INTRODUCCIÓN
En equinos de deporte, la principal causa de invalidez funcional son las afecciones que comprometen el sistema músculo esquelético (Martiq et al., 2014), donde la osteoartritis (OA) es una entidad patológica de gran incidencia y causa común de claudicación (Polli et al., 2013), dolor y efusión sinovial que reduce el rendimiento físico (de Souza, 2016; Stefaniuk-Szmukier et al., 2019) y pérdida de días de entrenamiento (Reed et al., 2012). Los ejemplares afectados en forma aguda presentan signos de inflamación en la articulación carpal, metacarpo falángica y tibiotarsal (Caggiano et al., 2013), no habiendo tratamiento curativo (Xie et al., 2019).
El dolor es el síntoma cardinal de la artritis relacionado directamente con la función y calidad de vida, cuya patogénesis se ha retrasado en áreas como el control de la inflamación, regulación de la autoinmunidad y falta de terapéutica. Sin embargo, se investigan los mecanismos biológicos y moleculares en diferentes modelos animales (Hong et al., 2020). Por décadas, las investigaciones realizadas en torno a la inflamación articular producto del trauma repetitivo (McIlwraith, 2009; Goodrich y Nelson, 2013), se han orientado a conocer el rol del cartílago articular, líquido y membrana sinovial (Frisbie, 2012; Ross et al., 2012), pero no se ha estudiado debidamente lo que ocurre en el hueso subcondral de equinos con OA.
La remodelación del hueso subcondral es un proceso biológico que compromete a células residentes de la médula ósea, que incluye osteoblastos, osteocitos, osteoclastos (Al-Bari y Al Mamun 2020) y células inflamatorias derivadas de células madre (stem cells) hematopoyéticas (Xie et al., 2019), que en la patogénesis de la OA aparecen con una menor densidad mineral ósea y un incremento en los espacios del trabeculado, formando erosiones que se extienden a través del cartílago calcificado con orientación vertical en el hueso esponjoso (Lacourt et al., 2012). Su alteración arquitectónica reduce su habilidad para disipar las fuerzas y distribuir el impacto generado sobre la articulación, lo que se traduce en un aumento de las fuerzas biomecánicas sobre el cartílago articular acelerando el daño (De Simone et al., 2013).
Los osteoclastos que participan en la osificación endocondral, remodelación ósea subcondral, reparación ósea y su densidad, es mayor en el plato óseo cortical subcondral (0.3 mm) comparado con el trabeculado óseo más profundo de grupos de potrillos, añeros y adultos (Gilday et al., 2020). Por otra parte, Zarka et al. (2019) detectaron en el cartílago calcificado y hueso subcondral, microfracturas y aumento de la densidad de osteocitos en rodillas de cadáveres humanos donde estas pueden reflejar una vía en que el cartílago articular puede ser protegido del trauma disipando la energía en respuesta a la carga mecánica.
En equinos, la OA se caracteriza por presentar sinovitis, alteración de la viscosidad del líquido sinovial y un lento y progresivo resquebrajamiento del cartílago hialino (Novakofsky et al., 2015). Además, se describe en la etapa inicial inflamatoria el rol de macrófagos sinoviales, macrófagos del tejido adiposo y osteoclastos (Xie et al., 2019) y, por otra parte, el compromiso de tejidos, tanto articulares como periarticulares (Frisbie, 2012; Caggiano et al., 2013) que en el tiempo van a presentar signos radiográficos de la enfermedad como osteofitos, esclerosis, quistes en el hueso subcondral, disminución del espacio articular y entesofitos (Milner, 2011; Lacourt et al., 2012) y en estados avanzados, erosión cartilaginosa y fibrosis de la membrana sinovial (De Simone et al., 2013; Goodrich y Nelson, 2013; Xie et al., 2019).
Independiente de los avances en el diagnóstico, las lesiones articulares se mantienen como un problema común en caballos de carrera (Singer, 2013). Es así que en el Reino Unido, se encontró que el 24% de los caballos tuvo problemas articulares durante el entrenamiento y las carreras (Reed et al., 2012). Asimismo, en Australia, se encontró que el 31% de los caballos de dos años en entrenamiento sufrió algún tipo de lesión articular en las áreas que sustentan la carga mecánica, como ocurre en la superficie proximal del tercer hueso carpiano, la superficie distal del hueso carpo radial y el borde proximal de la primera falange (Reed et al., 2012).
Respecto a fracturas por estrés, asociadas con claudicación en caballos entrenados en diferentes superficies realizado en dos hospitales, uno en Toronto y otro en Pensilvania, de un total de 528 cintigramas, hubo una mayor proporción (31.7%) de caballos fracturados entrenados en una superficie sintética en comparación a los entrenados en una superficie de tierra (MacKinnon et al., 2014). Es así que las afecciones músculo esqueléticas se orientan a los signos clínicos, diagnóstico y tratamiento (De Negri, 2006), pero no se cuenta con información de lo que ocurre a nivel molecular y los cambios inmunológicos que conllevan a la destrucción ósea; sin embargo, la evidencia indica que hay un sistema inmune y esquelético que comparten una serie de moléculas que regulan su función como citoquinas, receptores, moléculas de señalización y factores de transcripción (Okamoto y Takayanagi, 2011).
