INTRODUCCIÓN
La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y los animales causada por microorganismos de dos especies de Salmonella (S. enterica y S. bongori) (Gawade y Ghosh, 2018; OIE, 2019), de la familia Enterobacteriaceae, y se caracterizan por ser bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos (Du-San et al., 2016). Entre sus estructuras antigénicas más importantes se encuentran el antígeno somático (O), que son cadenas laterales del lipopolisacárido (LPS) (Kiflu et al., 2017), el antígeno flagelar (H), el cual es una estructura compleja que consiste en un cuerpo basal, un segmento de unión («hook») y un filamento constituido por flagelina, y el antígeno capsular (Vi) (Kiflu et al., 2017). Estas estructuras permiten caracterizar a los serotipos de este género bacteriano.
Los reptiles silvestres y algunas masco-tas, especialmente las tortugas, son conocidos por ser portadores asintomáticos de algunos serotipos de Salmonella (Nakadai et al., 2005; Basler et al., 2015; Bosch et al., 2016; Du-San et al., 2016), capaces de infectar al humano, ocasionando cuadros que cursan desde una gastroenteritis moderada hasta complicaciones severas como septicemia o meningitis, particularmente en infantes, ancianos o personas inmunosuprimidas (Basler et al., 2015; Bosch et al., 2016).
Las tortugas del género Trachemys pertenecen al orden Testudines. Se les conoce como galápagos de Florida o tortugas de orejas rojas. Existen pocos estudios sobre enfermedades en esta especie, y se centran fundamentalmente en Salmonella, agente patógeno que más los afecta. Las infecciones por Salmonella enterica constituyen un problema de salud animal y pública (Basler et al., 2015; Du-San et al., 2016), y entre los serotipos aislados en reptiles se pueden nombrar a S. Arizonae en Mexico, S. Paratyphi B en Japón, S. Newport, S. Arizonae y S. Enteritidis en EEUU y S. Javiana en Perú, entre otros (Nakadai et al., 2005; Pachón, 2009; Campos et al., 2020; Bosch et al., 2016).
Las pruebas de sensibilidad deben realizarse siempre sobre microorganismos asociados a infecciones, ya que estos pueden presentar mecanismos de defensa frente a agentes antimicrobianos como la producción de enzimas inactivantes, alteraciones en el sitio de blanco acción y modificaciones en el ingreso o el eflujo de las drogas (Quesada et al., 2016). En el caso particular de Salmonella spp se ha descrito la presencia de una isla genómica que le brinda resistencia frente a todos los antibióticos útiles para su tratamiento (Mitchell y Shane, 2001). El presente estudio tuvo como objetivo determinar los serotipos y el perfil de sensibilidad de cepas de Salmonella Enterica aisladas de tortugas de orejas rojas (Trachemys sp) provenientes de dos centros de crianza en Lima, Perú.
MATERIALES Y MÉTODOS
Localización
La investigación se llevó a cabo en el Parque Zoológico Huachipa, con una temperatura promedio de 24 °C y humedad de 78%, y en el Colegio La Inmaculada, el cual presenta una temperatura promedio de 22 °C y humedad de 88%, ambos en Lima, Perú. Las dos instituciones son centros de crianza de animales silvestres, entre los que destacan las tortugas Trachemys sp.
Población y Muestra
El estudio se desarrolló con 51 animales del Parque Zoológico, los cuales se encontraban distribuidos en tres ambientes, de acuerdo con el tamaño de los ejemplares, y con 15 animales del Colegio de la Inmaculada que eran criados en un solo ambiente. Todos los animales se encontraban en aparente buen estado de salud.
Aislamiento de Salmonella (OIE, 2019)
Toma de muestras: Se colectaron muestras de la cloaca con un hisopo. Las muestras fueron conservadas en un medio de transporte bacteriano Stuart (Merck), y trasportado a temperatura de refrigeración (4 °C) al laboratorio.
