INTRODUCCIÓN
Las algas marinas son consideradas como una rica fuente de metabolitos secundarios con estructuras y funciones muy diversas. En su ambiente natural, tales metabolitos estarían involucrados en la defensa contra organismos herbívoros e invasión de patógenos, así como en la protección contra la radiación UV y como agentes alelopáticos (Watson y Cruz-Rivera, 2003).
Las algas marinas o macroalgas proporcionan una gran variedad de metabolitos y compuestos bioactivos naturales como polisacáridos, ácidos grasos poliinsaturados, florotaninos y otros compuestos fenólicos y carotenoides (Pérez et al., 2016). Muchas especies han mostrado tener sustancias con efectos antimicrobianos, en especial bactericidas o bacteriostáticos (Taskin et al., 2010), cuyas estructuras corresponden a ciertos tipos de aminoácidos, terpenoides, florotaninos, ácido acrílico, compuestos fenólicos, esteroides, cetonas y alcanos halogenados, así como polisulfuros cíclicos y ácidos grasos (Watson y Cruz-Rivera, 2003). La gran variedad de algas marinas hace de este recurso una fuente potencial de fármacos y un campo abierto a la investigación en farmacognosia marina (De Lara-Isassi yLozano, 1989).
Las investigaciones actuales sobre estas sustancias están orientadas a la búsqueda de nuevos metabolitos con propiedades biomédicas y farmacológicas y sus aplicaciones en el área de la salud pública (Gutiérrez et al., 2016, Montoya et al. 2017). Las algas marinas, en especial las macroalgas, han recibido especial atención por ser potenciales fuentes de compuestos bioactivos con amplio espectro de actividades biológicas que incluyen propiedades antibacterianas, antivirales, antifúngicas, antiparasitarias y antioxidantes, entre otras (Magallanes et al., 2003; Mayer et al., 2007; Ríos et al., 2009; Cox et al., 2010, Pérez et al., 2016).
El gran potencial que tienen actualmente las algas marinas en la producción de nuevos compuestos naturales y sus posibles aplicaciones como medicamentos, ingredientes biológicos o farmacológicos, nutracéuticos, ingredientes alimentarios funcionales, etc. ha provocado en muchas partes del mundo el interés por este recurso natural (Freile & Morales, 2004; Montoya et al., 2017).
Por otro lado, es ampliamente conocido el problema de la multi-resistencia antibiótica en el tratamiento de los principales patógenos, debido principalmente por el uso excesivo de fármacos que han facilitado la proliferación de microorganismos altamente resistentes a varios quimioterápicos (Shanmughapriya et al., 2008; Shafay et al., 2015). En este sentido, las investigaciones sobre la actividad antibacteriana de extractos de algas marinas abren un abanico de posibilidades en la búsqueda de nuevas moléculas bio-activas que pueden ser alternativas para enfrentar a las bacterias patógenas drogo-resistentes (Gutiérrez et al., 2016). La revisión bibliográfica sobre el potencial terapéutico de macroalgas marinas indica que producen una amplia variedad de metabolitos secundarios que podrían ser aprovechados en el marco de la biotecnología marina (Troncoso et al., 2015; Pérez et al., 2016).
En Perú son pocos los estudios realizados sobre la actividad antimicrobiana de macroalgas, donde Balta (1988) reportó Enteromorpha intestinalis (Chlorophyta) y Polysiphonia paniculata (Rhodophyta) con capacidad antibacteriana y Magallanes et al. (2003) mencionó a Grateloupia doryphora, Ahnfeltiopsis durvillaei, Prionitis decipiens, Petalonia fascia y Bryopsis plumosa. Así, el presente trabajo de investigación buscó determinar la actividad antimicrobiana de extractos hexánicos y etanólicos obtenidos a partir de macroalgas marinas colectadas en la Bahía de Ancón (Lima, Perú).
MATERIALES Y MÉTODOS
Macroalgas Marinas
Las muestras de macroalgas fueron recolectadas manualmente en septiembre de 2013 en horas de marea baja en la zona intermareal de la Playa San Francisco (11°46’42" LS 77°11’ LW) -Bahía de Ancón, Lima, Perú. Inmediato a la colecta se procedió a la limpieza de las muestras para remover las epífitas, partes necróticas y otros materiales extraños. Se lavaron cuidadosamente hasta tres veces con agua de mar estéril y llevadas al laboratorio en bolsas estériles de cierre hermético y refrigerado en hielo.