En este contexto, en la remodelación fisiológica del hueso participan dos tipos principales de células, los osteoblastos (OBs), que forman hueso nuevo y los osteoclastos (OCs) que reabsorben hueso dañado o viejo (Adamopoulos y Mellins, 2015). El desarrollo progresivo de los OBs hasta su madurez se caracteriza por una expresión secuencial de genes que identifican tres periodos de desarrollo del fenotipo osteoblástico: proliferación, maduración y síntesis de matriz extracelular (MEC) y mineralización de la matriz. Esto se hace controlando la remodelación mediante 1) osteocalcina, 2) osteopontina, y 3) sialoproteína ósea, cuya función es promover la nucleación de cristales de hidroxiapatita y diferenciación de OBs, donde la hormona calcitonina actúa sobre ellos aumentando su proliferación y la expresión de osteoprotegerina (OPG) RNAm, inhibiendo el ligando del receptor del factor nuclear kappa Beta (RANKL) (Neve et al., 2011).
El proceso por el cual células madre hematopoyéticas se diferencian en OCs multinucleados con la función de reabsorber hueso, se define como osteoclastogénesis (Takanayagi, 2007). Los OCs tanto en la resorción fisiológica como patológica, tienen al ligando del factor nuclear kappa Beta (RANKL) como la citoquina clave.
Debido a la corta vida de los OCs, estos deben ser continuamente generados en o cerca del sitio de la resorción ósea donde OPG puede ser producida en la misma cercanía de RANKL, por lo que su relación con OPG, es el mayor determinante de la magnitud de formación de OCs y resorción ósea en ese lugar (O´Brien et al., 2013). Por otra parte, el esqueleto se adapta a las cargas mecánicas mediante la remodelación y los OCs que se encuentran cerca de las zonas de microdaño, donde se cree que inician la resorción ósea; sin embargo, la carga local mecánica como flujo de fluido regula el reclutamiento y diferenciación de los precursores de osteoclastos en el sitio de la resorción ósea a través de canales de calcio (Gao et al., 2019).
Dos factores son esenciales y suficientes para promover la osteoclastogénesis: el factor estimulante de colonias de macrófagos (CSF-1) y el ligando del receptor activador del factor nuclear kappa Beta (RANKL). Así, CSF-1 sustenta la proliferación de OCs y su sobrevivencia, mientras que RANKL induce la activación de la diferenciación de OCs, incluyendo la activación de genes necesarios para la resorción ósea y genes requeridos para la fusión de células progenitoras de monocitos (Levaot et al., 2015).
Independiente de las actividades que ocurren en el hueso, la sinovia por su parte, se divide en dos compartimientos, donde la más externa (sub-íntima) con macrófagos especializados (sinoviocitos) y fibroblastos mantienen la homeostasis articular interna, donde estas últimas producen metaloproteinasas de la matriz en los estados tempranos de la OA (Xie et al., 2019), y la más interna (íntima), que provoca dolor y alteración de la función, caracterizada por infiltración de neutrófilos, linfocitos T y monocitos, junto con aumento de la hiperplasia y vascularización de la membrana sinovial que incrementa la expresión de citoquinas catabólicas como interleuquina uno (IL-1) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) secretadas por los condrocitos y aumento de la producción y liberación de metaloproteinasas (MMPs) por condrocitos y sinoviocitos que degradan los componentes de la matriz extracelular (MEC) del cartílago (Frisbie, 2012).
La presencia de Interleuquina uno Beta (IL-1β), se describe como una las citoquinas proinflamatorias más poderosas que estimula in vitro e in vivo la resorción ósea, regula la producción de OPG, aumenta la síntesis de prostaglandina E2 (PG E2), regula la diferenciación, activación y sobrevivencia de los osteoclastos, incrementa la producción del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), e inhibe la apoptosis de osteoclastos y los efectos de TNF en la osteoclastogénesis, de manera que sus efectos conducen a la resorción ósea y osteoporosis (Ruscitti et al., 2015).
Los radicales libres por su parte, juegan un rol en la degradación del ácido hialurónico y del colágeno, donde la PG E2 está aumentada en el líquido sinovial de caballos con OA. Esto se ha correlacionado con sinovitis y claudicación clínica, los cuales pueden reaccionar con el óxido nítrico en las articulaciones dañadas provocando destrucción de la MEC y apoptosis de condrocitos, disminución de la deposición de sulfato dentro de las cadenas de glicosaminoglicanos, síntesis de colágeno y expresión de una importante citoquina antiinflamatoria, la antagonista del receptor de IL-1 (IL-1Ra) (Carmona y Giraldo-Murillo, 2007).
