INTRODUCCIÓN
El uso de fertilizantes químicos para mejorar la fertilidad de los suelos, la productividad y la calidad de los cultivos puede afectar negativamente el complejo sistema de los ciclos biogeoquímicos (Steinshamn et al., 2004), causando la lixiviación y escorrentía de nutrientes, especialmente nitrógeno (N) y fósforo (P), contaminando el medio ambiente (Gyaneshwar et al., 2002). Los excesos de nutrientes, además de los daños ambientales, afectan negativamente el crecimiento y la calidad composicional de las plantas.
De otra parte, el número de publicaciones científicas sobre el uso eficiente de microorganismos del suelo que mejoren la toma y disponibilidad de nutrientes ha ido en amento (Adesemoye y Klopper, 2009). Dentro de esos microorganismos se encuentran los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA), dada la capacidad de influir en el crecimiento de las plantas, la toma de agua y el contenido de nutrientes de estas (Giovannetti et al., 2006), considerando que las hifas de los HFMA pueden tomar N y P y llevarlo hasta la planta (Aseri et al., 2008). Con el fin de evitar efectos cruzados entre micorrizas, los tratamientos se desarrollaron bajo condiciones controladas con plantas sembradas en potes y bajo condiciones de casa malla, la cual es una estructura de protección construida a base de mallas plásticas, cables y tubulares de hierro galvanizado con el fin de aislar y controlar el desarrollo de las plantas (Alvarado et al., 2014).
En Colombia, el pasto kikuyo (Cenchrus clandestinus [Hochst. ex Chiov] Morrone), es una planta de gran importancia en sistemas pecuarios de producción de leche en trópico alto (Correa et al., 2011), principalmente por su crecimiento agresivo (Estrada, 2001), aunque requiere altos niveles de fertilización química para incrementar la producción de forraje verde y producir forrajes de calidad para la alimentación de vacas lecheras. La fertilización con N recomendada está entre 50 y 70 kg de nitrógeno por hectárea por pastoreo, correspondiente al menos a una dosis de 400 kg N ha-1 año-1, lo cual incrementa los costos de producción y la contaminación ambiental (Echeverri et al., 2010).
Debido a esto, el objetivo de esta investigación fue determinar la calidad composicional del pasto kikuyo mediante evaluación de algunas variables bromatológicas al aplicar diferentes dosis de fertilizantes nitrogenados y fosfóricos en asociación con algunos HFMA y el efecto de estos últimos en la absorción de nutrientes como el P disponible en el suelo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitio de Estudio
El experimento se desarrolló bajo condiciones de casa malla (Alvarado et al., 2014) en el corregimiento de San Cristóbal, municipio de Medellín, Colombia, a una altitud de 1860 msnm, temperatura promedio de 21° C, precipitación promedia anual de 1575 mm. Para el estudio, se establecieron potes con suelo esterilizado e inoculado con 94 esporas en promedio por gramo de los HFMA identificadas en estudios previos (Ortiz et al., 2017).
Siembra de Pasto Kikuyo
La semilla sexual del pasto maduro se obtuvo de los lotes de las fincas de donde se seleccionaron previamente los HFMA nativos (Ortiz et al., 2017). La siembra se realizó en potes plásticos de 16 x 8 cm de diámetro y área de 50.26 cm2, con suelo esterilizado en autoclave a 120 ºC durante 20 minutos. Se utilizaron cinco semillas sexuales de pasto; asimismo, el inóculo de HFMA para cada cepa correspondió a 4 g de inoculante con un contenido de 94 esporas promedio por gramo. Los fertilizantes se aplicaron de acuerdo con los tratamientos propuestos.
Fertilización Nitrogenada, Fosfórica y HFMA
Para la fertilización nitrogenada de 100% se empleó la máxima dosis reportada (Dianelis et al., 1994) de 400 kg N ha-1 año-1 o 50 kg N ha-1 corte-1 en pasto kikuyo, usando como fuente urea grado (46-0-0). Además, el 100% de la dosis del fertilizante fosfórico fue de 200 kg P ha-1 año-1 o 25 kg P ha-1 corte-1 (Diannelis et al., 1994), usando como fuente roca fosfórica (31.59 P2 O5 y 39.34 CaO). Los fertilizantes se aplicaron 10 días posteriores a la siembra y después de cada corte. La cantidad de fertilizante por pote se calculó a partir del área de este (50.26 cm2 o 0.5026 m2). Las dosis por pote aplicadas fueron 2.51 g N pote-1 corte-1 y 1.26 g P pote-1 corte-1.
