INTRODUCCIÓN
La transferencia embrionaria es una biotecnología alternativa para el mejoramiento genético utilizando individuos superiores, que viene siendo estudiada para su adecuación a las características fisiológicas reproductivas particulares de los camélidos sudamericanos (Huanca, 2005). La recuperación de embriones se realiza mediante la técnica no quirúrgica el día 7 pos-cópula, realizando lavado uterino vía transcervical con ayuda manual desde el recto, y utilizando catéteres de doble vía y medio de lavado enriquecido, bajo anestesia epidural y eventualmente aplicando tranquilizantes al animal (Trasorras, 2012; Sumar, 2013). La transferencia se realiza depositando el embrión directamente en el cuerno ipsilateral al cuerpo lúteo (Carnero et al. 2011).
La respuesta super ovulatoria en camélidos sudamericanos se caracteriza por ser extremadamente variable e impredecible, dado que existen factores como especie, raza, edad, lactancia, condición corporal, preparados hormonales y protocolos, entre otros, que tendrían efecto directo en esta respuesta (Ratto et al., 2013; Sumar, 2013). De forma similar a otras especies, la técnica de multiovulación y transferencia de embriones fue adaptada para su aplicación en alpacas (Bourke et al., 1995); sin embargo, en promedio, solo el 33.5% de las hembras responden satisfactoriamente a la super ovulación, y muchas de ellas producen ovocitos con desarrollo anormal, deficiente maduración nuclear y citoplásmica, lo que afecta las tasas de fertilización (Vaughan et al. 2013).
La hormona eCG produce alta respuesta super ovulatoria, alrededor del 82% en llamas durante la fase lútea artificial (Bourke et al., 1994), pudiendo obtenerse super ovulaciones con dosis repetidas de eCG (Correa et al., 1997). En los casos que se utiliza la fase lútea natural se obtienen mejores resultados, con dosis que varían de 500 hasta 1000 UI; sin embargo, dosis mayores están relacionadas a bajas tasas de recuperación de embriones por un desplazamiento de la bolsa ovárica debido al gran tamaño del ovario super estimulado (Trasorras et al., 2012). El tratamiento de alpacas con 400 UI de eCG resulta en la producción de cuatro embriones por alpaca donadora (Huanca et al. 2012), en tanto que dosis entre 500 a 750 UI de eCG en una sola aplicación resultan en una alta cantidad de folículos (Novoa et al., 1999).
La colección de embriones de ovulaciones naturales (sin tratamiento de super ovulación) es una alternativa eficiente para producir crías a través de la transferencia de embriones en camélidos sudamericanos (Von Baer et al., 2003), obteniéndose una tasa de recuperación de embriones de alpaca de 58.3% (Pacheco et al., 2016), y de 60% en llamas, realizando la colecta de embriones fuera de época reproductiva (Pacheco et al., 2015).
Bajo tales consideraciones, el presente estudio tuvo como objetivos evaluar la tasa de recuperación embrionaria, la calidad de los embriones de llama colectados de super ovulación y ovulación simple, y la fertilidad y natalidad de la transferencia de embriones frescos durante la época reproductiva y no reproductiva bajo condiciones de campo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar de Ejecución y Animales
El trabajo fue desarrollado en la Estación Experimental IVITA Maranganí Fundo La Raya, de la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, ubicada en la región agroecológica de puna húmeda, Cusco, Perú, a 4200 msnm.
Se utilizaron 45 llamas como donadoras de embriones, adultas (5-9 años), con peso vivo promedio de 100 kg, adecuado historial reproductivo y mantenidas sobre pasturas naturales. Los animales fueron distribuidos en dos grupos, según el tipo de producción de embriones: Grupo I, ovulación simple, n=30) y Grupo II, super ovulación, n=15. Las hembras del grupo I fueron sometidas a lavado uterino hasta en tres oportunidades, las hembras del grupo II solo fueron sometidas por
dos oportunidades; sin embargo en ambos grupos se descartaron algunas hembras que presentaron problemas como metritis. Además, se utilizaron 89 hembras receptoras. Todas las hembras utilizadas (donadoras y receptoras) fueron seleccionadas previa evaluación ecográfica ovárica, debiendo tener folículos preovulatorios, ausencia de metritis y de quistes foliculares o luteales, amplitud de pelvis, condición corporal 2-3 y cría en pie. Todas fueron mantenidas en pasturas naturales y condiciones de campo. La transferencia a las receptoras se hizo a los 8 días pos-inducción de la ovulación. Para las evaluaciones ecográficas se utilizó un ecógrafo portátil, con un transductor lineal transrectal de 5 MHz, marca Esaote-Pie Medical, Modelo Tringa Linear® (Italia).