Abdelmagid et al. (2015) estiman que la inflamación crónica durante el envejecimiento de una articulación se caracteriza por aumento de citoquinas proinflamatorias, pérdida de hueso y disminución de la capacidad de reparación, lo que se asocia a un incremento de la osteoclastogénesis con profundos cambios metabólicos, estructurales y funcionales en el hueso, orientando el balance de la remodelación ósea hacia la resorción mediada por OCs. En este contexto, utilizando un modelo animal, se demostró que una vez instalada la artritis crónica, hay una reducción de la densidad ósea y un deterioro de las propiedades mecánicas del hueso como rigidez, ductilidad y resistencia; lo que refuerza la hipótesis de que una desregulación del sistema inmune afecta fuertemente el metabolismo del hueso, estructura y función (Caetano-Lopes et al., 2010).
Por lo tanto, lo más importante en esta enfermedad, es realizar un diagnóstico y tratamiento precoz, para evitar la progresión de la OA (Kamm et al., 2013). Sin embargo, en los estados tempranos, el examen radiográfico se considera que tiene una baja sensibilidad (McIlwraith, 2009) y, por este motivo, las lesiones son diagnosticadas cuando ya se ha producido un daño articular significativo (McIlwraith et al., 2012). En la actualidad, se cuenta con alternativas de diagnóstico, como es el uso de la ultrasonografía y resonancia magnética, las cuales pueden ser más precisas y sensibles en la detección de lesiones articulares, ya que permiten evaluar tejidos blandos (Goodrich y Nelson, 2013), pasando a ser un buen complemento en el diagnóstico.
Rol de RANKL en la Osteoartitis y Osteoclastogénesis
La homeostasis ósea es controlada en forma bien balanceada y dinámica entre osteoclastos, osteoblastos y osteocitos, donde osteoclastos son células multinucleadas que degradan la matriz ósea. Si este balance implica una mayor resorción por osteoclastos sobre la formación de hueso por osteoblastos se traduce en una disminución de la matriz ósea (AlBari y Almamun, 2020). Es así, que la inflamación crónica determina cambios metabólicos estructurales y funcionales en el hueso orientando el balance de la remodelación ósea hacia la resorción mediada por osteoclastos. En este contexto, utilizando un modelo animal se demostró que una vez instalada la artritis crónica hay una reducción de la densidad ósea y un deterioro de las propiedades mecánicas del hueso como rigidez, ductilidad y resistencia (Caetano-Lopes et al 2010).
La diferenciación de OCs es regulada por el factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF) y el ligando del factor nuclear kappa beta (RANKL), una citoquina de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) (Asagiri y Takayanagi 2007), expresado por osteoblastos que forman hueso y sustentan la osteoclastogénesis (Adamopoulos y Mellins 2015).
En el hueso, la expresión de RANKL, que es una proteína de membrana tipo II, perteneciente a la superfamilia TNF localizada en la capa medias y profunda del cartílago hialino, correlaciona con la degeneración y densidad de osteoclastos (Bertuglia et al., 2016), permite la maduración, diferenciación y activación de estos mediante unión a su agonista el receptor del factor nuclear kappa Beta (RANK), que traduce sus señales reclutando moléculas adaptadoras como el factor asociado al receptor TNF (TRAF), donde TRAF-6 es el principal adaptador molecular que conecta RANK a la diferenciación y función de OCs (Nakashima et al., 2012).
RANKL es expresado en condrocitos y fibroblastos sinoviales (Adamopoulos y Mellins, 2015), contribuyendo directamente en la destrucción del hueso (Nakashima et al., 2012); sin embargo, otros autores estiman que RANKL es exclusivamente expresado en el tejido sinovial por linfocitos T activados y fibroblastos sinoviales (Izquierdo y Pablos, 2013). RANKL es también expresado por otras células como monocitos, neutrófilos, células dendríticas, linfocitos B y T (Liu y Zhang, 2015). En consecuencia, determinar el origen de RANKL en la osteoartritis de equinos, probablemente constituiría un gran desafío en estudios prospectivos.
Por otra parte, los OBs juegan un rol crucial en la regulación de la resorción ósea por OCs mediante RANKL (Zupan et al., 2013). Los OBS, células gigantes multinucleadas son diferenciadas de precursores de stem cell hematopoyéticas en presencia de factores esenciales como: el receptor activador del factor nuclear κB (NFκβ) ligando (RANKL), el cual es una citokina factor de la familia de necrosis tumoral (TNF) (Boyce et al., 2015) y OPG, un factor que ejerce un efecto protector en el hueso, la cual es una proteína soluble que tiene una alta similitud con RANK y es un receptor miembro de la superfamilia TNF, con un importante rol en el sistema esquelético actuando como señuelo para el enlace RANK-RANKL (Neve et al., 2011).
OPG se une a RANK con alta especificidad y de esta manera impide la diferenciación y activación de osteoclastos y promueve su apoptosis y, por lo tanto, el balance entre RANKL y OPG determina la resorción ósea (Adamopoulos y Mellins, 2015). Es así, que la unión de RANKL a RANK es inhibida por el receptor señuelo OPG (Okamoto y Takayanagi, 2011), donde el sistema RANKL/RANK/OPG juega un rol clave en la formación, activación y sobrevivencia de OCs (Liu y Zhang, 2015). En estudios realizados en ratones con bloqueo de RANK o RANKL se produce una severa osteopetrosis con defectos en la erupción dental como consecuencia de la falta de osteoclastos. Por otra parte, ratones sin OPG presentan una severa osteoporosis causada por el aumento en número y actividad de osteoclastos (Liu y Zhang, 2015).
