INTRODUCCIÓN
La leptospirosis es una enfermedad zoonótica de distribución mundial (Pacheco, 2015), siendo Leptospira spp el agente causal de esta patología, principalmente en regiones tropicales (Picardeau et al., 2014), donde la temperatura y la humedad ambiental son adecuadas para su supervivencia (Céspedes, 2005). Los miembros de esta familia son bacterias helicoidales, de gran motilidad debido a la presencia de un motor flagelar en cada extremo (Cameron, 2015), característica que permite identificarlas con un microscopio de campo oscuro (Raddi et al., 2012).
El género Leptospira presenta 35 especies (Thibeaux et al., 2018), las cuales a su vez se dividen en tres clados evolutivos: patógenos (13 especies), saprófitos (11 especies) y de patogenicidad intermedia (11 especies) (Levett y Smythe, 2008; Guglielmini et al., 2019).). Además, mediante la clasificación serológica se han definido a los serovares como la unidad taxonómica, ya que tienen una estructura antigénica característica (Zárate et al., 2012), habiéndose identificado en la actualidad más de 300 serovares patógenos, divididos en 24 serogrupos (Cerqueira y Picardeau, 2009). Los serovares con antígenos en común pertenecen al mismo serogrupo (Quinn et al., 2011; Guglielmini et al., 2019). Los serovares con antígenos en común pertenecen al mismo serogrupo (Quinn et al., 2011). El serovar mejor adaptado en bovinos es Hardjo. Así mismo, se ha demostrado que Leptospira interrogans serovar Pomona y serovar Icterohaemorrhagiae son causales frecuentes de infección en bovinos (Molina et al., 2011).
Los hospederos incidentales, en donde están incluidos mamíferos domésticos, de producción y el hombre (Moreno, 2012), desarrollan la forma severa de la enfermedad, pero no actúan como transmisores eficientes de Leptospira spp a otros animales (Quinn et al., 2011). En el bovino, la transmisión de esta bacteria se produce a través de membranas mucosas, conjuntiva o por lesiones en la piel (Baquero et al., 2010). Los rumiantes tienen gran importancia en la diseminación de la enfermedad, ya que la orina alcalina permite mayor viabilidad de estas bacterias en comparación con una orina ácida (Moreno, 2012).
La leptospirosis bovina tiene un alto impacto económico en la actividad pecuaria, debido a la ocurrencia de abortos (Cantón et al., 2014), reabsorciones fetales, infertilidad, nacimiento de animales débiles y disminución de la producción láctea (Ellis, 2015; Dereje et al., 2018). Además, su diagnóstico es imprescindible para diferenciar esta patología de otras enfermedades reproductivas que afectan al hato (Rodríguez y Ramírez, 2011), tales como brucelosis, campylobacteriosis, neosporosis, diarrea viral bovina y rinotraqueitis infecciosa bovina (Zárate et al., 2015).
El diagnóstico de leptospirosis se basa principalmente en la identificación del agente mediante métodos microbiológicos, moleculares como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y serológicos como la técnica deAglutinación Microscópica (MAT) (OIE, 2014). El diagnóstico por PCR es ampliamente utilizado (Picardeau et al., 2014) pues permite un diagnóstico precoz, con resultados reproducibles y de fácil interpretación (Moreno y Agudelo, 2010). La extracción de ADN de las leptospiras se puede hacer a partir de muestras clínicas de diferente tipo (Martín et al., 2015); consecuentemente, se debe considerar la elección del protocolo apropiado que permita la obtención de material genético de calidad; asimismo, la selección de iniciadores dependerá la sensibilidad y especificidad de la técnica (OMS, 2008; Alegre et al., 2013). En este estudio se evaluaron tres protocolos de extracción de ADN genómico con el objetivo de determinar el método adecuado para detectar la presencia de Leptospira spp mediante PCR en muestras de orina bovina.
