INTRODUCCIÓN
Se cree que el NaCl al 0.9% p/v (solución salina), llamada «normal» o «fisiológica» (Aldrete et al., 2004) se originó durante la pandemia de cólera que devastó Europa en 1831; no obstante, a pesar de su continuo y generalizado uso médico en la reposición y mantenimiento de fluidos humanos, los orígenes de esta solución permanecen oscuros (Awad et al., 2008).
Los animales de agua dulce mantienen sus fluidos internos a niveles hiperosmóticos en relación con el agua dulce (Hill et al., 2006). Por otro lado, la mayoría de los invertebrados marinos son aproximadamente isoosmóticos con el agua de mar, por lo que se les pueden denominar eurihalinos osmoconformadores (Beadle, 1957; Hill, 1979; Barja, 1993; Castelló, 1993; Maeda-Martínez, 2002; Hill et al., 2006; Campbell y Reece, 2007; Fanjul y Hiriart, 2008). Los peces marinos teleósteos son reguladores hipoosmóticos, en los cuales la presión osmótica del tejido es mucho más baja que el agua en la que viven (Hill et al., 2006).
Existe una escasez de literatura sobre el mantenimiento de larvas vivas de cestodos de hospedadores marinos. En un trabajo reciente realizado con plerocercoides de bivalvos marinos (Castro et al., 2019), se observó que después de solo cuatro horas de mantenerlos en solución salina fisiológica normal - SSF - (0.85%), perdían su vitalidad, se volvían lentos y se hinchaban, lo que impedía lograr una postura óptima para su fijación en glutaraldehído, comprometiendo la calidad de las imágenes SEM del microscopio electrónico de barrido. Para corregir este problema y tener larvas con mejor supervivencia y condición física, se han evaluado cinco soluciones salinas a dos temperaturas: ambiental y a temperatura constante 0.5 °C. El objetivo de este trabajo fue elaborar una solución que permita extender la supervivencia de estos plerocercoides para su examen morfológico, sin usar un medio de cultivo, lo que es importante cuando el investigador tiene pocas muestras para llevar a cabo su estudio; además de evaluar la temperatura más favorable.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se usaron cinco soluciones: A, B, C, D y E (Cuadro 1), tanto para el tratamiento 1 (T-1) a temperatura ambiente como para el tratamiento 2 (T-2) a 0.5 °C, lo que hace un total de 10 pruebas en las que se usaron 100 plerocercoides vivos, 10 para cada prueba. Los plerocercoides utilizados fueron identificados como «Tetraphyllidea» de acuerdo con Caira et al. (2017) del género Caulobothrium (Castro et al., 2019) y se extrajeron de la gónada de una concha de abanico Argopecten purpuratus Lamarck, 1819, de la bahía de Sechura, Piura, Perú.
Las soluciones con los diferentes parámetros fisicoquímicos del agua se muestran en el Cuadro 1. El pH de estas soluciones se midió con un multiparámetro Handy Lab680 de SI Analytics, y la salinidad con un medidor de conductividad InoLab WTW. Los experimentos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Patobiología Acuática del Instituto del Mar del Perú (IMARPE-Callao).
Las soluciones utilizadas se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 15 min. El agua de mar empleada para las diferentes soluciones fue filtrada previamente. Las soluciones se colocaron en placas de Petri de 5.4 cm de diámetro y con 10 plerocercoides en cada una. Las unidades de medida fueron la movilidad, forma y supervivencia de los plerocercoides obtenidas por observación (Figuras 1-2). El movimiento normal del plerocercoide significa estiramiento y contracción del cuerpo y de los botridios, desde una posición de reposo hasta el máximo (Figura 3). Cada placa se evaluó a la misma hora en diferentes días (Figuras 1-2). En T-2, las placas se colocaron a temperatura ambiente (27.3 °C) durante 1 hora antes de proceder a la evaluación del estado de los plerocercoides.