Los HFMA empleados se denominaron nativo 1 (Rhizophagus intraradices), nativo 2 (Rhizophagus fasciculatus) y una cepa conocida (Rhizophagus manihotis). El análisis químico del suelo indicó condición alta de acidez y bajo contenido de calcio y fósforo intercambiables (Cuadro 1). Se aplicaron 2000 kg/ha de cal dolomita 30 días antes de la siembra.
Variables de Calidad
Para evaluar la calidad nutricional del pasto se determinaron las variables materia seca según AOAC (1990), la proteína cruda por el método de Kjeldahl (AOAC, 1995), la energía bruta a través del método de la bomba calorimétrica, el contenido de calcio (Ca) por el método de complexométrica con EDTA y el P con el método de espectometría UV-VIS, NTC 4981 (Ayala, 2007). Para la interpretación del contenido energético del pasto, esta se convirtió de energía bruta (EB) a energía digestible (ED) y luego a energía metabolizable (EM), donde la ED es el 60% de la EB y la EM el 82% de la ED (Agudelo, 2001). Los cortes se realizaron en tres ciclos de 35 días cada uno para una duración total del estudio de 105 días. En cada periodo de corte se midieron las variables de calidad y después del último ciclo se determinaron las isotermas de fósforo y el porcentaje de colonización de raíces. El ciclo de 35 días para cada cosecha se determinó a partir de formación de la cuarta y quinta hoja bien desarrollada (Chopra et al., 2007). El pasto se cosechó a una altura de 10 cm (Swanepoel et al., 2013).
Isotermas de Fósforo
Las isotermas de absorción de P se realizaron mediante la metodología descrita por Fox y Kamprath (1970) y Habte y Osorio (2001). Las tres concentraciones de P en la solución del suelo expresada en KH2 PO4 kg-1 de suelo fueron 2, 3.8 y 17.6 KH2 PO4 kg-1 de suelo (Fox y Kamprath, 1970; Sierra et al. 2012).
Tinción de Raíces y Porcentaje de Colonización
El método utilizado fue el propuesto por Phillips y Hayman (1970) y Sieverding (1984), el cual requiere el montaje de raíces teñidas en portaobjetos para evaluarse en microscopio óptico. El porcentaje de colonización se determinó a partir de la siguiente fórmula: Colonización (%) = (Número de intersectos micorrizados / Número de intersectos observados) * 100. El número mínimo de intersecciones observadas fue de 100 (Giovannetti y Mosse, 1980).
Diseño Experimental
Se empleó un diseño de clasificación experimental completamente aleatorizado mediante arreglo factorial (3x3x3) asimétrico de tipo balanceado, efecto fijo, de medidas repetidas en el tiempo. Se evaluaron las variables de calidad del pasto, colonización de las raíces y la capacidad de absorción de fósforo del suelo. Se incorporó el análisis multivariante de la varianza (MANOVA) con contraste canónico ortogonal determinando vía máxima verosimilitud para la comparación del efecto de los tratamientos, suplementado con análisis de tipo unidimensional que tiene como objetivo establecer los estadísticos media aritmética, desviación típica y coeficiente de variación.
El modelo de clasificación experimental fue Yijsk = u + Pi + Nj + HFMAs + PNij + PHFMAis + NHFMAjs +PNHFMAijs + eK(ijs), donde Yijsk = Va riable de respuesta calidad composicional, porcentaje de colonización en las raíces en el pasto kikuyo y capacidad de absorción de fósforo del suelo en la l-ésima observación correspondiente al efecto i-ésimo nivel del fósforo, j-ésimo nivel de nitrógeno y k-ésimo categoría de hongos formadores de micorrizas; U: Media poblacional; Pi: i-ésima observación del efecto del fósforo Nj: i-ésima observación del efecto del nitrógeno; HFMAs: i-ésima observación del efecto de los hongos formadores de micorrizas PNij: iésima observación del efecto combinado del fósforo y el nitrógeno; PHFMAis: i-ésima observación del efecto combinado del fósforo con los hongos formadores de micorrizas, NHFMAjs: i-ésima observación del efecto combinado del nitrógeno con los hongos formadores de micorrizas, PNHFMAijs: iésima observación del efecto combinado del fósforo y el nitrógeno con los hongos formadores de micorrizas, Ek(ijs): Error experimental.
