uso de RAPD-PCR sobre otros métodos de tipificación, debido a su rapidez, simplicidad y confiabilidad al utilizar reactivos estandarizados.

Los 63 aislados de Y. ruckeri se agruparon en un solo genogrupo, resultado similar al de Bastardo et al. (2011b), quienes mediante el uso de REP-PCR y ERIC-PCR, obtuvieron un solo clúster al analizar 30 aislados de Y. ruckeri procedentes de Junín. En otro estudio similar con 11 aislados de Y. ruckeri procedentes del salmón del atlántico (Salmo salar L.) se obtuvieron dos y tres genogrupos mediante ERIC-PCR y REPPCR, respectivamente; encontrándose una homogeneidad mayor del 85% en estos grupos clonales (Bastardo et al., 2011a). Adicionalmente, Duman et al. (2017) estudiaron la relación genética mediante ERICPCR de 141 aislados de Y. ruckeri, hallando la presencia de cuatro genogrupos (72% similitud), donde el 82% de estos aislados mostraron un patrón similar (clones).

La baja diversidad genética y gran homogeneidad intraespecífica encontrada por Huang et al. (2013) y Calvez et al. (2015) entre los aislados de Y. ruckeri podría haberse debido a que se originaron de un mismo ancestro en común, indicando una estructura de población clonal, producto de la influencia del origen geográfico, diferentes presiones de selección, nichos ecológicos (hospederos) específicos y movimientos de los peces de cultivo, desempeñando todos un papel importante en la difusión y evolución de Y. ruckeri. Por otro lado, Bastardo et al. (2012b) y Gulla et al. (2018), analizaron aislados de Y. ruckeri de diversas partes del mundo, incluyendo el Perú, mediante tipificación multilocus de secuencias (MLST) y análisis multi-locus de número variable de repeticiones en tándem (MLVA), encontrando elevada diversidad genética entre los diferentes complejos clonales, asociándolos al serotipo, biotipo, hospedero, origen geográfico, tipo de ambiente y cantidad de aislados. Los autores sugieren que los aislados procedentes de Perú se originaron de América del Norte, los cuales podrían haberse diseminado por causas antropogénicas al no ser la trucha arcoíris una especie nativa de nuestro país.

CONCLUSIONES

• Se identifica a Yersinia ruckeri como el microrganismo causante de brotes de enfermedad en piscigranjas de la Sierra central y sur del Perú.

• Mediante el análisis RAPD-PCR se determinó que los 63 aislados son genéticamente muy similares entre sí, sugiriéndose que estos pueden tener un mismo origen y que exista clonalidad.

Agradecimientos

Los autores agradecen a FONDECYTCONCYTEC por el apoyo financiero brindado al Programa de Maestría en Sanidad Acuícola de la UPCH (Convenio de Gestión N.° 230-2015 FONDECYT–De-PROMOCIÓN 2), que permitió los análisis y la capacitación técnica de los investigadores para la ejecución del estudio. Del mismo modo, se agradece a los piscicultores y tesistas que colaboraron durante la recolección de muestras.

LITERATURA CITADA

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Recibido: 19 de noviembre de 2018

Aceptado para publicación: 31 de mayo de 2019