Se consideró época reproductiva a los meses de diciembre a abril (temporada lluviosa) y época no reproductiva a los meses de mayo a noviembre (temporada seca). Los lavados uterinos para colectar embriones y las transferencias fueron realizados directamente en el campo, bajo un cobertizo, simulando las condiciones de crianza del productor altoandino promedio.
Tratamientos
Para la ovulación simple, las hembras donadoras fueron ecografiadas el día 0, determinando la presencia de un folículo preovulatorio, el día 1 se empadraron con un macho de fertilidad comprobada, el día 8 se realizó la colecta y transferencia embrionaria y el día 28 se realizó el diagnóstico de gestación mediante ecografía.
Para la super ovulación se realizó la verificación de la presencia de folículo preovulatorio mediante ecografía. En el día 1 se administró 8.4 µg de acetato de buserelina (Conceptase®, Agrovet Market) (día 1), el día 4 se aplicó 500 UI de eCG (Novormon®, Syntex), el día 8 se aplicó análogo de PgF2á (0.025 mg) (Prostal®, Agrovet Market) para inducir luteólisis, el día 11 se realizó la primera monta natural y se aplicó 8.4 µg de acetato de buserelina (Conceptase®, Agrovet Market) en presencia de un folículo preovulatorio (>7 mm), en el día 12 se repitieron las montas, en el día 19 se realizó el lavado uterino para recuperar los embriones y realizar la transferencia, y el día 39 se realizó el diagnóstico de gestación mediante ecografía.
Previo al lavado se aplicó 0.2 mg/kg de xilacina (Xilagal®, Galmedic) vía IM y 1 ml de lidocaína al 2% (Lidomic®, Microsules) vía epidural. Se realizó la técnica no quirúrgica mediante el uso de una sonda de Foley N.° 18 para el lavado uterino. Se utilizó 100 ml de medio por lavado (Boviflush®, Minitube) (tres lavados) y se recuperó el fluido en un filtro EmCon. Al término del lavado se aplicó a las hembras donadoras una dosis de análogo de prostaglandina.
Embriones y Transferencia
La búsqueda de los embriones se realizó con ayuda de un estereoscopio con platina temperada a 35 °C. Los embriones fueron colocados en medio de mantenimiento temperado (Holding®, Syngro). Solo se utilizaron para la transferencia aquellos embriones de grado 1, según la evaluación descrita por Trasorras et al. (2017), basada en la clasificación de Tibary et al. (1997, 2015).
La transferencia de los embriones se realizó por el método no quirúrgico, utilizando un aplicador de embriones con transfit de punta metálica. El embrión se colocó en una pajilla de 0.25 ml en medio de mantenimiento y se depositó en el cuerno izquierdo (Carnero et al., 2011).
Parámetros Evaluados
Para evaluar la tasa de recuperación embrionaria en ambas técnicas se determinó el número de embriones colectados entre el total de hembras lavadas, número de embriones por lavado y número de lavados exitosos (presencia de embrión) entre el número total de hembras lavadas.
Los embriones colectados por los dos métodos fueron clasificados como Grado I: embriones esféricos, color homogéneo y bordes lisos; Grado II: embriones con arrugas, muy desarrollados (>700 µm) y con contorno anormal; Grado III: embriones visiblemente colapsados (Trasorras et al., 2017), con lesiones visibles en su estructura y, por lo tanto, considerados como no transferibles.