Los factores experimentales fueron Factor 1. Fertilización fosfórica (P) con tres niveles (0, 50, 100%); Factor 2. Fertilización nitrogenada (N) con tres niveles (0, 5%, 100%), Factor 3. Hongos micorrícicos (HFMA) con tres niveles (sin micorrizas, Rhizophagus intraradices, Rhizophagus manihotis). Se implementaron 27 tratamientos con tres repeticiones por tratamiento para un total de 81 unidades experimentales.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Calidad del Forraje
Materia seca
El tratamiento de N como efecto simple afectó negativamente el rendimiento de MS (p<0.05), mientras que los tratamientos con P y HFMA no tuvieron efecto significativo, tanto como efectos simples como la interacción de todas las variables independientes (Figura 1). Apráez y Moncayo (2003), en forma similar, encontraron un menor porcentaje de MS cuando se aplicaron fertilizantes químicos. Los cambios en el contenido de MS en las pasturas pueden estar relacionados con una menor humedad retenida en los tejidos vegetales (Apráez y Moncayo, 2003) y al papel que juega el N en la toma de agua por parte de la planta, ya que a medida que aumenta la aplicación de N se aumenta el crecimiento de la planta y, por tanto, el consumo de agua desde el suelo (Teixeira et al., 2014).
Proteína cruda
El contenido de PC fue significativamente diferente en la interacción N-P, habiendo un mayor efecto entre los niveles N100-P50 (17.44% PC) (p<0.05; Figura 2). La máxima dosis de N100 (400 kg N ha año-1 en combinación con una dosis media de P50 (100 kg P ha año-1) mostró la mayor concentración de PC (Figura 2). Esto indica que la aplicación de ambos elementos mejora considerablemente la nutrición de la planta. Algunos autores reportan que la aplicación de N en presencia de un nivel adecuado de P contribuye a una mayor actividad fotosintética y síntesis de proteína (Shahin et al., 2013). Marsalis et al. (2010) e Islam et al. (2012) encontraron que una tasa de aplicación similar a la usada en este estudio muestra una mejor concentración de PC. Asimismo, Silva et al. (2010) demostraron que la fertilización con N, P y S en el pasto kikuyo aumenta la PC en un 15%. De igual forma, se reporta que los HFMA mejoran la calidad del pasto, principalmente el contenido de PC (Sabia et al., 2015), contribuyendo con la absorción de elementos como el N (Smith y Read, 2008), ya que el micelio extrarradical de los HFMA tiene la capacidad de tomar NH4 +, NO3 - y algunas formas de N orgánico del suelo (Tienda et al., 2014), para llevarlo a la planta y contribuir a la formación de PC.
Energía
El mayor nivel de energía se obtuvo al combinar los tratamientos de HFMA (N1) y P50, con 4145 kcal (2039.4 kcal EM), seguido del tratamiento C1 y P50 4129 kcal (2051.1 kcal EM). Ambos valores de energía fueron diferentes al nivel de mayor concentración energético encontrado con los tratamiento que combinaron nitrógeno y fósforo N50 y P50 4120 kcal (2027.5 kcal EM) (p<0.05; Figura 3). La aplicación de N aumentó la cantidad de energía bruta del pasto kikuyo (p<0.05; Figura 3), lo que indica que la fertilización con este nutriente puede afectar de manera favorable el contenido de energía del pasto. Estos valores son similares a los reportados en kikuyo por Sánchez y Soto (1999) y Dugmore (1998). Soto et al. (2005) reportaron un aumento de la concentración energética expresado como Energía Neta de Lactancia (ENL) en el pasto kikuyo al fertilizar con N. La aplicación de fertilizante con N se traduce en una reducción del contenido de cenizas y un aumento del EE. Además, los pastos fertilizados con N y P aumentan la tasa fotosintética y, por tanto, concentración carbohidratos los cuales aportan energía (Zong y Shangguan, 2014). La fertilización química mejoró los contenidos de energía y proteína (Figura 4), además de aumentar la tasa de rebrote y crecimiento, donde hay una mayor proporción de hoja que acumula material orgánico, el cual va a producir mayor energía (Juárez et al., 2009).