MATERIALES Y MÉTODOS
En este trabajo se realizó, primeramente, la estandarización de los métodos de extracción de ADN en muestras de orina bovina e inoculadas experimentalmente con los serovares de Leptospira Hardjo, Icterohaemorrhagiae y Wolffi. Posteriormente se trabajó con muestras de orina recolectadas en campo para comprobar la efectividad de los protocolos. Las muestras de orina fueron conservadas a 4 ºC y diluidas en PBS 1X a fin de neutralizar la orina, centrifugaron para obtener el sedimento con las bacterias, procesándose en un tiempo máximo de 72 horas, según lo indican varias investigaciones (Lucchesi et al., 2004; Harkin et al., 2005; Rossetti y Boggia, 2014).
Protocolos de Extracción de ADN Genómico
El trabajo de laboratorio se realizó en los laboratorios de DiagnósticoAnimal y Biología Molecular de laAgencia de Regulación y Control Fito y Zoosanitario (AGROCALIDAD), ubicados en la provincia de Pichincha, ciudad de Quito, Ecuador.
Cultivo de Leptospira spp
Se trabajó con cultivos de Leptospira spp del laboratorio arriba indicado, los cuales fueron mantenidos en el medio EMJH (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) a 29 °C, y repicados cada semana a fin de disponer de cultivos aptos para ser inoculados en las muestras de orina.
Inoculación en muestras de orina
Se trabajó con cuatro muestras de orina bovina (9 ml). Dos fueron colectadas en el Centro Experimental Uyumbicho de la Universidad Central del Ecuador, (parroquia de Uyumbicho, provincia de Pichincha) y las otras se colectaron en la ciudad de Tulcán, provincia del Carchi. Las muestras fueron diluidas a partes iguales en PBS, pH 7.4 y depositadas en tubos Falcon®. Primeramente se realizó la extracción de una muestra de orina sin inóculo bacteriano para verificar su negatividad a Leptospira spp mediante PCR. Luego, las muestras fueron inoculadas con 1 ml de cultivo de los tres serovares (108 bacterias/ml), debido a que los portadores renales crónicos pueden llegar a excretar esa concentración de espiroquetas (Adler y de la Peña Moctezuma, 2010). La muestra inoculada se mantuvo en refrigeración hasta el momento de la extracción. Además, se preparó un control negativo, únicamente con orina diluida en PBS 1X.
Extracción de ADN Genómico
Se estandarizaron tres métodos de extracción de ADN genómico de Leptospira spp a partir de orina bovina: Etanol-Hidróxido de Sodio (EtNa) (según Vingataramin y Frost, 2015), resina quelante Chelex® 100 (Bio-Rad, USA) (según el protocolo de Noda y Rodríguez, 2014) y el estuche de extracción comercial PureLink® Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, USA).
-Etanol-Hidróxido de Sodio (EtNa): Se siguió el protocolo de Vingataramin y Frost (2015). Se centrifugaron los tubos Falcon® a 4100 x g por 20 min, se removió el sobrenadante, excepto 1 ml, y se resuspendió el pellet en el volumen restante. Se transfirió a un tubo Eppendorf y se centrifugó a 13 000 x g por 5 min. Se removió cuidadosamente el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 1 ml de PBS 1X pH=7.4 estéril. Luego se centrifugó a 13000 x g durante 5 min, se eliminó el sobrena-dante, se resuspendió el pellet en 100 µl de PBS 1X, se añadió 455 µl de la solución de extracción de ADN EtNa, se mezcló brevemente y se llevó a 80 °C por 10 min en termobloque. Se centrifugó a 16.060 x g por 10 min, se removió el sobrenadante y finalmente se resuspen-dió el pellet en 100 µl de la solución de resuspensión de ADN.
-Extracción de ADN Genómico utilizando Chelex®: Se preparó una solución de Chelex® (Bio-Rad, USA) al 5% en buffer TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8.0), y se siguió el protocolo basado en la publicación de Noda y Rodríguez (2014).
-Extracción de ADN Genómico utilizando el Estuche de Extracción Comercial Pure-Link® Genomic DNA Mini Kit: Se siguieron las especificaciones del fabricante.