La fertilidad de la transferencia de embriones se determinó mediante ecografía, usando un ecógrafo portátil y un transductor lineal de 5MHz (Tringa Linear®, Esaote), 20 días después de la transferencia embrionaria, confirmando gestación temprana con la presencia de vesícula embrionaria y cuerpo lúteo. La natalidad se determinó por el número de hembras que parieron respecto al número de hembras que fueron transferidas.
La evaluación de datos se realizó mediante estadística descriptiva, usando el programa SAS V9.0 (SAS, 2002).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de la tasa de colección embrionaria para ovulación simple y super ovulación en llamas se presentan en el Cuadro 1, la calidad de los embriones recuperados en el Cuadro 2 y el porcentaje de gestaciones en el Cuadro 3.
La tasa de colección de embriones está influenciada por el método de producción de estos. Mediante la técnica de ovulación simple se colectaron embriones en el 53% (44/83) de hembras lavadas mientras que con la técnica de super ovulación se obtuvieron 242.3% (63/26) de embriones con relación al número de hembras lavadas. Este resultado es esperado, toda vez que la super ovulación produce mayor cantidad de estructuras embrionarias (Vaughan et al., 2013). El número promedio de embriones por lavado para la técnica de ovulación simple fue de 0.57 en la época reproductiva y de 0.44 en época no reproductiva. Pacheco et al. (2016) obtuvieron resultados similares para la época reproductiva, pero mayores en la época no reproductiva. En forma similar, Von Baer et al. (2003) encontraron diferencia entre las colectas embrionarias de verano (época reproductiva) con 76.8%, frente a la primavera (época no reproductiva) con 61.8% en ovulación simple, indicando las la influencia de la época sobre la eficiencia y comportamiento sexual de la alpaca (Pollard et al., 1995). De otra parte, si bien se observa una marcada diferencia en el número de embriones y la tasa de colección entre ambas técnicas (ovulación simple vs. super ovulación), la técnica de ovulación simple es menos costosa (Von Baer et al., 2003).
Respecto a la técnica de ovulación simple, Taylor et al. (2000) reportan 55% de colección de embriones al realizar el lavado uterino en el día 7; resultado similar al presente estudio al considerar las recuperaciones de ambas épocas. Es posible que la colecta embrionaria en el día 7 pos-monta no permita incluir el descenso embrionario en todas las donadoras, si se consideran los resultados de Taylor et al. (2000) quienes obtienen 79% de recuperación de embriones al realizar el lavado uterino el día 8 pos-monta. En este sentido, Picha et al. (2013) indican que el descenso embrionario en alpacas se inicia el día 6 pos-ovulación (7 días pos-monta).
Por otro lado, este estudio fue realizado en condiciones de altura y sin mejoras de alimentación, lo cual podría haber afectado la tasa de colecta, dado que el estudio de Taylor et al. (2000) se hizo en llamas de rebaños comerciales bajo semi-estabulación en condiciones de EEUU. Así mismo, los resultados obtenidos en ovulación simple también fueron inferiores al 68.9% reportado por Von Baer et al. (2003) en llamas mantenidas en semi-estabulación, evidenciando también que dicho sistema de crianza proveería mejores condiciones para la obtención de mayores tasas de colección embrionaria.
La super ovulación produce bajas tasas de recuperación embrionaria y una gran variabilidad de respuesta en camélidos sudamericanos (Ratto et al., 2013), habiéndose desarrollado diversos protocolos, utilizando eCG y FSH como hormonas super ovulatorias. En el presente estudio se pudo obtener 2.42 embriones utilizando 500 UI de eCG, resultado muy similar a los dos embriones reportados por Pacheco et al. (2019) utilizando también 500 UI de eCG en una sola aplicación. De otra parte, Vaughan et al. (2013) reportaron la colección de 2.5 embriones por lavado en alpacas super ovuladas bajo condiciones medioambientales diferentes a la del actual trabajo.