Se ha sugerido que OPG puede regular el tráfico intracelular de RANKL y, según esta hipótesis, cuando hay abundante OPG hace que la mayor parte de RANKL sintetizado se mantenga en el interior de vesículas intracelulares y, en consecuencia, inactivo. Por el contrario, en ausencia de OPG, RANKL se localizaría preferentemente en la membrana, donde es capaz de interactuar con los precursores osteoclásticos (Riancho y Delgado-Calle, 2011). La evidencia ha demostrado, que desórdenes del sistema RANKL/RANK/OPG están asociados a enfermedades del humano entre las que se incluyen osteoporosis, artritis reumatoide y tumores óseos (Liu y Zhang, 2015). En un estudio realizado para evaluar RANKL, la quemokina CXCL16 sobre-regula su expresión en artritis reumatoide y fibroblastos de la sinovia (Li et al., 2016).
Por otra parte, las citoquinas inflamatorias TNF-α, IL-1, IL-6, IL-7, las cuales son abundantes en el líquido sinovial y sinovia de pacientes con artritis reumatoide, tienen una gran capacidad de inducir RANKL por los fibroblastos, por lo que aceleran su señalización contribuyendo al proceso de destrucción ósea (O´Brien et al., 2013). Las dos formas de RANKL, tanto la unida a membrana como la soluble, actúan como ligando agonistas de RANK donde RANKL se expresa en células mesenquimales como OBs y células estromales de la médula ósea (Ariyoshi et al., 2014).
En el hueso, la expresión de RANKL que es una proteína de membrana tipo II pertenece a la superfamilia TNF, permite la maduración, diferenciación y activación de osteoclastos mediante unión a su agonista RANK, que es que es una proteína de membrana tipo I expresada en células precursoras de osteoclastos que traduce sus señales reclutando moléculas adaptadoras como el factor asociado al receptor TNF (TRAF) (Nakashima et al., 2012).
RANK por su parte, es una molécula transmembrana expresada en células precursoras de osteoclastos y osteoclastos maduros que carece de actividad enzimática intrínseca en su dominio intracelular y genera señales por su unión a moléculas como factor asociado al receptor TNF (TRAF) (Ariyoshi et al., 2014). En este contexto, TRAF6 es el principal adaptador molecular que liga RANK a la diferenciación y función de los OCs activando al complejo IkB kinasa (IKK) que induce fosforilación y degradación de IkB (Boyce et al., 2015). La señalización intracelular de RANK con su interacción con RANKL induce la activación de su adaptador TRAF 6 y su inhibición de kinasas (IKKs) kB (IkB) NF-κβ (Boyce et al., 2015). Esto se basa en las observaciones en ratones deficientes en TRAF6 que fallaron en diferenciarse al estado maduro in vitro en presencia de CSF-1 como de RANK-L desarrollando osteopetrosis (Liu y Zhang, 2015) y por un mecanismo que aún no se conoce, el complejo RANKL-RANK, induce la trimerización con TRAF6 conduciendo a la activación del NF-kβ.
RANK a su vez, es expresado por células del linaje monocito macrófago entre las cuales se incluyen: células pre osteoclásticas, células B y T, células dendríticas y fibroblastos y es altamente expresado en la superficie de progenitores de OCs y OCs maduros, capaces de inducir la osteoclastogénesis, mediada por la señal de RANKL, y que al carecer de capacidad de activación proteína kinasa intrínseca para mediarla, requiere de moléculas adaptadoras de unión al dominio intra citoplasmático de RANK donde se incluyen a factores asociados a receptores TNF (TRAFs), que se unen a sitios específicos del dominio de RANK que activan moléculas en la cascada hacia el núcleo (Liu y Zhang, 2015).
La cola citoplasmática de RANK contiene tres dominios de unión a TRAF6 y la unión de esta proteína a RANK induce la trimerización de TRAF6, el cual conduce a la activación de NF-kβ vía fosforilación e inactivación de kinasas K (IKK) (Liu y Zhang, 2015). Así, en pre-osteoclastos, TRAF6 actúa induciendo la expresión de la proteína activadora de los genes diana (AP1) y el Factor de células T activado y calcineurina-1 dependiente (NFATc1), conducente a la fusión y diferenciación de pre-osteoclastos (Ng Kong y Martin, 2012; Stefaniuk-Szmukier et al., 2019).
RANKL y algunas citoquinas proinflamatorias, como el factor de necrosis tumoral, activan el factor nuclear kappa beta (NF-kβ) el cual es un factor de transcripción que regula la expresión de muchos genes involucrados en la inflamación para lo cual necesita varias etapas de activación que requiere ubiquitinación (marcación de proteínas celulares para su proteólisis en el proteosoma) donde participa el factor de células T activador citoplasmático 1 (NFATc1) regulando la formación de los OCs y sus funciones, fundamentalmente orientadas a la resorción ósea (Boyce et al., 2015; Levaot et al., 2015). La activación del NFATc1 es mediada por una fosfatasa específica, la calcineurina, la cual es activada por la señalización calciocalmodulina (Nakashima et al., 2012).