Calcio
La interacción N-P en los niveles N50 y P100 (Figura 5) tuvo efecto significativo en los niveles de calcio (p<0.05), con una concentración promedia de 1.0%, comparado con otros tratamientos que solo incluyeron la aplicación de N, P y un HFMA. El alto contenido de Ca se puede explicar por la posible acumulación en la pared celular al haber una mayor dosis de N, ya que aumenta su división y tamaño para favorecer el crecimiento de la planta (Marais et al., 1997). Por otro lado, la aplicación de N estimula la producción de ácido oxálico, el cual atrapa el Ca y disminuye su biodisponibilidad cuando el animal consume el pasto (Marais, 1990).
Fósforo
El contenido de P no fue significativo al analizar los tratamientos simples (N, P, HFMA); sin embargo, los tratamientos de N100 P50 N1 y N100 P100 C1 presentaron contenidos de P de 0.33% y 0.36%, respectivamente (Figura 6). Los resultados indicaron que una alta aplicación de N y P aumenta el contenido de P en la planta. En este sentido, Diannelis et al. (1994), muestran que dosis elevadas de N interactúan con el P para mejorar la calidad de las pasturas. Los resultados muestran además que los HFMA tuvieron un efecto positivo en la interacción múltiple de las dosis de N, P y HFMA, efecto que se puede explicar debido a la velocidad reducida con la que las raíces de la planta toman el P del suelo (Li et al., 1991), y donde los HFMA cumplen la función de aumentar la capacidad de absorber P de 6 a 10 veces más que los pelos radicales (Smith et al., 1994), independientemente de la especie de HFMA. Miranda y Forsythe (2012) encontraron, por otro lado, que R. intraradices aumenta la cantidad de P en los tejidos foliares cuando este elemento se encuentra en el suelo en altas concentraciones.
Contenido de proteína cruda y energía bruta
Los niveles de tratamientos de la interacción de N, P y HFMA que mostraron un contenido de proteína cruda por encima de 18% y energía bruta sobre 4.0 Mcal EB kg MS-1 (Figura 4), fueron N100-P50-N1, N100-P50-N1, N50-P0-C1, N0-P100-N1 y el nivel N50-P0-N1. Los tratamientos para estas dos variables fueron N0-P0-C1 y N0- P0-SM (Figura 4).
Contenido de calcio y fósforo
Los niveles de los tratamientos de la interacción de N-P y HFMA con la mayor concentración de Ca y P fueron N50-P100- N1 y N100-P50-N1 y los de menor concentración fueron N0-P0-C1 y N0-P0-SM (Figura 7).
Concentración de energía bruta y minerales
La relación entre los minerales y la concentración energética del pasto kikuyo mostraron una relación calcio/fósforo entre 3/4 y una concentración de energía superior a 4.0 Mcal EB kg MS-1, excepto en los niveles de los tratamientos N0-P0-C1 y N0-P0-SM (Figura 8).
Colonización de Raíces
En la colonización consideraron los niveles de fertilización de 0, 50 y 100% para el N y el P, además de los grupos de HFMA nativos al pasto kikuyo (R. intraradices y R. fasciculatus) y una especie diferente a las halladas en este pasto (R. manihotis). Los resultados muestran que solo los tratamientos con HFMA fueron significativos (p<0.05) para la colonización, dado que los niveles de fertilización no tuvieron efecto (p>0.05) en el porcentaje de colonización en las raíces del pasto kikuyo.
