INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Newcastle (ENC) es producida por un Paramyxovirus aviar tipo 1, perteneciente a la subfamilia Paramyxovirinae del género Avulavirus (Lamb et al., 2000; Mayo, 2002). La ENC se encuentra globalmente presente (Nolen, 2002; Abolnik et al., 2004; Pedersen et al., 2004), y ocasiona pérdidas significativas por la mortalidad y sacrificio sanitario de aves (Bogoyavlensky et al., 2009). El virus de ENC (vENC). Por ello, la ENC se encuentra incluida en la lista de enfermedades de declaración obligatoria a la OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal) (Alexander, 2008).
El vENC afecta a la mayoría de las especies aviares (Alexander, 2008). El vENC se replica en el tracto respiratorio, mucosas oculares y tracto digestivo, con un periodo de 2 a 15 días, dependiendo de la cepa viral (Miller et al., 2010). Los signos clínicos pueden ser respiratorios, nerviosos o generales, dependiendo de la virulencia de la cepa, edad del hospedador, estrés ambiental y estado inmunológico, entre otros (Alexander, 2008). Según su patogenicidad, las cepas de vENC pueden clasificarse en velogénicas, mesogénicas, lentogénicas y entéricasasintomáticas, siendo los brotes más agresivos y de alta mortalidad aquellos relacionados a cepas velogénicas (viscerotrópicas o neurotrópicas) (Miller et al., 2010).
En el Perú, el vENC es endémico, afectando no solo a la industria aviar tecnificada, sino además a crianzas informales, por lo que las estrategias para el control de vENC rebasan la capacidad de los productores comerciales. El control del vENC se basa principalmente en las buenas prácticas de bioseguridad en combinación con la vacunación preventiva y eliminación de lotes infectados (Bermudez y Stewart-Brown, 2003). Las vacunas a virus vivo con cepas atenuadas ocasionan una respuesta inmunológica similar a las cepas patógenas sin producir mayores alteraciones clínicas, en tanto que las vacunas inactivadas contienen cepas reactivas, pero inactivadas con agentes químicos, radiación o calor y únicamente producen una respuesta humoral (Gallili y BenNathan, 1998). Estas vacunas reducen la sintomatología clínica pos-desafío, pero no son 100% protectoras, dado que no detienen la infección ni la excreción viral. Asimismo, la vacunación requiere de varias dosis, lo que puede generar estrés y problemas sanitarios en las aves (Kapczinsky et al., 2013).
El desarrollo biotecnológico ha llevado al uso de vacunas vectorizadas, las cuales han sido incorporadas a la lista de vacunas contra vENC debido a las ventajas que poseen sobre las vacunas convencionales. La mayoría de las vacunas vectorizadas contra ENC se basan en la inserción de la secuencia génica de la proteína de fusión (F) del vENC en un vector viral como, por ejemplo, Herpesvirus de Pavo (HVT), en el cual se pueden mutar o borrar secuencias de su genoma viral sin debilitar o alterar las funciones necesarias del virus para su replicación (Post y Roizman, 1981; Shih et al., 1984; Lowe et al., 1987). Entre las ventajas de este tipo de vacunas se encuentra la inducción de una inmunidad duradera, debido a la latencia del vector en el hospedador de no interferir con la presencia de anticuerpos maternales y de producir una reducción en la cantidad de virus eliminado por las aves (Palya et al., 2012, 2014), por lo que su aplicación reduciría considerablemente la transmisión horizontal entre las aves. Por todo ello, presente estudio evaluó la eficacia de una vacuna vectorizada contra vENC aplicada en planta de incubación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar y Fecha de Estudio
La fase experimental del estudio se realizó en los módulos de crianza controlada y las necropsias y pruebas serológicas en el Laboratorio de Patología Aviar de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (FMVUNMSM), ubicados en Lima, Perú. La fase experimental se realizó en marzo y abril de 2012 y tuvo una duración de 42 días.
Diseño Experimental
Se conformaron cuatro grupos experimentales correspondientes a los siguientes programas de vacunación contra vENC: T1: Vacuna viva atenuada + vacuna inactivada, T2: Vacuna viva atenuada, T3: Vacuna viva atenuada + vacuna vectorizada, T4: Grupo control no vacunado.