TNF-α es el principal mediador de la respuesta inflamatoria aguda y posee dos receptores (TNF-RI y TNF-RII), los cuales, al ser activados activan varios factores de transcripción, fundamentalmente al NF-kβ, importante para la transcripción de numerosos genes (Caggiano et al., 2013). De hecho, MCSF, NF-kβ, RANKL y TNF son citoquinas expresadas/secretadas por células inmune que también regulan la osteoclastogénesis (Cuming et al., 2018). Por lo tanto, la vía de señalización RANKL-RANK-NF-kβ es la más importante (Figura 1), y permite la translocación del factor de transcripción NFkβ al núcleo, liberándolo de los complejos IKK que lo retienen en el citoplasma, donde es inactivo (Boyce et al., 2015).
El esquema básico de la señalización de NF-kβ consiste en una serie de elementos reguladores positivos y negativos induciendo estímulos que gatillen la activación de IKK conducentes a la fosforilación, ubiquitinación y degradación proteínas IkB, donde liberados los dímeros NF-Kb son activados y traslocados al núcleo donde se unen a secuencias específicas de DNA y promueven la transcripción de genes (Hayden y Gosh, 2008).
El NF-β pertenece a una familia que expresa factores de transcripción, jugando un rol esencial en la mayoría de las respuestas inmunes e inflamatorias. En mamíferos, el NF-kβ consiste en seis miembros: Rel A (p65), Rel B, c-Rel, NF-kβ 1 (p50 y su precursor p105), y NF-kβ 2 (p52 y su precursor p100) (Nakashima et al., 2012). Entonces, para que la señalización del NF-kβ se produzca en el OC, se requiere de ubiquitinación y degradación proteosomal o procesamiento de proteínas inhibitorias IkBs (IkBα, IkBβ, IkBε), que les permiten unirse al NF-kβ. Así, IkBα, que se une a los heterodímeros RelA/ p50, es degradado, lo que permite, a través de estudios realizados en ratones knock-out, o con bloqueadores de RANKL, haber determinado que estos entren al núcleo (Boyce et al., 2015). Al utilizar ratones knock-out o con bloqueadores de RANKL (ej. OPG), se sugirió que la formación de OCs asociada con inflamación es enteramente RANKL dependiente, aun cuando otros factores pueden exacerbar la acción de RANKL y donde la mayor fuente de RANKL son las células estromales locales y por reclutamiento, activación de macrófagos y células T presentes en el foco inflamatorio, lo cual se traduce en la producción local de citoquinas pro inflamatorias tales como TNF-α, Il-1 e Il-6 que estimulan la expresión de RANKL en OBs (Ng Kong y Martin, 2012).
La traslocación al núcleo de NF-kβ requiere la liberación previa de los complejos IKK que lo retienen en el citoplasma donde es inactivo, de manera que en el núcleo activa la transcripción génica y la formación de productos que van a degradar el hueso (Boyce et al., 2015).
La migración de precursores de osteoclastos al sitio de resorción ósea y su fusión en osteoclastos multinucleados maduros no está del todo resuelto, donde los osteocitos apoptóticos cercanos al microdaño liberan citoquinas como RANKL, demostrando que los osteoclastos podrían migrar hacia las zonas de fluido con microdaño a través de canales de calcio determinando un nuevo mecanismo de reclutamiento y diferenciación de osteoclastos durante la resorción ósea y remodelación (Gao et al., 2019).
Una vez que los osteoclastos finalizan la resorción ósea en una unidad de remodelación, desaparecen por apoptosis donde los osteoblastos también sufren apoptosis y en parte se transforman en osteocitos, por lo que se presume que pueden ser los sensores del remodelado en microfracturas o cuando hay modificación de las fuerzas mecánicas (Riancho y Delgado-Calle, 2011).
Por otra parte, la estimulación de la vía JNK promueve la formación y activación del complejo AP-1, formado por c-Fos y c-Jun que junto con AP-1 y NF-kβ, son capaces de inducir la expresión del factor de transcripción NFATc1 (Riancho y Delgado-Calle, 2011), que para translocarse al núcleo y llevar a cabo su función, requiere de un aumento del Ca+2 intracelular que provoca la activación de calcineurina que cataliza la eliminación de un grupo fosfato de NFATc1 (Riancho y Delgado-Calle, 2011).
En la literatura también se mencionan otros factores involucrados en la osteoclastogénesis como IL-17 (Zupan et al., 2013), la cual induce la síntesis de RANKL en células mesenquimales, tales como OBs y fibroblastos sinoviales incrementando la inflamación local. Además, factores de crecimiento en el microambiente del hueso, donde la señalización del factor transformante beta 1 (TGF-β1) promueven la diferenciación de linfocitos T helper 17 (Th17) implicados en la destrucción ósea (Morita et al., 2016) y, que actuando directamente sobre macrófagos de la médula ósea, promueven la osteoclastogénesis vía RANKL (Tanaka, 2017).
