INTRODUCCIÓN
El caracol de jardín es un molusco gasterópodo perteneciente al Orden Pulmonados, Suborden Estilomatóforos, familia Helícidos. Las especies de caracol Helix aspersa Müller, H. pomatia Linné y H. lucorum Linné se caracterizan por la coloración de la concha (Cuellar y Cuellar, 2002; Pereyra et al., 2003). H. aspersa es el caracol terrestre de mayor uso en la crianza por su gran prolificidad y adaptación a diversos climas (García Vera, 2016).
Los gasterópodos terrestres se alimentan de productos vegetales, de allí que necesitan de una variedad de enzimas que les permita la digestión de polisacáridos complejos. La dependencia de los gasterópodos pulmonados con la actividad microbiana del intestino explicaría su extraordinaria eficiencia en la digestión de la fibra vegetal (6080%) (Charrier y Daguzan, 1980). La microbiota intestinal es un ecosistema complejo, y juega un rol importante en el mantenimiento de la salud del hospedador, contribuyendo con el sistema inmunitario y su metabolismo. La población microbiana del intestino es dinámica y fluctúa en respuesta a cambios en la dieta y estrés ambiental; sin embargo, es frecuente que una subpoblación de microorganismos conocido como el microbioma intestinal central permanezca estable en individuos que forman parte de una población (Dar et al., 2017).
Trabajos previos han demostrado que, dentro de las bacterias cultivables del tracto digestivo de los caracoles predominan las enterobacterias (Lesel et al., 1990; Watkins y Simkiss, 1990) y los enterococos (Charrier et al., 1998). Debido a su importancia epidemiológica, la mayor parte de los estudios taxonómicos del género Enterococcus han sido realizados en cepas provenientes de muestras clínicas. Sin embargo, hay un interés creciente por el estudio de microorganismos provenientes de medios externos y ambientes no tradicionales (Svec et al., 2002). Esta búsqueda se ve inducida por la necesidad de encontrar cepas con características metabólicas particulares que permitan su utilización en biotecnología.
El género Enterococcus ha cobrado relevancia en los últimos años debido a la producción de bacteriocinas, péptidos de origen ribosomal con actividad inhibitoria contra especies Gram positivas relacionadas, utilizadas con éxito para el control o inhibición de patógenos y/o contaminantes de alimentos (Alvarez-Cisneros et al., 2011; O’Connor et al., 2015). El objetivo del presente trabajo fue aislar, caracterizar y evaluar la actividad antiListeria de cepas de Enterococcus provenientes del intestino de caracoles de jardín (Helix aspersa), así como evaluar sus potenciales factores de virulencia.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas Bacterianas
Las cepas del estudio se aislaron a partir del intestino de caracoles de jardín (Helix aspersa) recolectados entre octubre y diciembre de 2018 en la ciudad de Punta Alta, provincia de Buenos Aires-Argentina. Los caracoles se anestesiaron, sacrificaron y mediante pinzas se les retiró el caparazón. Las muestras se tomaron con hisopos estériles a partir del contenido intestinal y fueron sembradas en caldo de púrpura bromo-cresol azida (Merck, Alemania) durante 24 h a 37 ºC para su enriquecimiento. Los cultivos líquidos se repicaron a agar bilis-esculina (Merck, Alemania) suplementado con ácido nalidíxico (20 µg/ml) y nistatina (10 µg/ml) y se incubaron 24-48 h a 37 ºC. Se realizaron sucesivos repiques hasta obtener colonias puras que fueron conservadas a -30 ºC en el Cepario del Laboratorio de Biotecnología Bacteriana, Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud (Sede Trelew) de la Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, Argentina.
Identificación Fenotípica
La identificación preliminar de las cepas conservadas se realizó mediante la coloración de Gram, ensayo de la actividad catalasa y oxidasa, crecimiento a 45 y 10 ºC y actividad de pirrolidonil aminopeptidasa (Pyr-A-Enterococos, Britania). La identificación fenotípica a nivel de especie de las cepas que exhibieron actividad anti-Listeria se realizó mediante pruebas bioquímicas y fermentación de azúcares, según las recomendaciones de Manero y Blanch (1999).
Actividad Hemolítica y Gelatinasa
La actividad hemolítica se evaluó en agar cerebro-corazón (Britania, Argentina) suplementado con sangre desfibrinada humana (5%), luego de una incubación a 37 ºC durante 48 h. Los resultados se interpretaron como positivos cuando se observó un halo de hemólisis completo alrededor de las colonias (β-hemólisis).
La actividad gelatinasa se realizó en agar tripticasa soja (TS) (Britania, Argentina) suplementado con 0.8% (m/v) de gelatina. Las placas se incubaron durante 48 h a 37 °C y se revelaron con una solución de ácido tricloroacético al 20% (v/v). Las zonas claras alrededor de las cepas se consideraron como positivas (Kanemitsu et al., 2001).