Todas las vacunaciones contra vENC en las aves de los grupos T1, T2 y T3 se realizaron en la planta de incubación al primer día de edad. La vacuna vectorizada (Laboratorios CEVA) en las aves de T3 consistió en la secuencia génica de la proteína F (cepa lentogénica D26) insertada en el vector HVT (cepa FC 126 Witter-bajo pasaje), mientras que la vacuna viva atenuada en las aves de T1 y T2 consistió en una cepa enterotrópica (Villegas Glisson/University of Georgia en T1 y Phy LMV42 en T2). Ese mismo día las aves de los cuatro grupos fueron vacunadas contra los virus de Bronquitis Infecciosa (cepa H120), de Enfermedad de Marek (cepa HTV) y de Gumboro. Los grupos T1 y T2 recibieron adicionalmente una vacuna viva atenuada contra vENC a los 9 días.
Animales y Tamaño Muestral
Se utilizaron 200 pollitos BB de la línea Ross, procedentes de una granja tecnificada al sur de Lima. Las aves fueron aleatoriamente distribuidas en los cuatro grupos (n=50 aves por grupo). El tamaño muestral consideró una diferencia mínima esperada no menos de 30% de porcentaje de mortalidad de las aves que recibieron la vacuna vectorizada (T3) y de las aves que recibieron la vacuna viva atenuada (T1 y T2), con una potencia estadística de 90% y un nivel de significancia de 5% para una prueba de 2 colas.
Crianza Experimental
Las aves fueron instaladas en los módulos de crianza controlada por un periodo de 42 días bajo alimentación con una formulación comercial para pollos de engorde y agua ad libitum. Los grupos experimentales estuvieron conformados por cinco repeticiones de 10 aves cada uno, los cuales estuvieron en corrales contiguos separados por mallas metálicas.
El día 26 del estudio se realizó el desafío viral en todas las aves mediante la aplicación ocular de 60 µl de un inóculo conteniendo un virus patógeno de vENC con un título de 107.8 DIE 50 correspondiente a una cepa velogénica Genotipo XII, clase II, IPIC 1.82, aislada de un pavo real.
Parámetros de Evaluación
Se registró la presencia de estornudos y ronqueras posterior a la vacunación en las aves de forma diaria hasta el día 21 del estudio.
Se registró la presencia de signos clínicos en los días 4, 6 y 12 pos-desafío viral y se tomó en cuenta los cuadros de depresión, diarrea, signos respiratorios (ronqueras) y signos nerviosos, según las recomendaciones del OIE (Alexander, 2008).
Se realizó la necropsia a las aves muertes y se describieron las principales lesiones halladas en el proventrículo, molleja, intestinos, tonsilas cecales y bazo.
Se tomaron muestras de sangre de 15 aves de cada grupo experimental el día 42 del estudio para determinar los títulos de anticuerpos contra vENC mediante un kit de ELISA comercial (Laboratorios IDEXX).
Se registró la mortalidad de las aves desde el pos-desafío (día 26) hasta el día 42 del estudio.
Análisis Estadístico
Las frecuencias de las reacciones posvacunales de cada grupo experimental fueron evaluadas mediante la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis. Se determinó el número total de aves muertas pos-desafío y los porcentajes de mortalidad acumulada (número de aves muertas/total de aves al inicio del desafío) entre grupos vacunales (T1, T2 y T3) fueron comparados mediante una ecuación de regresión logística para el cálculo de Odds Ratio (OR) y los intervalos de confianza al 95%.
La presencia de signos clínicos durante los días 4, 6 y 12 pos-desafío fue presentada utilizando frecuencias absolutas y relativas y comparadas entre los grupos vacunales mediante la prueba de Fisher Exacta. Los títulos de anticuerpos medidos en ELISA fueron reportados utilizando media aritmética, media geométrica, coeficiente de variación y valores mínimo y máximo para cada grupo experimental. Todos los análisis fueron realizados con el programa estadístico RStudio v. 1.0.143. Valores de p<0.05 fueron considerados estadísticamente significativos.