Las muestras fueron nuevamente enjuagadas con agua de mar estéril en el laboratorio y secados en una estufa a 40°C por 24 h. Una parte de cada muestra fue destinada para la identificación, según el protocolo de identificación de macroalgas del laboratorio de Ficología Marina, Facultad de Ciencias Biológicas (FCB), Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM).
Cepas de Bacterias Testigo
Se utilizaron como cepas testigo bacterias estándares de American Type Culture Collection (ATCC) de las especies Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella TyphimuriumATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633 y Enterococcus faecalis ATCC 51922, pertenecientes a la colección del Laboratorio de Ecología Microbiana de la FCB-UNMSM.
Extractos Orgánicos
Las muestras secas se procesaron según Torres et al. (2017) con modificaciones. Se cortaron en trozos pequeños y luego fueron sometidos a molienda fina hasta obtener un material pulverizado. Las muestras en polvo se remojaron con un solvente polar (etanol) y apolar (hexano), respectivamente (25 g/75 ml) y se mantuvieron durante 24 h en recipiente cerrado y en agitación constante de 120 rpm a temperatura de laboratorio. Luego el macerado se filtró utilizando papel Whatman N.º 1. El filtrado obtenido se sometió a concentración a presión reducida en un rotavapor (Buchi, R-3000) a 40 °C hasta obtener volúmenes más pequeños (5-10 ml). Estas muestras se llevaron a sequedad en un horno a 40 °C, y fueron almacenadas en refrigeración en recipientes de color ámbar hasta su uso en pruebas de actividad antibacteriana. Todo el proceso se llevó a cabo en esterilidad.
Inóculos Bacterianos
Los inóculos bacterianos se prepararon reactivando las cepas testigo en 10 ml de Caldo Cerebro Corazón (BHI) e incubando por 24 h a 37 °C. A partir de este cultivo se prepararon los inóculos por suspensión en solución salina (0.85% NaCl) estéril, equivalente al tubo 0.5 de la escala de McFarland.
Actividad Antibacteriana
Esta prueba se determinó por el método modificado de difusión en pocillos en «doble capa» de agar (León et al., 2010). Se realizaron enAgar Tripticasa Soya (TSA) más la adición de una segunda capa de agar semisólido al 0.73% conteniendo alícuotas de una suspensión bacteriana según la escala McFarland 0.5. Luego de la solidificación se prepararon pocillos (4 mm de diámetro) utilizando un sacabocado estéril. Para las pruebas, tanto el extracto hexánico como el etanólico fueron previamente re-suspendidos en dimetilsulfóxido (DMSO) e inoculados (25 µl) a cada pocillo preparado. Las pruebas se realizaron por triplicado. Se pre-incubaron a 4 °C por 1 h, luego a 37 °C por 24 h. La presencia de halos de inhibición fue considerada como positiva de acción antibacteriana. Como control positivo se utilizó la estreptomicina (500 mg/ml) y como negativo el DMSO.
El porcentaje de inhibición (%) de los extractos se determinó aplicando la fórmula (Cruz et al., 2010): %Inhibición = (DM-DB/ DC-DB) x 100, donde DM: diámetro de la muestra (mm,), DB: diámetro del blanco (mm) (DMSO), DC: diámetro del control positivo (mm) (estreptomicina, 500 mg/ml). Una acción antibacteriana fue considerada alta cuando su porcentaje de inhibición es >70%, intermedia entre 50 y 70% y baja cuando es <50% (Ramírez, 2007).
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Se realizó siguiendo la metodología de microdilución en caldo (Boisvert et al., 2015). Los extractos de macroalgas fueron re-suspendidos en DMSO y diluidos en proporciones de 1:2 (p/v). Las muestras (10 µl) de cada dilución se colocaron en pocillos de micro-placas con adiciones de caldo tripticasa soya (80 µl) y la suspensión bacteriana (10 µl) (0.5 de escala McFarland). Luego de una incubación a 37 ºC por 18 h se adicionó la solución de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) (40 µl) a cada pocillo, para volver a incubar a 37 °C por 30 min adicionales. El viraje del medio a rojo indicó crecimiento microbiano. La estreptomicina se utilizó como control positivo. La CMI se determinó como la concentración más baja del extracto que muestra inhibición del crecimiento del microorganismo ensayado.