Enriquecimiento selectivo: Se realizó en dos tiempos. Primero, la muestra se inoculó en caldo Tetrationato incubándose a 41 ºC por 24 horas, para luego sembrarse en agares específicos. En el segundo enriquecimiento, el caldo Tetrationato remanente del primer enriquecimiento se mantuvo a temperatura ambiente por 5 días, luego de lo cual se extrajo 1 ml de cada suspensión y se inoculó en un nuevo tubo con caldo Tetrationato para incubarse a 37 °C por 24 horas. Las muestras fueron luego sembradas en agares específicos (Mitchell y Shane, 2001).
Siembra en placas: Se tomó una muestra de los caldos de enriquecimiento con un ansa de siembra y la siembra se hizo por agotamiento en medios sólidos específicos: agar Salmonella-Shigella (SS) y agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD). Las colonias características se utilizaron para realizar las pruebas bioquímicas correspondientes.
Identificación Bioquímica
Las colonias resultantes fueron teñidas con Gram. Las bacterias bacilares gramnegativas fueron sometidas a pruebas bioquímicas, considerándose positivas a Salmonella enterica si cumplían los siguientes requisitos: positivo al uso del citrato, capaz de fermentar la glucosa produciendo gas, genera H S a partir del tiosulfato, presenta flagelos que le brindan movilidad y posee las enzimas catalasa y lisina descarboxilasa; sin embargo, no fermenta lactosa, ni sacarosa y carece de las enzimas triptofanasa, ureasa y citocromo oxidasa.
Serotipificación de Salmonella enterica
Se realizó en el laboratorio de investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México, y está basada en la determinación de los antígenos O (somáticos) y H (flagelares), siguiendo el esquema de Kauffmann-White (Marin et al., 2016; Kiflu et al., 2017).
Serotipificación somática: La caracterización del serogrupo O de Salmonella spp se desarrolló en lámina, a partir de cultivos frescos (24 horas en agar tripticasa de soya, incubado a 37 °C). Previamente se verificó que el cultivo se encuentre en forma lisa, por ausencia de aglutinación con solución salina al 2% en una lámina. En una lámina portaobjetos se enfrentó una pequeña cantidad del cultivo con una gota de los antisueros polivalentes OS-A y OS-B (contienen cerca del 98% de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales). Estos antisueros polivalentes cumplen la función de una primera selección de serogrupos. La lectura se realizó con el uso de una luz indirecta, observándose la aglutinación respectiva. En los casos positivos de aglutinación con alguno de los antisueros polivalentes, se probaron los antisueros de grupo O correspondiente hasta encontrar la aglutinación especifica.
Serotipificación flagelar. La caracterización antigénica flagelar se hizo a partir de un cultivo en 5 ml de caldo flagelar incubado a 37 ºC durante 24 horas. Al caldo flagelar se le agregó 5 ml de solución fisiológica fenolada al 1%. En cuatro tubos de ensayo se colocó una gota de cada uno de los antisueros flagelares polivalentes (HS-1, HS-A, HS-B y HS-C) y se agregó 0.5 ml del caldo fenolado. Se incubó por 1 hora a 50 °C en baño de maría. Finalmente se observó la presencia o ausencia de aglutinación con luz indirecta.
En el caso de aglutinación positiva con dos antisueros polivalentes se trata de una serovariedad difásica (la gran mayoría) y se debe enfrentar con los antisueros de fase H correspondientes. Si el antisuero de fase flagelar está compuesto por más de un factor, se debe determinar el factor H correspondiente (antisueros de factores H, H:h y H:2).
En el caso de aglutinación positiva con un solo antisuero polivalente flagelar, podría tratarse de una serovariedad monofásica, o que sea una serovariedad difásica, y se expresa únicamente una sola fase H. Por lo tanto, es necesario poner en evidencia la fase no detectable, usando el «Método de inversión de fase», que consiste en inmovilizar la fase flagelar expresada mediante el agregado del antisuero de fase correspondiente, para permitir la expresión de la otra fase flagelar.