Protocolos de PCR
Se utilizaron 5 µl delADN genómico extraído como molde para los tres protocolos de PCR, tanto para las muestras inoculadas experimentalmente como para las muestras colectadas en campo. Se emplearon tres pares de cebadores reportados por León et al. (2006), permitiendo identificar: a) género Leptospira (rrl Forward 5‘GACCCGAAGCCTGTCGAG3‘/ rrl Reverse 5‘GCCATGCTTAGTCCCGATTAC3‘) con un producto de 482 pb, b) patogenicidad, amplificando un producto de 262 pb (hap1 Forward 5‘GCAAGCATTACCGCTTGTGG3‘/ hap1 Reverse 5‘TGTTGG-GGAAATCATACGAAC3‘) y c) especie saprófita, con un amplicón de 240 pb (rrs Forward 5‘AGAAATTTGTGCTAATACCGAATGT3‘/ rrs Reverse 5‘GGCGTCGCTGCTTCAGGCTTTCG3‘). Se incluyó un control negativo (agua DEPC) y un control positivo (muestra de orina negativa confirmada por PCR e inoculada con Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo.
La mezcla maestra se preparó con las siguientes condiciones: 0.2 µM de cada cebador, 1.5 mM MgCl2 (Invitrogen), 1X PCR Buffer (Invitrogen), 0.2 mM dNTPs (Promega) y 1 U de Taq polimerasa recombinante (Invitrogen) en un volumen final de 20 µl. El perfil térmico para cada par de cebadores se realizó según estudios preliminares (Hernández-Rodríguez et al., 2011), de acuerdo al siguiente detalle:
-rrl: Incubación a 95 ° C durante 5 min, seguido de 39 ciclos de amplificación a 94 ° C durante 30 s, 57 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min y una extensión final durante 5 min a 72 °C.
-hap1: Incubación a 94 °C durante 5 min, seguido de 44 ciclos de amplificación a 94 °C durante 15 s, 56 °C durante 35 s y 72 °C durante 40 s y una extensión final durante 5 min a 72 °C.
-rrs: Incubación a 98 °C durante 2 min, seguido de 44 ciclos de amplificación a 98 °C durante 15 s, 63 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s y una extensión final durante 10 min a 72 °C.
La electroforesis del producto amplificado en la PCR se realizó en un gel de agarosa al 1.5% teñido con SYBR Safe™ (1 µl por cada 10 ml de buffer) por aproximadamente 40 minutos a 100 V.
Límite de detección
Se determinó el límite de detección analítica en tres ensayos consecutivos. Se inocularon muestras de orina con diluciones seriadas en base 10 de un cultivo de Leptospira spp de cinco días de edad, partiendo de una concentración de 108 hasta obtener una dilución de 101 células/ml de orina. Para este fin se empleó el cultivo de Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo, el cual fue seleccionado debido a su adaptación en bovinos y el protocolo para los iniciadores hap 1.
Presencia de Leptospira spp en Orina Bovina
Actividades de campo
El trabajo de campo se llevó a cabo en dos fincas con ganado Bos indicus con predominio de Gyr, con animales entre cuatro meses y siete años, machos y hembras. Los animales se encontraban en un sistema de crianza de tipo tradicional (extensivo), alimentados con pasto Saboya (Panicum maximum) y manipulados únicamente para la administración de antiparasitarios y vacunas contra carbunco sintomático, edema maligno y pasteurelosis. Las fincas están localizadas en los cantones de Chone y Pedernales, provincia de Manabí, Ecuador.
Se seleccionaron al azar 100 bovinos clínicamente sanos para la recolección, pero solo se emplearon 72 muestras debido a la cantidad insuficiente de orina. Para la colección de la orina se hizo previamente un lavado de la zona vulvar y perianal con agua jabonosa y se administró furosemida por vía intramuscular a una dosis de 1 mg/kg. Las muestras se colectaron por micción espontánea en envases estériles de 100 ml de capacidad. Se tomaron 7 ml orina para cada método de extracción en tubos Falcón. Se agregó 7 ml de PBS 1X, pH 7.4, para obtener una dilución 1:1 en cada tubo. Las muestras neutralizadas fueron refrigeradas y transportadas de inmediato a los laboratorios de AGROCALIDAD, al igual que los remanentes de orina para su respectivo desecho como material infeccioso.