RESULTADOS
Reacciones Pos-vacunales
Las reacciones pos-vacunales se presentaron a partir del día 5, siendo más altas entre los días 9 y 12 (entre 55 y 65% de aves afectadas) y dejaron de aparecer a partir del día 18, sin diferencias significativas entre los grupos vacunados (p=0.438). No se observó reacción alguna en el grupo control no vacunado.
Mortalidad Pos-desafío
Dos aves de T1 y un ave de T2 murieron previo al desafío. Las aves de los grupos que recibieron vacunas vivas atenuadas (T1 y T2) presentaron los porcentajes de mortalidad más altos (12.5 y 18.4%, respectivamente) en comparación con las aves que recibieron la vacuna vectorizada de vENC (2%). Todas las aves del grupo control (T4) murieron luego del desafío (Cuadro 1).
1 T1: vacuna viva atenuada + vacuna inactivada; T2: vacuna viva atenuada; T3: vacuna viva atenuada + vacuna vectorizada; T4: control no vacunado
El análisis de regresión logística demostró un efecto protector sobre la mortalidad en las aves con la vacuna vectorizada (T3) en comparación a las aves de T1 (OR: 0.14, IC 95%: 0.02-1.23, p=0.077) y las aves de T2 (OR: 0.09, IC 95%: 0.01-0.75, p=0.030).
Las mortalidades acumuladas entre las aves de T2 y T1 no fueron estadísticamente diferentes (p=0.427).
Signos Clínicos Pos-desafío
La depresión se manifestó principalmente en las aves del grupo T2 al día 4 y 6 pos-desafío (16.3 y 14.9%, respectivamente). No se observaron signos de depresión al día 12 del desafío. La presencia de diarrea se observó igualmente durante los días 4 y 6 pos-desafío, siendo más alta en las aves de T2 (14.3 y 44.7%, respectivamente) y menor en las aves que recibieron la vacuna vectorizada (2.0 y 8.0%, respectivamente), habiendo diferencias significativas entre grupos en el día 6 (p=0.001; Cuadro 2).
Las ronqueras se presentaron a partir del día 4 pos-desafío en los tres grupos vacunales, siendo más alta en el día 6 del desafío en las aves de T1 y T2 (61.7 y 57.5%, respectivamente) que en el grupo con la vacuna vectorizada (28.0%) (p=0.001). Secuelas neurológicas solo se observaron en el día 12 pos-desafío y en baja frecuencia (Cuadro 2), sin diferencias significativas entre grupos.
Lesiones Pos-desafío
En las aves del grupo control no vacunado se observaron zonas de hemorragia difusa o severa en proventrículo, molleja, intestino y tonsilas, así como congestión del bazo y esplenomegalia (Figura 1). En las aves de T1 y T2 (vacunas vivas atenuadas) se presentaron focos de hemorragia leve a severa en el proventrículo, agregados linfoides en intestino, tonsilas y esplenomegalia, mientras que en las aves T3 (vacuna vectorizadas) se observaron focos hemorrágicos en tonsilas cecales, pero no se observaron hemorragias en proventrículo o intestino (Figura 2).
Títulos de Anticuerpos
Los títulos de anticuerpos contra el vENC en el día 42 (16 pos-desafío) fueron más altos en las aves con las vacunas vivas atenuadas (T2: 9037 y T: 7811) en comparación a las aves que recibieron la vacuna vectorizada (T3: 4280), habiendo diferencias significativas entre T1 y T3 (p=0.018) y entre T2 y T3 (p=0.001 (Cuadro 3).
DISCUSIÓN
Las cepas velogénicas del vENC constituyen una amenaza importante para la industria avícola, ocasionando hasta 100% de mortalidad en aves sin inmunidad (Alexander, 1995; Miller y Koch, 2013). La vacunación y bioseguridad constituyen las principales herramientas para el control de vENC, aunque la aparición de brotes recurrentes de enfermedad puede indicar fallas en los programas de vacunación (Alexander, 2008). Diversos factores y condiciones inmunosupresoras, así como la virulencia de las cepas actuales circulantes pueden afectar la calidad de la vacunación en campo (Perozo et al., 2008; Rauw et al., 2010). Por ello, la avicultura moderna busca que los sistemas de vacunación se realicen en planta de incubación, donde el proceso es controlado y exento de condiciones medioambientales desfavorables (Palya et al., 2012). Los resultados del estudio sugieren que el uso combinado de una vacuna vectorizada y una vacuna viva atenuada contra vENC aplicada en pollos de un día de edad proporciona altos niveles de protección contra mortalidad y signos clínicos luego del desafío viral, por lo que puede proporcionar una alternativa para el control de la ENC en campo.