Una vez finalizados los procesos de señalización y que indujeron la osteoclastogénesis como resultado de la interacción de RANKL con su receptor RANK, se activa la señalización de NF-kβ en precursores de osteoclastos y en osteoclastos maduros (Neyro et al., 2011), los que sufren cambios estructurales desarrollando un borde irregular adosándose al hueso, formando una vacuola externa dentro de la cual son secretados iones de hidrógeno que acidifican el medio (Zupan et al., 2013), fosfatasa ácida tartrato resistente que decalcifica el hueso y catepsina K que destruye colágeno tipo I y MMP-9 que degrada otros componentes orgánicos (Okamoto y Takayanagi, 2011). Esta actividad, es amplificada por la expresión en los osteoclastos por canales de cloro y H+-ATPasa, acidificando el espacio extracelular (Adamopoulos y Mellins, 2015).
De esta forma se mantiene un íntimo contacto con la superficie del hueso junto con la aparición de un anillo periférico de actina carente de organelos (zona clara o de sellado) (Boyce et al., 2015). Luego, se forma una hemivacuola de resorción, donde los protones digieren el componente mineral del hueso y la hidrolasa ácida predominantemente catepsina K (proteasa lisosomal) digiere la matriz orgánica (colágeno tipo I) (Chambers y Fuller, 2011). También se libera MMP-9 que degrada otros componentes orgánicos del hueso cuyos productos, son tomados por el osteoclasto y liberados en su superficie apical hacia la circulación.
Así, bombas de protones e hidrolasas, son insertadas en la superficie de la membrana formando una zona de sellado regulada por la integrina β3 y de podosomas interconectados con filamentos de actina que concentran las enzimas y iones de hidrógeno en la zona de la resorción, formándose una hemivacuola de resorción entre la célula y el hueso, donde los protones digieren el componente mineral del hueso (Chambers y Fuller, 2011).
Los osteoclastos también secretan fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP), dentro del espacio de sellado, donde su función es decalcificar hueso (Mensah et al., 2009). El medio ácido creado por la secreción de iones de hidrógeno y TRAP ayudan a movilizar el contenido mineral del hueso. Así, los osteoclastos se mueven a lo largo de las superficies del hueso aumentando las lagunas de resorción hasta que el proceso se haya completado (Boyce et al., 2015).
En el contexto descrito, al entender y extrapolar la información que se tiene de humanos, es dable pensar que en equinos puede suceder algo similar en los procesos donde la excesiva actividad de OCs implica una resorción ósea patológica donde la evidencia demuestra que los OCs y células inmunes (Okamoto y Takayanagy, 2011) comparten una serie de moléculas moduladoras como citoquinas, receptores, moléculas de señalización y factores de transcripción que se influencian unos a otros.
Kim et al. (2015) estima que la proteína C reactiva puede jugar un importante rol en el proceso de destrucción ósea en artritis reumatoide a través de la inducción de la expresión de RANKL y una directa diferenciación de precursores de osteoclastos en osteoclastos maduros. Así, pacientes tratados con artritis reumatoide tienen posibilidad de reducir los niveles séricos de PCR puede prevenir la destrucción ósea (Kim et al., 2015).
Recientemente, se encontró una mayor densidad de OCs en muestras de OA postraumática localizada en carpo de equinos de carrera comparadas con controles, los cuales de preferencia se localizaron en el plato subcondral y que RANKL correlacionaba positivamente con la degeneración del cartílago y la densidad de osteoclastos. Esto planteaba que RANKL del cartílago puede tener un rol en el reclutamiento de osteoclastos y en el cartílago articular calcificado, lo que correlacionó con el número de microfracturas, sugiriendo que el reclutamiento de OCs por RANKL puede contribuir en la degeneración de cartílago articular calcificado (Bertuglia et al., 2016).
También la alteración del paso de fluido entre el cartílago a través de la interfase huesocartílago, podría afectar el medio mecánico y químico promoviendo la progresión de la OA, sugiriendo que hay un aumento de la porosidad del plato subcondral, lo cual aumenta la interacción entre los compartimientos del hueso y del cartílago (Findlay y Kuliwaba, 2016).
En este contexto se ha logrado inhibir selectivamente catepsina K, logrando un promisorio potencial terapéutico en OA, específicamente en equinos que cursan con dolor óseo, e inflamación que resultan en excesiva resorción ósea y periostitis mediante un selectivo inhibidor VEL-O230 que disminuye la resorción ósea y aumenta la formación de biomarcadores óseos (Hussein et al., 2017).
Por otra parte, la secreción de fosfatasa ácida resistente al tartrato, dentro del espacio de sellado, donde su función es decalcificar hueso (Mensah et al., 2009), utilizando doxiciclina y eritromicina las cuales tiene efectos inhibidores de la resorción ósea en el saco alveolar de ratas, se encontró una expresión génica de RANKL significativamente disminuida y un menor número de células productoras de TRAP lo que implicó una menor actividad osteoclastogénica (Naghsh et al., 2016).