Carretero et al. (2010) indican promedios de colección embrionaria de 2.9 y 2.6 embriones por hembra en llamas, pero utilizando dosis elevadas de eCG (1000 UI), lo cual fue el doble de la concentración usada en el presente trabajo (500 UI); sin embargo, es importante indicar el mayor peso de las llamas argentinas (140 kg) que se encontraban en semi-estabulación y que la colección de embriones se hizo a los 8 días de la monta. Eso último apoya los resultados de Cervantes et al. (2011), quienes indican que los embriones producto de la super ovulación comienzan a ingresar al útero desde el día 6 de la monta, por lo cual el día 8 seria indicado para realizar la recuperación embrionaria. El porcentaje de lavados exitosos fue de 68.42 y 71.42% para la época reproductiva y no reproductiva respectivamente, logrando un promedio anual de 69.2% (18/26), resultado superior al de Ratto et al. (2013), quienes indican 53% de lavados exitosos en alpacas super ovuladas.
Los resultados sobre la calidad embrionaria indican 90.6 y 83.3% de Grado I y 9.4 y 16.7% de Grado II para las época reproductiva y no reproductiva, respectivamente, y 0 embriones para Grado 3 (Cuadro 2) para las recuperaciones utilizando la ovulación simple, esto último de acuerdo con otros reportes (Pineda et al., 2012; Pacheco et al., 2016). En el caso de embriones de super ovulación se obtuvo 76.6 y 87.5% de Grado 1; 14.9 y 12.5% de Grado II y 8.5 y 0% de Grado II para las épocas reproductiva y no reproductiva, respectivamente (Cuadro 2), siendo similares entre épocas, excepto en el Grado III; resultados superiores a lo reportado por Vaughan et al. (2013), quienes indican incluso embriones de Grado IV, debido al empleo de una clasificación diferente a la del presente estudio. En este sentido, Pérez et al. (2019) reportaron un mayor porcentaje de embriones de ovulación simple en la categoría 2 (65.1%) mientras que solo obtuvieron 14.8% en las categorías 1 y 3 utilizando el manual del IETS para su evaluación (Stringfellow y Givens, 2011), donde no existen parámetros para evaluación de embriones de camélidos sudamericanos y, por lo tanto, estos datos no son comparables a los del presente estudio.
Todas las transferencias fueron realizadas en receptoras a los 8 días de la inducción de ovulación mediante la aplicación de 8.4 µg de acetato de buserelina (Bourke et al., 1995), lo cual fue diferente a lo empleado en otros estudios, donde hicieron la transferencia a los 6 (Trasorras et al., 2010) y 7 días (Carnero et al., 2011) de la inducción de la ovulación. Las tasas de fertilidad como producto de la ovulación simple (56.4%) y de la super ovulación (56%) fueron similares (Cuadro 3). Este resultado es inferior al obtenido por Carnero et al. (2011), quienes indican 75% de fertilidad al transferir el embrión directamente en el cuerno izquierdo, tal como se realizó en el presente experimento; aunque ligeramente superior al 50% obtenido por Trasorras et al. (2010). Es posible que la transferencia haya sido hecha tardíamente, no permitiendo un correcto reconocimiento maternal del embrión (Tibary et al., 2015). En otros estudios, Taylor et al. (2000) reportan 66% de gestaciones en llamas semiestabuladas, y Vaughan et al. (2013) reportaron 42.7 y 41.7% de fertilidad en alpacas para ovulación simple y super ovulación, respectivamente ambos estudios en condiciones muy diferentes a las del presente estudio.
La natalidad fue de 41.0% (16/39) y de 30.0% (15/50) para las llamas con ovulación simple y super ovulación, respectivamente, siendo similar a lo descrito en alpacas (Vaughan et al., 2013), existiendo una disminución en el número de hembras paridas respecto al número de hembras preñadas, lo cual sugiere la presencia de mortalidad embrionaria y perdidas fetales a lo largo de todo el periodo de gestación.
CONCLUSIONES
Se puede obtener embriones de calidad transferible con las técnicas de ovulación simple y super ovulación.
La técnica de super ovulación producemayor cantidad de embriones, pero es dependiente de un protocolo más largo e incluye el uso de varias hormonas y evaluaciones ecográficas, lo que la hace más complicada para su implementación a nivel de productor en zonas alejadas.
La calidad de embriones de llama obtenidos por las dos técnicas es similar, siendo mayormente de Grado I.
El porcentaje de fertilidad en las hembras receptoras fue similar con embriones producidos por las técnicas de ovulación simple y super ovulación.