Se utilizó un análisis de Kruskal-Wallis para identificar diferencias entre las soluciones utilizadas. Complementariamente se utilizó el test estadístico Dunn para hacer comparaciones múltiples entre las respuestas evaluadas (movimiento, forma y sobrevivencia) de los tratamientos utilizados.
RESULTADOS
Las soluciones B_amb y C_amb (T-1) permitieron una mayor supervivencia de los plerocercoides (p<0.05) en comparación con el resto de las soluciones, no habiendo diferencia significativa entre ellos (Cuadro 2).
En T-1 (Figura 1), los plerocercoides estaban vivos en las soluciones B_amb, C_amb, D_amb y E_amb en el segundo día, pero solo aquellos que estaban en la solución C_amb se mantuvieron muy activos. En el caso de las soluciones B_amb y C_amb, los plerocercoides estaban vivos al sexto día, sin cambios en su morfología, pero con poca actividad. De otra parte, tres plerocercoides permanecieron vivos hasta el día 12 en la solución C_amb, mostrando cambios en su morfología (ligeramente encogidos) y con una actividad muy lenta.
En la Figura 2, se puede observar que para T-2, los plerocercoides se encontraban vivos en las soluciones B_ref, C_ref, D_ref y E_ref al segundo día, pero solo aquellos que estaban en la solución C_ref se mantuvieron muy activos. En el cuarto día, los plerocercoides de las soluciones B_ref, C_ref y D_ref no presentaron cambios morfológicos anormales, pero disminuyeron su actividad. En el quinto día todas las larvas en la solución C_ref estaban viva, sin cambios morfológicos, pero con poca actividad, en tanto que en las soluciones B_ref y D_ref se observó un ligero encogimiento del cuerpo. Solo en la solución D_ref se mantuvieron vivas todas las larvas al sexto día, aunque levemente encogidas y con una actividad muy lenta. Finalmente, solo 1 (C_ref) y 3 (D_ref) plerocercoides permanecieron con vida hasta el octavo día, presentando contracción del cuerpo y lenta actividad.
Temperatura ambiente: soluciones A_amb, B_amb, C_amb, D_amb y E_amb
Temperatura constante (0.5 °C): soluciones: A_ref, B_ref, C_ref, D_ref, E_ref
Categoría A: Solución salina fisiológica; B: ¼ AM + – SSF: ¼ de agua de mar + – de solución salina fisiológica; C: ½ AM + ½ SSF: agua de mar + solución salina fisiológica en partes iguales; D: – AM + ¼ SSF: – de agua de mar + ¼ de solución salina fisiológica; E: Agua de mar
En la solución A (0.85% de solución salina) de T-1, los plerocercoides sobrevivieron solo un día y se hincharon. Esto mismo sucedió en esta solución en T-2, donde tuvieron una supervivencia de solo horas (menos de un día), muriendo hinchados y encogidos.
DISCUSIÓN
Aunque la solución salina normal al 0.85% se usa para el estudio de órganos internos y para el mantenimiento de parásitos en el análisis rutinario de organismos acuáticos (Cabrera et al., 2010; Cribb y Bray, 2010), es claramente inadecuada para el estudio de los plerocercoides encontrados en el bivalvo marino A. purpuratus. En este contexto, Humason (1972) refiere que existen diferentes tipos de soluciones fisiológicas según sea el tipo de investigación y que estas deben ser isotónicas para mantener los tejidos en condiciones normales (las células se hinchan en soluciones hipotónicas y se encogen en las hipertónicas), sugiriendo que la SSF sea de 0.9% para los mamíferos y de 0.75% para los invertebrados. Asimismo, Hoffman (1999) menciona que la SSF de 0.8-0.9% es adecuada para el uso temporal en truchas, ya que la sangre es casi isotónica.