RESULTADOS
Protocolos de Extracción
La extracción delADN genómico de las estas muestras se realizó mediante los tres métodos de extracción en estudio. El ADN genómico de Leptospira spp extraído fue analizado mediante PCR utilizando los iniciadores hap 1, los cuales amplificaron un fragmento esperado de 262 pb. Estos iniciadores amplifican para genes que codifican proteínas asociadas a la hemólisis y, consecuentemente, a patogenicidad. Se evidenció el fragmento esperado de 262 pb, excepto para el serovar Wolffi, donde no se observó amplificación. Por lo tanto, en el caso de Wolffi el PCR se realizó utilizando los iniciadores género específicos rrl, llegando a mostrarse el fragmento esperado de 482 pb.
Los resultados para la determinación del límite de detección de ADN genómico se muestran en el Cuadro 1 y Figuras 1 y 2.
(+): PCR positivo; (-); PCR negativo; (+/-) PCR variable
Presencia de Leptospira spp en Orina Bovina
Se analizaron 72 muestras de orina de bovinos mediante los dos métodos de extracción deADN con mejor sensibilidad analítica en las pruebas experimentales (Purelink® Genomic DNA Mini Kut y Chelex-100). De estas muestras, 10 amplificaron para el gen rrl, específico de especie, 8 muestras amplificaron para el gen de patogenicidad hap 1, y ninguna amplificó para el gen rrs (Cuadro 3).
Se consideraron satisfactorios los resultados de cuantificación obtenidos por los métodos Purelink® Genomic DNA Mini Kit y Chelex-100. Con esta base se decidió descartar a EtNa como método de extracción para las muestras de campo
(+): PCR positivo; (-); PCR negativo
A fin de evaluar el índice de concordancia de los dos métodos de extracción con mejor límite de detección (PureLink® Genomic DNA Mini Kit yChelex-100) se utilizaron las 72 muestras de orina y luego se realizó la PCR con el par de cebadores de patogenicidad hap 1. Con el método de extracción Chelex-100 se obtuvieron 8 muestras positivas, mientras que con el método PureLink® Genomic DNA Mini Kit solo se detectaron 5 de los 8 positivos al gen hap 1 (Cuadro 4). El valor obtenido del índice Kappa (K= 0.74) fue bueno, demostrando la concordancia que existe más allá del azar entre los métodos de extracción de ADN genómico Purelink® Genomic DNA Mini Kt y Chelex-100.
DISCUSIÓN
El diagnóstico definitivo de leptospirosis requiere de la identificación del agente etiológico a través de pruebas de laboratorio (Agudelo et al., 2006). La PCR es una técnica diagnóstica que permite la identificación rápida y oportuna de animales infectados a través de muestras de sangre u orina (Levett, 2001), permitiendo identificar a aquellos animales en fase de leptospiruria (García et al., 2013).
Los resultados obtenidos por PCR deben ser interpretados apropiadamente. Ante un resultado negativo se requiere considerar factores tales como una conservación inadecuada de la muestra, la excreción intermitente de Leptospira spp a través de la orina, la elección de un método de extracción inadecuado y la presencia de inhibidores de la PCR (Martín et al., 2015). En ese sentido, esta investigación se enfocó en optimizar un protocolo de extracción de ADN genómico de Leptospira spp a fin de obtener mejores resultados en la técnica de PCR.
El método EtNa demostró ser útil para la extracción de ADN a partir de muestras de orina inoculadas con una alta concentración bacteriana, lo cual se evidenció luego de la amplificación de un fragmento esperado de 262 pb que codifica para el gen LipL32. Estos datos concuerdan con el trabajo de Vingataramin y Frost (2015) con este método a partir de cultivos puros, suspensión en solución salina de colonias, orina y líquido cefalorraquídeo de microorganismos gram positivos, gram negativos y levaduras.