RESULTADOS
Las macroalgas fueron identificadas de pertenecer a nueve especies comprendidas en seis órdenes y dos divisiones (Cuadro 1) (Figura 1). Las principales características macroscópicas de estas algas se muestran en el Cuadro 2.
Los miembros de la División Chlorophyta, entre ellos los del Orden Ulvales y Cladosphorales, fueron los principales productores de metabolitos bioactivos, cuyos extractos tanto hexánico como etanólico mostraron los halos de inhibición de mayor tamaño. De los 18 extractos de macroalgas que se ensayaron frente a seis bacterias indicadoras, 13 (72.2%) tuvieron actividad antimicrobiana al menos frente a un patógeno (Cuadro 3), siendo los más sensibles los Gram positivos S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 6633, seguido por el Gram negativo Salmonella Typhimurium ATCC 14028. E. coli ATCC 25922 fue la única bacteria que mostró resistencia a la totalidad de los extractos ensayados. Asimismo, los extractos de Asterfilopsis furcellata y Chondracanthus chamissoi no mostraron ninguna actividad antimicrobiana.
Del total de extractos ensayados, el etanólico de U. nematoidea y U. enteromorpha presentaron halos de inhibición de mayor tamaño y altos porcentajes de inhibición (17.3 y 16.6 mm y 78.2 y 74.1%, respectivamente), en ambos casos frente a cultivos de S. aureusATCC 6538 (Figura 2A); en tanto que los extractos etanólicos de U. lactuca, Polisiphonia sp y U. enteromorpha var. intestinalis mostraron buena actividad, especialmente sobre S. Typhymurium ATCC 14028 (Figura 2B). Cladophora sp fue otra macroalga con mayor bioactividad, inhibiendo al menos 5 de las 6 cepas indicadoras y provocando halos de inhibición considerables, resaltando los extractos etanólicos por su actividad frente a B. subtilis ATCC 6633 (14.5 mm) (Figura 2C) y S. Typhymurium ATCC 14028. Por otro lado, Polysiphonia sp presentó considerable actividad frente a 5 cepas indicadoras, aunque con halos de inhibición de menor tamaño, resaltando entre otros frente a S. Typhymurium ATCC 14028 (10.0 mm). En general, los extractos etanólicos presentaron mejor actividad inhibitoria en comparación a los extractos hexánicos.
Con relación a la actividad inhibitoria de los extractos frente a S. aureus ATCC 6538, el etanólico mostró mejor actividad antibacteriana que el hexánico, alcanzando halos de inhibición media de 8.9 y 5.8 mm de diámetro, respectivamente. Los extractos etanólicos de U. enteromorpha y U. nematoidea presentaron porcentajes de inhibición de 78.2 y 74.1% frente a S. aureus ATCC 6538, respectivamente. En contraste, Chondracanthus chamissoi y Asterfilopsis furcellata no presentaron actividad inhibitoria frente a la misma cepa (Figura 3A).
Frente a Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, al igual que en los casos anteriores, los extractos etanólicos tuvieron mejor rendimiento inhibitorio (una media de 5.5 mm de diámetro de halo de inhibición); en tanto que Cladophora sp fue la que presentó mejor actividad frente a este patógeno (28.9%) (Figura 3B). Los extractos hexánicos de otras macroalgas presentaron baja o ninguna actividad inhibitoria.
Los extractos macroalgales frente a B. subtilis ATCC 6633 tuvieron comportamientos variables. Los extractos etanólicos lograron generar halos de inhibición (7.3 mm); en cambio, los extractos hexánicos mostraron halos de inhibición menores (6.0 mm). El extracto etanólico y el hexánico de Cladophora sp fueron los más efectivos alcanzando porcentajes de inhibición de 52.5 y 35%, respectivamente, mientras el etanólico de U. nematoidea solo alcanzó 33% de inhibición (Figura 3C).
La actividad de los extractos sobre S. Typhimuriun ATCC 14028 fue similar a los casos anteriores. Los halos de inhibición de los extractos etanólico y hexánico alcanzaron medias de 8.0 y 6.2 mm de diámetro, respectivamente. El extracto etanólico de U. enteromorpha y Cladophora sp mostraron 40% de inhibición (Figura 3D).Asimismo, S. Typhimuriun ATCC 14028 se mostró como una de las cepas testigo de mayor sensibilidad a la mayoría de los extractos, tanto hexánico como etanólico, aunque los porcentajes de inhibición fueron bajos.