Susceptibilidad Antibacteriana
Se realizó según el método de Kirby Bauer. Las cepas aisladas fueron suspendidas en solución salina fisiológica ajustándolas a una turbidez de 0.5 del estándar de McFarland. Posteriormente fueron sembradas en placas de agar Muller Hinton (Merck) y se confrontaron a nueve discos de antibacterianos:Ampicilina (10 µg), Cloranfenicol (30 µg), Sulfa Trimetroprim (25 µg), Estreptomicina (10 µg), Amoxicilina/Ácido clavulánico (20/10 µg), Ácido nalidíxico (30 µg), Norfloxacina (5 µg), Enrofloxaxicina (5 µg) y Penicilina (10 U) (Oxoid). Los antibacterianos utilizados han sido reportados en el tratamiento de Salmonella enterica por el Instituto Nacional de Salud (INS, 2002). Las placas se incubaron a 37 °C por 18 horas y la interpretación se realizó en base al halo de inhibición. Se clasificaron como sensibles, intermedias o resistentes según los valores descritos por la guía del Instituto de Estándares Clínicos y Laboratorio (CLSI, 2005)
RESULTADOS
Se muestrearon 66 animales, 15 provenientes del Zoológico del Colegio de la Inmaculada (ZCI) y 51 del Parque Zoológico Huachipa (PZH) obteniéndose cuatro cepas positivas a Salmonella enterica (Cuadro 1).
Se utilizaron dos métodos de enriquecimiento (estándar y tardío), siendo ambos enriquecidos en caldos selectivos (selenito y tetrationato). Los cuatro resultados positivos a Salmonella enterica fueron aislados del caldo tetrationato; sin embargo, dos de ellos se obtuvieron utilizando el método estándar y los otros dos utilizando el método de enriquecimiento tardío.
La serotipificación de las cepas indicó que pertenecían a serovariedades diferentes; las procedentes del Colegio de la Inmaculada eran S. Infantis (O 6, 7 r: 1, 5), mientras que las aisladas del Parque Zoológico Huachipa eran S. Saintpaul (O 4, 12 e, h: 1, 2).
La prueba de sensibilidad a antibacterianos indicó que las dos cepas de S. Saintpaul eran resistentes únicamente a penicilina y sensibles a los demás antibacterianos, mientras que las cepas S. Infantis resultaron resistentes a cloramfenicol, amoxicilina/ácido clavulánico, ampicilina y penicilina, y sensibles a ácido nalidixico, norfloxacina, y enrofloxacina. Así mismo, una cepa de este serovar fue resistente a estreptomicina y sulfatrimetroprim y la otra fue sensible.
DISCUSIÓN
El presente estudio reporta que 6.1% (4/66) de las tortugas muestreadas resultaron positivas a Salmonella enterica a nivel de la cloaca (Cuadro 1), siendo este resultado diferente a los múltiples reportes en reptiles y otros animales, donde se encuentran frecuencias de hasta 74% de aislamiento en muestras clínicas (Sá y Solari, 2001; Nakadai et al., 2005; Sealinger et al., 2006; Toledo, 2009; Pachón, 2009; Villena et al., 2010; Matsuura et al., 2010; Morales et al., 2012; Campos et al., 2020; Espinoza y MoralesCauti, 2019; Salazar et al., 2019); variaciones que pueden ser debidas a la procedencia y estado de los animales. Sá y Solari (2001) y de Nakadai et al. (2005), reportaron prevalencias elevadas al trabajar con animales cuyas condiciones de crianza eran deficientes, mientras que Toledo (2009), Pachón (2009) y Campos et al. (2020) obtuvieron prevalencias relativamente bajas ya que los animales evaluados procedían de tiendas y parques de conservación con ambientes adecuados.
La presencia de esta bacteria en la cloaca de las tortugas se debe a excreción activa o por contacto de agua contaminada, debido a que estos animales comparten el ambiente con otras tortugas, convirtiéndose en portadores asintomáticos de Salmonella enterica (Morales et al., 2012; Basler et al., 2015; Kiflu et al., 2017; Salazar et al., 2019). Este contacto podría afectar a otros animales por la contaminación del medio ambiente (DuSan et al., 2016), y desarrollar la condición de portadores (Basler et al., 2015; Espinoza y Morales-Cauti, 2019).