En las extracciones de ADN con los otros dos métodos, Chelex-100® y Purelink®Genomic DNA Mini Kit, se evidenció también un fragmento esperado de 262 pb que codifican para el gen LipL32 de Leptospira spp; sin embargo, el serovar Wolfii no pudo ser amplificado en orina al usar estos métodos de extracción empleando los iniciadores para la identificación de patogenicidad, no así a partir de cultivo puro donde los tres métodos de extracción amplificaron el producto esperado para el gen rrl. Esto podría deberse a que la proteína LipL32 asociada a la hemólisis no tiene genes ortólogos en las especies saprófitas, y únicamente ha sido identificada en especies patógenas de Leptospira (Haake et al., 2000), ocurriendo probablemente lo mismo en las especies de patogenicidad incierta, como es el caso de L. Wolffi (Ko et al., 2009).
El método de extracción por EtNa, en la cual se amplificó el fragmento esperado de 262 pb, evidenció una baja sensibilidad, observándose tan solo en las diluciones de mayor concentración (108 a 106 bacterias/ml). Estos datos concuerdan parcialmente con los resultados de Vingataramin y Frost (2015) quienes observaron que EtNa fue un método eficiente al trabajar con concentraciones elevadas (109) y bajas (103) de microorganismos grampositivos, gramnegativos y levaduras. La baja sensibilidad de este método podría deberse a que la presencia de inhibidores en la orina como cristales, hemoglobina y de hormonas (Gaydos et al., 2004; Fonseca et al., 2005) que pudieron haber interferido con la PCR. Este inconveniente podría resolverse con una etapa de purificación de ADN en columnas de sílice (Vingataramin y Frost, 2015), aunque incrementaría el tiempo y el costo de la prueba.
El método Chelex-100 en buffer TE demostró ser el método más eficiente. Los resultados del índice de concordancia Kappa entre este método y PureLink® Genomic DNA Mini Kit, fue bueno (K=0.74), demostrando la concordancia que existe entre estos dos métodos más allá del azar. Mediante esta técnica de extracción de ADN se obtuvo el mayor número de resultados positivos a partir de muestras clínicas (n=8). Céspedes et al. (2008) concluyeron que este era el método más adecuado para la extracción en orina humana, logrando detectar Leptospira hasta una concentración de 103 bacterias/ml. Así mismo, Villumsen et al. (2012) y Noda & Rodríguez (2014) obtuvieron excelentes resultados con Chelex-100 al trabajar sobre sangre y orina humana. Además, la eficiencia de este protocolo en comparación con el kit comercial podría deberse a que en los procesos de purificación en columnas de sílica se perdería cierta cantidad de ADN (Noda y Rodríguez, 2014).
El gen hap 1 se amplificó en 8 de 72 muestras clínicas, detectando así, la presencia de leptospiras patógenas (Evangelista y Coburn, 2010). Debido a esto, fue necesario utilizar también cebadores para identificar especies de patogenicidad incierta y saprofíticas, las cuales también podrían estar presentes en muestras de orina, y descartar la existencia de falsos negativos a causa de los métodos de extracción empleados.
CONCLUSIONES
El protocolo Chelex-100 fue el que presentó mejores resultados para la extracción de ADN genómico de Leptospira spp a partir de muestras de orina bovina inoculada experimentalmente, en cuanto a calidad de ADN extraído y sensibilidad analítica. Por lo tanto, fue considerado el método de elección para diagnóstico de campo de leptospirosis bovina mediante PCR
El método de extracción EtNa mostró resultados insatisfactorios para ser empleado como método eficaz para la extracción de ADN genómico Leptospira spp.
La prueba Kappa determinó una buena concordancia (™=0.74) entre los métodos de extracción Chelex-100 y el kit comercial Purelink® Genomic DNA Mini Kit.
Agradecimiento
Al Dr. Euclides de la Torre Andrade, MSc Patricia Medranda, Ing. Guido de la Torre, M.V.Z. Juan Delgado, al Sr. Santiago Romero, M.V. María Elena Rovalino y M.V.Z. Juan Pablo Durán por su apoyo y confianza durante el desarrollo de este proyecto. Al Dr. Nelson Cabrera, Dra. Maritza Barrera, M.V.Z. Mercy Falconí e Ing. Ana Garrido por permitir realizar esta investigación en los laboratorios de Diagnóstico Animal y Biología Molecular -AGROCALIDAD.