La actividad de los extractos frente a E. faecalis ATCC 51922 fueron menores en comparación a los anteriores, con medias de halos de inhibición de los extractos hexánico y etanólico de 5.26 y 5.20 mm, respectivamente. Asimismo, los máximos porcentajes de inhibición alcanzados por el extracto etanólico y hexánico de Cladophora sp y U. lactuca fue de 5.6 y 5.0%, respectivamente (Figura 3E). Ninguno de los extractos macroalgales mostraron actividad inhibitoria sobre los cultivos de Escherichia coli ATCC 25922.
De los 47 extractos crudos que mostraron actividad antimicrobiana, el 63.8% corresponden a extractos etanólicos y 36.2% son extractos hexánicos. Por otro lado, S. Typhimurium ATCC 14028 y S. aureus ATCC 6538 fueron las cepas más sensibles a ambos tipos de extractos (Cuadro 3). En general, las macroalgas de la División Chlorophyta presentaron mayor actividad teniendo como principales representantes a U. nematoidea y U. enteromorpha con los mayores porcentajes de inhibición de S. aureus ATCC 6538 (Figura 3A).
El extracto etanólico de Cladophora sp fue elegido por su mayor espectro de actividad para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), el cual fue de 12.5 mg/ml frente a B. subtilis ATCC 6633 y de 25 mg/ml frente a S. aureus ATCC 6538 (Figura 4).
DISCUSIÓN
El potencial antibacteriano de los compuestos algales es atribuido a la presencia de múltiples metabolitos, tales como los dieterpenos en las algas verdes, terpenos halogenados en las rojas y metabolitos mixtos terpeno-aromáticos en las algas pardas (Carvalho y Roque, 2000). Por otro lado, en la extracción de estos metabolitos activos se recurre al uso de diversos solventes orgánicos de diferentes polaridades. La actividad antimicrobiana de amplio espectro de los extractos macroalgales señalados en diversos trabajos (Magallanes et al., 2003; Ríos et al., 2009; Troncoso et al., 2015) y ratificado en el presente, permite afirmar la presencia de metabolitos bioactivos de naturaleza diversa afines a solventes de distinta polaridad, siendo tal vez los extractos etanólicos los de mayor importancia.
Nylund et al. (2008) mencionan que el efecto antimicrobiano de los extractos de macroalgas marinas puede atribuirse al contenido de compuestos fenólicos, entre ellos taninos, flavonoides, terpenos y algunos ácidos grasos que se encuentran presentes en los mismos. Estos metabolitos secundarios presentan una mayor solubilidad en solventes orgánicos polares como el metanol, acetona y etanol. Con estos solventes polares es posible extraer dichos compuestos, los cuales se encuentra unidos a proteínas y sales (Gonzales del Val et al., 2001). Esta afirmación concuerda con el presente estudio, ya que los extractos etanólicos (polar) tuvieron una actividad antibacteriana (63.8%) frente a los extractos hexánicos (apolar) (36.2%).
La polaridad del solvente también es confirmada por Coronado et al. (2015), quienes al evaluar extractos crudos de una macroalga marina encontraron la presencia, entre otros, de alcaloides y glicósidos cianogénicos en extractos etanólicos, mientras que solo detectaron flavonoides en extractos hexánicos. Sin embargo, estos autores consideran que la mayor actividad antibacteriana del extracto etanólico podría deberse a las sales presentes en la macroalga, que al ser componentes hidrofílicos, son fácilmente disueltas en extracciones al emplear un disolvente de mayor polaridad (etanol), originando un ligero incremento de masa en este extracto.
Los extractos etanólicos de las algas de la División Chlorophyta presentaron una mayor acción antibacteriana frente a las bacterias Gram positivas en comparación a las Gram negativas. Similar resultado fue obtenido por Freile-Peligrin y Morales (2004) al evaluar la actividad antimicrobiana de extractos etanólicos de macroalgas de las costas de Yucatán, México. Abu-Ghannam y Rajauria (2013) indican que la susceptibilidad de bacterias Gram positivas al extracto de algas se debe al alto contenido de los metabolitos bioactivos ricos en compuestos fenólicos, terpenoides y alcaloides, que dañan la estructura de la pared celular y su composición; sin embargo, en las Gram negativas, la membrana externa actúa como una barrera que impide el ingreso de sustancias que incluyen antibióticos.