También se ha establecido que la inhibición de las vías moleculares intracelulares por efectos directos de crocina sobre OCs in vitro, la osteoclastogénesis al ser suprimida, puede contribuir al desarrollo futuro de un tratamiento anti-resorción ósea (Fu et al., 2016). Es así que, la supresión de la resorción ósea excesiva es una de las estrategias para tratar la enfermedad ósea, para lo cual la utilización de fumitremorgin C (micotoxina extraída de Aspergillus fumigatus) suprime las vías de señalización de RANKL (Yuan et al., 2020).
Uso de Antiinflamatorios en Osteoartritis
En la práctica, el manejo clínico y terapéutico de la OA es diverso, donde la mayoría de los tratamientos convencionales consideran el uso de antiinflamatorios no esteroidales conducentes a disminuir la inflamación y las claudicaciones (Barton, 2016; Orsini et al., 2012), y corticoides con el objetivo de mitigar el dolor, las alteraciones tisulares en el hueso subcondral, cartílago articular y membrana sinovial (Lacourt et al., 2012; de Souza, 2016; McIlwraith y Lattermann, 2019) inducidos por la acción de IL-1, MMPs, agrecanasas, PG E2 y radicales libres. Un seguimiento clínico comparativo en 80 equinos con claudicación, tres semanas pos-administración de triamcinolona intra-articular fue exitoso en un 87.8%, mientras que a los que se les administró triamcinolona con ácido hialurónico fue de 64.1% (de Grauw et al., 2014).
En humanos, la terapia crónica con corticoides es conocida como una de las mayores causas de osteoporosis (Neve et al., 2011) al inhibir la proliferación y actividad de osteoblastos, incrementando su apoptosis junto a la de osteocitos. Además, incrementan la expresión de RANKL, la diferenciación y proliferación de osteoclastos y disminuyen la síntesis de OPG (Liu y Zhang, 2015).
La actividad antiinflamatoria de los corticoides resulta de la transcripción/transrepresión sobre al menos 200 genes y el mecanismo es la inducción de lipocortín que inhibe fosfolipasa 2, enzima responsable en la cascada del ácido hialurónico y, finalmente, la producción de mediadores proinflamatorios tromboxanos, leucotrienos y prostaglandinas (Cuming et al., 2018). Por el contrario antiinflamatorios no esteroidales solo inhiben la vía ciclooxigenasa (Bentz, 2015).
Los esteroides, además son inhibidores importantes de la inflamación que actúan en la vía de señalización del factor nuclear kappa β (NF-kβ); sin embargo, su inhibición puede ser desfavorable porque este factor regula la expresión de genes inflamatorios y matriz extracelular (expresión de colágeno tipo II y agrecano) (de Souza, 2016). Es así que el medir la expresión génica utilizando métodos farmacogenómicos se proporciona una evaluación más global de todas las respuestas farmacodinámicas después de una administración intraarticular de corticoides (McIlwraith, 2011).
Los corticoides que se utilizan vía intraarticular con mayor frecuencia son triamcinolona, dexametasona, metilprednisolona, betametasona y prednisolona (de Souza, 2016), que se recomiendan con base a los efectos directos sobre el dolor, como en la liberación de Il-1, metaloproteinasas, agrecanasas, prostaglandinas E2 (PGE-2) y radicales libres que pueden ser conducentes a la degradación del cartílago articular y consecuente OA (McIlwraith, 2011). En este contexto, Whitton et al. (2014) describen que un 47% de los caballos a los cuales se les administró corticoides en carpo presentaron lesiones pos-administración, y Smith et al. (2018) describen que de 1488 caballos que recibieron medicamentos intra-articulares en un periodo de cinco años en 8692 espacios intraarticulares tratados en 3925 sesiones, ocurrieron 96 fracturas dentro de los primeros 56 días de tratamiento.
El beneficio animal in vivo de triamcinolona ocurre a dosis usualmente de 8-12 mg como dosis total para el crecimiento de células y recuperación del daño (Wernecke et al., 2015). Por otra parte, de Souza (2016) describe dosis condroprotectivas de 6-18 mg en articulaciones altamente móviles.
Las evidencias han demostrado lo descrito como «artropatía esteroidal», caracterizada por inestabilidad articular, disminución del espacio articular, crepitación, osteonecrosis con mayor incidencia de lesiones en caballos de carrera, (Bentz, 2015).
En casos humanos, donde se ha utilizado triamcinolona acetonide de liberación prolongada intraarticular en el manejo del dolor de rodilla permite una larga presencia en sinovia, produce bajos niveles de glucosa sanguínea, disminuye el dolor en los pacientes y es generalmente bien tolerada (Paik et al., 2019). Además del alivio del dolor, hay una mejora funcional mediante una dosis intraarticular de 40 mg (Borkar et al., 2018) de preferencia a dosis bajas (Bentz, 2015). Sin embargo, los glucocorticoides al disminuir la actividad de los osteoblastos inducen una pérdida ósea condicionando una osteoporosis secundaria, acción mediada en parte por la PTH y 1,25 OH colecalciferol (Neyro et al., 2011). Para evitar múltiples administraciones y riesgos desbalances hormonales, se han utilizado microesferas de una plataforma de poliéster cargada con triamcinolona acetonida (Rudnik-Jansen et al., 2017).