Resistencia a Vancomicina
Para la búsqueda de microorganismos con potencial resistencia se utilizó el agar TS suplementado con vancomicina (6 µg/ml) según las recomendaciones de Domig et al. (2003). Todas las cepas conservadas se repicaron a caldo TS y los cultivos se ajustaron a 0.5 en la escala de McFarland. Posteriormente, las placas se inocularon con 5 µl de cada cultivo y se incubaron durante 24 h a 37 ºC. Los resultados se interpretaron como positivos cuando se observó desarrollo de las colonias.
Producción de Exopolisacáridos
La producción de exopolisacáridos (EPS) se evaluó de manera cualitativa en agar cerebro-corazón adicionado con sacarosa 50 g/l y 0.8 g/l de rojo congo. La placa se incubó a 37 ºC durante 24 h y el resultado se interpretó como positivo cuando se observaron colonias de color negro.
Actividad Inhibitoria
La actividad inhibitoria se determinó luego de cultivar las cepas de enterococos conservadas en caldo Man Rogosa Sharp (MRS) (Biokar, Francia) durante 18-20 h a 37 ºC. Luego del periodo de incubación, los cultivos se centrifugaron a 8000 g a 4 °C durante 5 min. Los sobrenadantes libres de células (SLC) se neutralizaron con NaOH 0.5 M (Anedra, Argentina) y se sometieron a un calentamiento de 100 ºC durante 10 min. La determinación de la actividad contra cepas de Listeria innocua ATCC 33090, L. innocua Tw67, L. monocytogenes ATCC 4677, L. monocytogenes Scott A y L. monocytogenes 1908 de los SLC se realizó por el método de difusión en placa, según lo descrito por Vallejo et al. (2014). El efecto antimicrobiano se expresó en mm, midiendo el halo de inhibición de crecimiento con un micrómetro (Starrett, USA).
Caracterización del Principio Activo
La sensibilidad a enzimas se llevó a cabo determinando la actividad residual luego de tratar los SLC durante 2 horas con tripsina (1 mg/ml), lisozima (1 mg/ml) y catalasa (2 mg/ml) en las condiciones óptimas para cada enzima. La actividad residual en todos los ensayos se determinó por el procedimiento previamente descrito.
Título de la Actividad Inhibitoria
La determinación cuantitativa de la actividad anti-Listeria se realizó por el método de difusión en placa, mediante la dilución seriada de los SLC de las cepas que presentaron un halo inhibitorio >15 mm contra Listeria innocua Tw67. Los resultados se expresaron como unidades arbitrarias/ml. Las unidades arbitrarias (UA) equivalen a la inversa de la mayor dilución con actividad antimicrobiana (halo de inhibición), dividido por los mililitros de sobrenadante sembrados (UA = 1/dilución/ml sembrados).
RESULTADOS
El aislamiento de los microorganismos se llevó a cabo a partir de 105 ejemplares de caracoles de jardín (H. aspersa) recolectados durante la primavera, estación del año que corresponde con la fase en que los caracoles se alimentan y presentan mayor actividad. Se aislaron 90 cepas pertenecientes al género Enterococcus, las que presentaron los rasgos fenotípicos que lo distinguen de otros cocos Gram positivos (catalasa negativa y anaerobios facultativos).
Solo ocho aislamientos exhibieron actividad gelatinasa, mientras que ninguno presentó actividad hemolítica ni resistencia a vancomicina. La producción de EPS se detectó de forma cualitativa en 49 cepas. Asimismo, 37 aislados presentaron actividad inhibitoria contra una o más cepas de Listeria (Cuadro 1) y no exhibieron ningún factor de virulencia ensayado. El tratamiento enzimático con catalasa y lisozima no alteró la actividad antagonista ejercida por los SLC, pero el tratamiento con tripsina abolió por completo la capacidad inhibitoria.
Se seleccionaron 16 cepas sobre la base de su mayor actividad anti-Listeria (halos de inhibición >15 mm). Para tal fin, se evaluó la actividad inhibitoria de los SLC frente a L. innocua Tw67 de forma semi-cuantitativa, determinando las UA/ml. La mayor actividad anti-Listeria se determinó en las cepas pigmentadas, correspondiendo a la especie E. mundtii, mientras que las restantes cepas, pertenecientes a las especies E. faecium y E. avium exhibieron títulos de actividad inferiores. Los resultados obtenidos se observan en el Cuadro 2.
DISCUSIÓN
Los enterococos, juntos con las bacterias Gram negativas usualmente forman parte de la microbiota de una gran variedad de animales, entre ellos los herbívoros. Dentro de los microorganismos cultivables provenientes de caracoles, a las enterobacterias y los enterococos se los relaciona generalmente con ambientes «entéricos», pero solo unos pocos residen de forma permanente en el intestino de los animales (Charrier et al., 1998).
Los 90 aislamientos de Enterococcus obtenidos a partir de 105 muestras de contenido intestinal ponen de manifiesto la alta frecuencia con que se encuentran estas bacterias en los caracoles. Estos resultados concuerdan con trabajos previos (Charrier et al., 2006; Koleva et al., 2015; Dar et al., 2017), en los cuales se destaca la presencia de bacterias lácticas (BL), en particular especies del género Lactococcus y Enterococcus.