El porcentaje de colonización no fue afectado por el tipo de mineral y el nivel de fertilizante aplicado. Qin et al. (2015) encontraron un efecto positivo en la población de microorganismos de la rizosfera, pero no en la colonización de la raíz por parte de los HFMA cuando hay aplicación de fertilizantes químicos. No obstante, Lin et al. (2012) demostró que altas aplicaciones de N y P afectan la población de microorganismos como los HFMA y el porcentaje de colonización en las raíces de las plantas, efecto que se debe probablemente a la preferencia de los HFMA por un pH neutro o cercano a la alcalinidad (Qin et al., 2015). Sin embargo, algunas especies de HFMA parecen responder de manera diferente a la aplicación de fertilizantes, como por ejemplo R. intraradices (Bhadalung et al., 2005), especie que se empleó en este estudio y que fue aislada de los suelos establecidos en pasto kikuyo en algunos municipios de clima frío en Antioquia, la cual mostró los mejores resultados.
Isotermas de Adsorción de Fósforo
En la variable P se agruparon los niveles (P0%, P50% y P100%) y para los HFMA los niveles (SM, R. intraradices, R. fasciculatus y R. manihotis). Cuando las cantidades de P aplicado al suelo fueron de 0, 500 y 1000 mg kg-1 hubo un efecto significativo (p<0.05) de los HFMA en la cantidad de P en la solución del suelo (mg l-1); más no así para las aplicaciones de 2000 y 3500 mg kg -1 de P. La interacción entre los niveles de HFMA y el P no tuvieron un efecto en cada una de las concentraciones; sin embargo, la aplicación de P en niveles de 0, 50 y 100% para la dosis de 200 kg de P ha-1año-1 tuvo efecto significativo (p<0.05) en la concentración de P en la solución del suelo (mg l-1) en las cantidades de P aplicado (0, 500, 1000, 2000 y 3500 ppm) (Figura 9).
El suelo debe contener la suficiente concentración de P para proveer el gradiente necesario para su movimiento hacia las raíces (Fox y Kamprath, 1970; Correa y Jaramillo, 1985). El presente estudio demostró que la asociación micorrizal permite un aumento en la toma del P disponible en el suelo para el pasto kikuyo. Resultados similares han sido reportados en otras plantas (Barea et al., 2008), indicando que este tipo de pastos son dependientes de la asociación con HFMA (Habte y Manjunath, 1991). Los HFMA son capaces de explorar un mayor volumen de suelo y pueden tomar más P, incluso a concentraciones bajas y donde la raíz de la planta no es capaz de tomarlo (Grace et al., 2009).
Los resultados indican que, al aumentar la cantidad de P aplicado como fertilizante químico, el P en solución también sufre el mismo comportamiento (Figura 9). Según Kirkby y Johnston (2008), altas aplicaciones de P son necesarias para llegar a tener niveles de suficiencia de este elemento para la absorción de la planta en suelos que se caracterizan por tener alta capacidad de fijación de fosfatos. Gran parte de los suelos bajo los cuales se encuentra establecido el pasto kikuyo en el trópico alto colombiano son suelos derivados de cenizas volcánicas, los cuales se caracterizan por presentar alta capacidad de fijación de fósforo (Correa y Jaramillo, 1985). La presencia de HFMA en estos suelos mejora la adsorción de este elemento facilitando la nutrición vegetal con P y mejorando la calidad nutricional y productividad de este pasto.
CONCLUSIONES
Las aplicaciones de fertilizantes químicos influyen en la calidad nutricional del forraje. La dosis de nitrógeno de 400 kg N ha-1 año-1 combinada con niveles de P de 100 kg P ha-1 año-1 tuvieron efecto positivo en la concentración de proteína y energía del pasto kikuyo.
El empleo de estas dosis racionales de N y P junto con los HFMA en condiciones controladas en los planes de fertilización de pasto kikuyo permite mejorar algunas de las variables bromatológicas tales como la energía, proteína, la materia seca y fósforo, además disminuye el efecto negativo de las altas aplicaciones de fertilizantes nitrogenados y fosforados al medio ambiente.
Las altas dosis de nitrógeno de 400 kg N ha-1 año-1 no afectan el desempeño del HFMA nativo Rhizophagus intraradices encontrado en las praderas del pasto kikuyo.
El uso de HFMA en suelos de trópico alto, que en su mayoría son suelos fijadores de fosfatos, mejoran la absorción de fósforo facilitando la nutrición vegetal con este elemento, la calidad nutricional y la producción del pasto kikuyo