Las reacciones pos-vacunales se presentaron en todas las aves de los grupos vacunados a partir del día 5; posiblemente a las vacunas vivas atenuadas, debido a que producen cierto grado de replicación en el tracto respiratorio y/o intestinal (Perozo et al., 2008). El uso de cepas lentogénicas de baja virulencia como B1 y La Sota induce buena protección si son administradas correctamente, aunque tienden a producir reacciones pos- vacunales, especialmente bajo condiciones medioambientales adversas (Alexander, 2001). No obstante, las reacciones observadas podrían deberse, además, al efecto de las otras vacunas que fueron administradas. Por otro lado, si bien es posible que ciertas reacciones pos-vacunales pueden afectar los parámetros productivos (no evaluado en este estudio), el alto nivel de protección producido por la adición de la vacuna vectorizada en el esquema de vacunación contra vENC (cercano a 98%) proporciona un beneficio de mayor impacto para la crianza.
Los niveles de protección de la vacuna vectorizada de vENC fueron altos y similares a los reportados en otros estudios. Así, Esaki et al. (2013), utilizaron la vacuna vectorizada HTV/ND (genotipo I) y desafiando a las aves con la cepa Texas GB (genotipo II) tuvieron porcentajes de protección de 90%. La mortalidad en las aves que recibieron la vacuna vectorizada fue de 2% y, además, la más tardía en iniciarse (día 12 pos-desafío), aun cuando la cepa de desafío era de un genotipo diferente al de la cepa vacunal. Esto demuestra que pese a la distancia filogenética entre el gen F del vENC insertado en el vector HTV y el virus de desafío (genotipos I y V, respectivamente), la vacuna vectorizada de vENC proporcionó una buena protección clínica. Todas las cepas del vENC pertenecen a un solo serotipo, por lo que cualquier cepa se puede utilizar como vacuna y todas deberían prevenir los signos clínicos y la mortalidad por vENC. No obstante, se conoce que las vacunas homólogas al virus de desafío protegen mejor que las vacunas con genotipos heterólogos (Miller et al., 2009; Miller y Koch, 2013).
Las lesiones observadas en las aves muertas fueron características de las ocasionadas por cepas velogénicas viscerotrópicas de vENC (Alexander, 2008, Miller y Koch, 2013). Estas lesiones fueron de menor magnitud en las aves que recibieron vacunas vivas atenuadas debido a la replicación viral local por esas cepas. Por otro lado, las aves que recibieron la vacuna vectorizada de vENC no presentaron lesiones hemorrágicas en el tracto gastrointestinal, posiblemente debido a la fuerte protección producida descrita en estudios previos (Miller y Koch, 2013). Asimismo, los menores títulos de anticuerpos contra vENC en las aves que recibieron la vacuna vectorizada se debió a la fuerte estimulación de la respuesta inmune celular producida por estas vacunas, la cual parece ser el principal determinante de protección contra el desafío viral (Palya et al., 2012).
Uno de los problemas para el uso de las vacunas vectorizadas en la industria aviar es el tiempo requerido para se desarrolle una buena inmunidad protectora. Estudios previos demuestran porcentajes de protección de 57 a 81% cuando el desafío se realiza al día 20, en comparación a 98% cuando el desafío se realiza a partir del día 27 (Palya et al., 2012), similar a resultados del presente estudio.
CONCLUSIONES
Se obtuvo una buena protección de la vacuna vectorizada de vENC, consiguiendo menor mortalidad y frecuencia de signos clínicos pos-desafío.
Los resultados sugieren que el uso de vacunas vivas entéricas en zonas de alto riesgo no es suficiente para inducir una buena inmunidad frente al desafío con cepas patógenas.