Existe una amplia variedad de soluciones salinas que se utilizan para el estudio parasitológico de organismos acuáticos, como la SSF comúnmente utilizada para helmintos parásitos, que es 0.75% (Meyer y Penner, 1962; Mendoza-Palmero et al., 2007). Otros, como Eiras et al. (2000) recomiendan una solución fisiológica con un rango de NaCl de 0.6-0.8% para la inspección de órganos internos. Según Hoffman (1999), la mayoría de los parásitos internos deben estudiarse con una SSF cuyo rango de cloruro de sodio sea entre 0.8-0.9%, en tanto que Justine et al. (2012) recomiendan el uso de una solución salina al 0.9% para los parásitos intestinales de los peces. En este sentido, autores como Salgado (2009), Quiroz (2014), Lemus et al. (2016), y Scholz y Kuchta (2005), Rodríguez-Gonzáles y Vidal-Martínez (2008) recomiendan o utilizaron una solución salina de 0.7% para el examen de los parásitos intestinales y órganos internos.
Asimismo, Morey (2019) estudió los órganos internos de peces amazónicos utilizando agua destilada y Moreno et al. (2008) colocaron parásitos de vísceras en SSF al 0.75% de peces Mugil liza, Oreochromis mossambicus y Dormitator maculatus; Barrios-Gutiérrez et al, (2018) y Vázquez et al. (2004) analizaron peces dulceacuícolas colocando los órganos internos en SSF al 0.65%; en tanto que una SSF del 0.6% fue utilizada por Sierra y Lamothe (1990) para el estudio de órganos internos del pez marino Pomacanthus arcuatus. Por otro lado, Tharme et al. (1996) utilizaron agua de mar para el estudio del bivalvo Donax serra parasitado con larvas de digeneos; y Morales y Cuéllar (2008) utilizaron agua de mar estéril para el estudio de los órganos internos del camarón peneido en general.
Cabe señalar que no se menciona el tipo de solución salina utilizada para la recolección de parásitos en la mayoría de los artículos de investigación, posiblemente debido a que son fijados de manera inmediata, sin hacer un minucioso estudio in vivo previo. Aunque la mayoría de los investigadores consideran la SSF como una solución estándar para el estudio de los parásitos de helmintos internos de cualquier organismo acuático (peces, moluscos o crustáceos) de agua dulce, los hallazgos en este trabajo demuestran que otras formulaciones básicas pueden dar mejores resultados.
Claramente, la solución salina estándar, representada en este estudio por la solución «A», (0.85% NaCl) no es recomendable ya que los plerocercoides no sobreviven más de un día y sus cuerpos se deforman debido a la baja cantidad de sal en la solución en las dos temperaturas evaluadas. En el presente estudio no se tomó en cuenta la turbidez de las soluciones con el pasar de los días; sin embargo se debe tener en cuenta este factor, ya que el agua se enturbia al permanecer los plerocercoides muertos en el agua, lo que influye negativamente en la supervivencia de las demás larvas. Por otro lado, mantener las soluciones transparentes con el cambio de una nueva solución por día, mejora la supervivencia y la vitalidad de las larvas plerocercoides de concha de abanico.
Anantaraman (1963), en un trabajo similar realizado con larvas de plerocercoides de peces, mostró que por debajo del 50% de agua de mar (25%, 10% y agua corriente), el agua pasa a los tejidos cuando se reduce la presión osmótica del medio externo produciendo la hinchazón y la posterior muerte de la larva. En este trabajo se pudo observar que la solución A (SSF) tuvo una reacción similar con soluciones por debajo del 50%.
Se puede concluir que las soluciones B y C del T-1 son adecuadas para la sobrevivencia de plerocercoides en bivalvos marinos; sin embargo, en la solución C (2.27% de salinidad), para las dos temperaturas en evaluación, se pudo observar un mejor tiempo de supervivencia y de vitalidad en los plerocercoides. Esto se aproxima al valor sugerido por Hoar y Hickman (1975), quienes encontraron que lo más apropiado para crustáceos marinos era una solución de NaCl al 2.67%. Posiblemente, la solución «C» es isotónica con el plerocercoide, pero se necesitaría de estudios adicionales para demostrarlo