Dentro de las BL, los enterococos no son microorganismos generalmente reconocidos como seguros (GRAS, del inglés generally recognized as safe) por la Food and Drug Administration (FDA) y se los considera patógenos oportunistas para los humanos, debido a que pueden persistir en el ambiente hospitalario y provocar infecciones en personas inmunodeprimidas o con enfermedades subyacentes graves. Los enterococos constituyen la tercera causa más común de infección nosocomial (12% del total) (Abriouel et al., 2008).
Entre los factores de virulencia a evaluar, se destaca la producción de gelatinasa, actividad hemolítica y resistencia a vancomicina, características que aumentan la patogenicidad de las cepas y tienen importancia clínica. La actividad gelatinasa se detectó en una baja frecuencia (8/90), resultados que contrastan con los hallados en trabajos previos (Eaton y Gasson, 2001; Kanemitsu et al., 2001; Silva et al., 2011; Semedo et al., 2003; Ledesma et al., 2015), donde se encontró una alta frecuencia de aislamientos de enterococos provenientes de alimentos fermentados y de aves silvestres.
Dentro del ambiente intestinal, las cepas del género Enterococcus son consideradas como organismos beneficiosos para los huéspedes, porque forman una estructura similar a una biopelícula en el epitelio, lo que evitaría que el intestino sea colonizado por microorganismos patógenos (Shao et al., 2014; Dar et al., 2017). La producción de EPS fue fenotípicamente evaluada en todos los aislamientos, detectándose en más del 50% de las cepas (49/90). La producción de EPS por parte de las BL desempeña un papel destacado en la elaboración de productos lácteos fermentados; y en particular contribuye a la textura, reología, sabor y estabilidad final del producto (Shene y Bravo, 2006). Por otra parte, la producción de estas sustancias está relacionada con la capacidad de formar biofilm y permitir la colonización, incrementando la residencia de los microorganismos en el intestino (Parra Huerta, 2010).
Otro rasgo de interés que presentan los miembros de este grupo bacteriano es la producción de péptidos antimicrobianos, con fuerte actividad anti-Listeria, denominados en forma general como enterocinas. Los resultados obtenidos en cuanto a la inhibición contra cepas del género Listeria demuestran una alta frecuencia en las cepas aisladas (37/90), destacándose E. mundtii con títulos de actividad inhibitoria elevados (163 840 - 327 680 UA/ml). A diferencia de trabajos previos (Charrier et al., 1998; Švec et al., 2002), en los cuales se demuestra la presencia de especies pigmentadas (E. casseliflavus y E. flavescens), en este estudio en particular se identificaron cepas de E. mundtii, E. faecium y E. avium bacteriocinogénicas. Si bien se han aislado cepas de estas especies en seres humanos y animales de cría y domésticos, las citadas especies son particularmente poco frecuentes en este tipo de nicho.
Los resultados obtenidos a partir de la caracterización preliminar confirman que la actividad antimicrobiana de los SLC no es ejercida por el peróxido de hidrógeno, son de naturaleza proteica y no presentan azúcares en su estructura, características compatibles con sustancias inhibitorias tipo bacteriocinas. En todos los casos estudiados, la estabilidad térmica indicaría que se trata de péptidos de bajo peso molecular con actividad anti-Listeria, propiedades que permiten incluirlas dentro del grupo de bacteriocinas clase I o II (Alvarez-Sieiro et al., 2016).
En la actualidad, existen una gran cantidad de trabajos donde se destaca la producción de péptidos bioactivos por parte de cepas de E. mundtii aislados de diversos hábitats y sus potenciales aplicaciones en biopreservación de alimentos y/o como probióticos (Schelegueda et al., 2015; Grau et al., 20017; Vallejo et al., 2018; Delcarlo et al., 2019). Sin embargo, no hay antecedentes del aislamiento de especies de E. mundtii bacteriocinogénicos a partir de caracoles de jardín.
Todas las cepas de enterococos que exhibieron actividad anti-Listeria presentaron además producción de EPS. Ambos rasgos podrían tener un efecto sinérgico que probablemente impida el ingreso y establecimiento de microorganismos patógenos en el intestino del caracol, manteniendo el equilibrio ecológico. También se debe considerar que ninguna de las 16 cepas seleccionadas exhibió alguno de los factores de virulencia evaluados.
CONCLUSIONES
Durante los últimos años ha despertado especial interés la búsqueda de microorganismos con capacidades biotecnológicas aplicables a la producción de bienes y servicios. En particular, la industria alimenticia, inducida por los consumidores, ha tratado de ofertar productos cada vez más seguros y evitando el uso de conservantes químicos. Las cepas bacteriocinogénicas y las bacteriocinas han sido utilizadas con éxito en diversos modelos y se vislumbran como posibles alternativas. En el caso de este trabajo se seleccionaron 16 cepas del contenido intestinal de caracoles con capacidad inhibitoria, y dentro de este grupo de destacaron las cepas de Enterococcus mundtii con actividades entre 163 840 y 327 680 UA/ml.