Por otro lado, Dhanya et al. (2016) al evaluar la actividad antimicrobiana de extractos hexánicos de Ulva reticulate frente a patógenos humanos como S. aureus, E. coli, Ps. aeruginosa, S. typhi y B. subtilis determinaron acción eficaz contra todos los patógenos probados, especialmente frente a S. aureus y E. coli. En este sentido, los extractos hexánicos del presente estudio mostraron menor eficacia.
Vila et al. (2007) mencionan que uno de los mecanismos de resistencia bacteriana serían los cambios en la bicapa lipídica, alterando la permeabilidad de la membrana, especialmente por cambios en las porinas. Estas estructuras, en las bacterias Gran negativas, regulan la entrada de algunos elementos externos, entre ellos los compuestos antibacterianos, de allí que cambios en su conformación pueden limitar su paso al espacio periplásmatico. En el presente estudio, los extractos macroalgales no mostraron actividad inhibitoria frente a un Gram negativo como E. coli ATCC 25922, y baja con otras Gram negativas como P. aeruginosa ATCC 9027 y S. Typhimuriun ATCC 14028.Así mismo, Ríos et al. (2009) tampoco encontraron actividad inhibitoria de E. coli con los extractos etanólicos y hexánicos.
Un estudio realizado por Razarinah et al. (2018), utilizando extractos metanólicos del alga verde Halimeda colectada en la Península de Malassia y enfrentadas a cultivos de bacterias Gram positivas y Gram negativas, señalan también mayor actividad inhibitoria de B. subtilis, S. aureus y B. cereus, y mínima o nula actividad frente a Ps. aeruginosa y E. coli. Además, se determinó la Concentración Mínima inhibitoria (CMI) de 18.75; 9.38 y 9.3 mg/ml del extracto frente a B. subtilis, S. aureus y B. cereus respectivamente. En este estudio, el ensayo permitió determinar la CMI de 12.5 mg/ml frente a B. subtilis ATCC 6633 y de 25 mg/ml frente a S. aureus ATCC 6538.
En el presente estudio, los extractos algales tuvieron mayor rendimiento antimicrobiano sobre los Grampositivos; siendo el extracto de U. nematoidea el más eficaz sobre S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 6633 con porcentajes de inhibición de 78.2 y 52.5 % respectivamente. Asimismo, el extracto de U. enteromorpha tuvo una eficacia de 74.1% de inhibición sobre S. aureus ATCC 6538. Resultados que concuerdan con Magallanes et al. (2003), quienes encontraron mayor susceptibilidad a S. aureus ATCC 6636 y S. aureus ATCC 25923 a los extractos etanólicos, aunque no hallaron efecto inhibitorio por efecto de U. nematoide, posiblemente debido al uso de las macroalgas marinas en estaciones diferentes. En este sentido, Marinho-Soriano et al. (2006) llegan a establecer que las especies de algas muestran variaciones muy amplias en su composición química (proteínas, carbohidratos, lípidos, minerales y vitaminas) con relación a factores ambientales como la estación, temperatura, luz, salinidad, etc.Asimismo, la actividad antibacteriana dependería de la sensibilidad del patógeno, del solvente de extracción, de la especie macroalgal (Troncoso et al., 2015), hábitat, estado de desarrollo del alga y método experimental, entre otros (Gutierrez et al., 2016).
De las nueve especies de macroalgas marinas reportadas en el presente estudio, los resultados indican que las especies pertenecientes a la División Chorophyta (Cladophora sp., Ulva nematoidea, Ulva lactuca y Ulva enteromopha var. intestinalis) son macroalgas marinas peruanas con actividad antibacteriana. Las macroalgas pertenecientes a la división Rhodophyta presentaron menor actividad antimicrobiana, principalmente frente a las bacterias Gram positivas. En ambos casos, se tratan de especies intermareales que abundan en nuestro litoral costeño, y dada la importancia de su actividad biológica frente a bacterias patógenas amerita un estudio profundo para conocer aspectos básicos de sus propiedades y posible aplicación en el campo de la salud pública y dentro del marco de la biotecnología marina.
CONCLUSIONES
Los extractos etanólicos de las especies de macroalgas de la División Chlorophyta y Rhodophyta presentan mayor actividad antimicrobiana que sus respectivos extractos hexánicos.
Los extractos de Cladophora sp, Ulva nematoidea, U. lactuca y U. enteromopha var. intestinalis mostraron la mayor actividad antibacteriana, en especial frente a bacterias Gram positivas como Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis; sin embargo, fue menor frente a las Gram negativas o nula como fue el caso de Escherichia coli.