Para este estudio se utilizaron dos caldos de enriquecimiento (Selenito y Tetrationato), y además se realizó un enriquecimiento estándar y otro tardío, buscando incrementar la tasa de recuperación de esta bacteria (Mitchell y Shane, 2001; Espinoza y Morales-Cauti, 2019). Existe evidencia de este procedimiento de aislamiento como el reporte de Waltman et al. (1991) quiénes lograron un incremento de 64%. Para el presente estudio, se logró aislar dos cepas de salmonelas adicionales a los aislados con el método tradicional, incrementándose así en un 100% el aislamiento convencional. Esto permite corroborar la utilidad de este método (Espinoza y Morales-Cauti, 2019), tanto para trabajos de investigación como para la vigilancia de las infecciones por Salmonella.
Este estudio reporta serotipos de Salmonella enterica que se encuentran frecuentemente en animales homeotermos, y que son causantes de la mayoría de casos de salmonelosis (Mitchell y Shane, 2001; Matsuura et al., 2010; Kiflu et al., 2017). Sin embargo, los serovares reportados en los animales poiquilotermos han sido aislados desde pacientes con salmonelosis asociada a reptiles (Sá y Solari, 2001; Du-San et al., 2016; Kiflu et al., 2017; Salazar et al., 2019), y cuyas características bioquímicas muestran diferencias; por lo tanto en este estudio es posible que hubiera un mayor número de muestras cloacales positivas a estos serovares.
El presente estudio reporta dos serotipos (Infantis y SainPaul); lo cual difiere con hallazgos reportados por otros autores, donde sus aislamientos son múltiples y variados: S. Albany, S. Enteritidis, S. Montevideo, S. Newport, S. Typhimurium S. Arizonae, S. Selby, S. Bere, S. Shamba, S. Pomona, S. Poona, S. Arizona y S. Javiana, entre otros (Sá y Solari, 2001; Mitchell y Shane, 2001; Nakadai et al., 2001; Pachón, 2009; Campos et al., 2020; Bosch et al., 2016; Marin et al., 2016; Salazar et al., 2019). Esta amplia variedad se debe a la naturaleza del género Salmonella, y a características medio ambientales relacionadas a las especies en estudio como procedencia de los animales, hábitat, densidad y altitud, entre otros factores (Basler et al., 2015; Marin et al., 2016). Estos aislados suelen representar un riesgo para la salud pública, como se corrobora con brotes ocurridos en Estados Unidos de S. Saintpaul en 2013 y S. Infantis en 2012, 2015 y 2017 (OIE, 2019; CDC, 2013; Kiflu et al., 2017).
El tratamiento de los reptiles positivos a Salmonella es controversial, ya que los antibacterianos pueden afectar la microbiota y suprimir la detección de la bacteria en las heces, lo cual favorecería su persistencia a nivel intestinal e incrementaría la aparición de cepas resistentes (OIE, 2019). Se ha reportado el uso de antibacterianos como ampicilina, amoxicilina, sulfametoxasol + trimetropin, cloranfenicol, fluorquinolonas y cefalosporinas de tercera generación (Matsuura et al., 2010; Sacsaquispe y Velásquez 2002; OIE, 2019), siendo estreptomicina y sulfa + trimetroprim la alternativa de uso terapéutico por la susceptibilidad mostrada.
Finalmente, los reptiles aparentemente sanos y adaptados raramente sufren esta enfermedad, por lo que el riesgo de transmisión hacia las personas puede ser bajo, pero potencialmente presente de forma directa o indirecta. Es por eso que para evitar la propagación de esta bacteria, y dado que los reptiles pueden ser portadores, es imprescindible mantenerlos en condiciones fisiológicas óptimas (Basler et al., 2015; Marin et al., 2016; Kiflu et al., 2017), y evitar el contacto a partir del tráfico ilegal. Asimismo, se debe replantear la estrategia de control de este problema de salud pública de larga data, utilizando un enfoque de «Una Salud» (Bosch et al., 2016).
CONCLUSIONES
Se aisló e identificó cepas de S. enterica Infantis (O6,7:r:1,5) y S. enterica SaintPaul (O4,12:e,h:1,2) de dos centros de crianza de tortugas de orejas rojas (Trachemys sp), siendo este el primer hallazgo en el país.
El enriquecimiento tardío aumenta los niveles de aislamiento de cepas de Salmonella enterica a partir de muestras clínicas de tortugas.
S. SaintPaul fue sensible a la mayoría de los antibióticos evaluados, mientras que S. Infantis fue sensible a tres de los siete antibióticos trabajados.