Como alternativas complementarias en equinos se utiliza ácido hialurónico, parcialmente responsable de la lubricación y visco elasticidad del fluido sinovial, cuyo peso molecular disminuye con la edad (Gupta et al., 2019) y en tratamientos no quirúrgicos (Ariyoshi et al., 2014). Una combinación de N-acetil D-glucosamina y condroitín sulfato de sodio utilizando un modelo equino resultó en una mejora de 16% en el dolor clínico basado en scores de claudicación. En este modelo, la reducción clínica en claudicación con acetidrona acetonide fue de 56% (Frisbie et al., 2013).
El uso de terapias regenerativas, basadas en plasma rico en plaquetas (McCarrel y Fortier, 2009; Sundman et al., 2011), células madre o suero autólogo, presentan resultados controversiales en su utilización (Frisbie, 2011; Monteiro et al., 2015) debido a la escasa casuística clínica y ausencia de publicaciones relacionadas con el tratamiento de la enfermedad articular en equinos (Fortier, 2011). En humanos se describe algo similar (Grassel y Lorenz, 2014).
En modelo equino, se han provocado defectos de 15 mm en la patela aplicándose células madre embebidas en fibrina autóloga, encontrándose en las biopsias a los 30 días posteriores un aumento de colágeno tipo II (Grassel y Lorenz, 2014). McIIwraith et al. (2012) solo mostraron un cambio significativo en los niveles de PG E2 en el líquido sinovial, lo que no fue considerado suficiente para recomendar su uso en OA. También se ha evaluado el uso de Stanozolol en 60 equinos con OA con resultados positivos, obteniéndose 82% de mejoría en casos agudos y crónicos (Spadari et al., 2015).
El uso de Tiludronato o Clodronato bifosfonatos no nitrogenados, que se unen a los cristales de fosfato de calcio inhibiendo la resorción ósea (Xie et al., 2019), son devueltos a circulación por resorción osteoclástica para finalmente adherirse nuevamente al hueso en un proceso llamado «reattachment» (Soto y Chiappe, 2014). En casos de enfermedad navicular, disminuye los signos de claudicación (Dusterdieck-Zellmer, 2018). La medicación con bisfosfonatos en caballos de carrera jóvenes y adultos es materia de discusión debido a que esas moléculas se mantienen unidas a la matriz mineralizada del hueso, pudiendo interferir con su crecimiento, adaptación al ejercicio y la reparación del microdaño del hueso (Gilday et al., 2020).
Otra opción es el suero autólogo de proteína antagonista del receptor de IL-1 (IRAP), donde IRAP II está siendo evaluado (Monteiro et al., 2015). IRAP e IRAP II tienen significativas concentraciones para el receptor de la citoquina inflamatoria (IL-1 Ra) y de los factores de crecimiento IGF-1 y TGF-B (McIlwraith, 2015).
Nakashima et al. (2012) consideran que terapias anti-RANKL son beneficiosas en la inhibición de la pérdida de hueso sin afectar el sistema inmune en ensayos clínicos en el modelo animal con OA. Así, se describe que ratones deficientes en RANKL son resistentes a la pérdida de hueso inducida por la inflamación. A futuro, las posibilidades de recuperación articular y obtener la capacidad de respuesta a un tratamiento, RANKL y su receptor RANK bloqueando RANKL, se inhibe la vía de NF-kβ disminuyendo la inflamación (Hamoudi et al., 2019). Por otra parte, Chen et al. (2019) estiman que los niveles séricos de OPG y RANKL también pueden ser usados como potenciales biomarcadores.
Facilitar el diagnóstico precoz de OA puede ser crítico en el tratamiento y progresión de la enfermedad (Kamm et al., 2013), evitando alteraciones metabólicas del tejido articular, ofreciendo una anticipada información de utilidad en la clínica equina (Chávez et al., 2010) y podría ser un medio ideal de monitoreo del progreso o control del cuadro articular. En este contexto, la inhibición selectiva de Catepsina K también tiene un potencial terapéutico en la pérdida de hueso e inflamación en los casos de osteoartritis (Hussein et al., 2017).
En la actualidad, el uso de biomarcadores son un desafío para identificar el daño articular precoz, medición que se pueda realizar en sangre, suero, plasma, orina o fluido sinovial. Sin embargo no hay un biomarcador conocido de alta precisión que indique el grado de enfermedad del cartílago y hueso en una articulación (Stefaniuk-Szmukier et al., 2019).
Independiente de las investigaciones realizadas al respecto, la evaluación de RANKL in vivo como activador de la diferenciación y activación de osteoclastos, se cuantificó por primera vez en líquido sinovial equinos fina sangre de carrera en la articulación carpal de caballos clínicamente sanos y con osteoartritis encontrándose diferencias significativas de los valores de RANKL en caballos sanos vs caballos con OA (De Negri et al., 2019).
En este contexto, poder detectar daño articular en una etapa incipiente antes que los métodos convencionales, y su progresión, se podrían predecir a futuro las posibilidades de la recuperación articular y/o tener la capacidad de evaluar la respuesta a un tratamiento.