INTRODUCCIÓN
Toxocara canis (T. canis) es un helminto perteneciente a la familia de los nematodos Ascarididae, de distribución mundial y el canino es el hospedero definitivo (Chen et al., 2012; Rojas et al., 2016). La ingestión de huevos embrionados de T. canis y la transmisión vertical (ej. transplacentaria) son las dos rutas epidemiológicas más importantes de infección en caninos (Lucio-Forster et al., 2016). El ciclo de vida de este parásito es más complejo que el de otros nematodos. Las hembras adultas oviponen hasta 200 000 huevos/día en el lumen del intestino delgado del perro, los cuales son excretados en las heces al ambiente, donde ocurre su proceso de embrionación y desarrollo larval respectivo (Breña et al., 2011). En un ambiente propicio, los huevos de T. canis pueden sobrevivir alrededor de tres años, lo cual genera un factor de riesgo inminente para el humano (Rojas et al., 2016). Los huevos de T. canis a temperaturas ambientales entre 10-30 °C requieren de 2-6 semanas para llegar al estadio L3 (Jones et al., 2008).
Para la toxocariasis canina existe el principio epidemiológico de un 100% de probabilidad de parasitosis por T. canis en cachorros debido a su transmisión transplacentaria (Lucio-Forster et al., 2016). Los cachorros a las 3-4 semanas de edad son una fuente importante de huevos de T. canis hacia el ambiente (Alcantara et al., 1989; Okulewicz et al., 2012). Otra fuente de infección, para cánidos sinantrópicos, en la vida silvestre es por ingestión de hospederos paraténicos (Kaminsky et al., 2014).
La toxocariasis es una patología zoonótica de alta importancia socioeconómica y de impacto en la salud pública mundial, especialmente en regiones tropicales y subtropicales, donde se asocia con altos índices de pobreza (Chen et al., 2018). La toxocariasis humana es considerada por el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de EEUU como una de las cinco infecciones parasitarias más desatendidas (CDC, 2021); dado que una de sus formas de presentación clínica es inespecífica, lo cual conduce a un diagnóstico erróneo y genera morbilidad prolongada y el desarrollo de complicaciones de salud (ej. síndrome larva migrans visceral) (Lucio-Forster et al., 2016). Aún cuando la toxocariasis es una condición tratable y prevenible, permanece infradiagnosticada y subestimada (Woodhall et al., 2014; Chen et al., 2018).
Los humanos se consideran como un huésped accidental, paraténico, debido a la imposibilidad biológica de la larva de Toxacara spp para llegar a su etapa adulta (Strube et al., 2013). Las personas se infectan al ingerir huevos embrionados provenientes de aguas contaminadas, consumo de carnes crudas o de escasa cocción de otros hospederos paraténicos (ej. aves de corral), geofagia, verduras contaminadas, y por contacto estrecho con cachorros parasitados, entre otros (Ma et al., 2018). Diversos estudios han documentado a la toxocariasis como una de las zoonosis más comunes a nivel mundial y se presenta con mayor frecuencia en niños y jóvenes en edad escolar (Antunes et al., 2020; Prestes et al., 2013).
Los altos índices de toxocariasis canina y humana en el mundo destacan la importancia de tomar medidas de prevención y control en los diferentes lugares y hospederos que constituyen factor de riesgo para las personas (Regis et al., 2011; Cong et al., 2014; Rojas et al., 2016; Berrett et al., 2017; Sowemimo et al., 2017). Por tanto, es necesario un alto índice de sospecha y ayudas diagnósticas de baja complejidad y amplio uso en la práctica de la Medicina Veterinaria para establecer un diagnóstico precoz de infección patente e iniciar el tratamiento adecuado en caninos, además de las acciones de medicina preventiva recomendadas mundialmente para el control de la toxocariasis en animales de compañía (CAPC, 2016).
La necesidad inminente de controlar y prevenir la infección por T. canis debido a las afecciones que se presentan tanto en humanos como en animales, conlleva al hecho de poseer pruebas diagnósticas rutinarias de fácil ejecución y altamente sensibles en la práctica diaria de la Medicina Veterinaria, más cuando la medicina preventiva exige cero tolerancias a la presencia de parásitos con habilidad zoonótica desde el principio de «Una Salud» (Webster et al., 2016). Por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue evaluar la sensibilidad de técnicas coprodiagnósticas utilizadas para la identificación y cuantificación de huevos de T. canis en heces frescas de caninos domésticos (Canis lupus familiaris).
MATERIALES Y MÉTODOS
Huevos de Toxocara canis
Se colectaron hembras adultas de T. canis desde las heces de seis cachorros de 21-32 días de edad, infectados naturalmente por trasmisión vertical después de provocar su expulsión a través del uso de Piperazina diclorhidrato (Pi-Perracina®, Laboratorios Zoo, Bogotá, Colombia) a única dosis de 100 mg/Kg vía oral (PO).
Para la extracción de huevos desde el tracto reproductivo de las hembras de T. canis se siguió la metodología propuesta por Abou-El-Naga (2018). Las hembras fueron lavadas con solución NaCl 0.9%, y los huevos fueron extraídos desde el tercio distal del útero a través de disección quirúrgica en cajas de Petri. Los huevos obtenidos fueron suspendidos en solución NaCl 0.9%, pasados a través de una malla de acero inoxidable con abertura de 1 mm para separarlos de detritos, para luego pasar a centrifugación (50 g durante 5 minutos) desechando el sobrenadante. Posteriormente fueron resuspendidos en 8-10 ml de formol 1% en tubos tipo Falcon de 15 ml, llevados a una concentración de 10-12 huevos de T. canis/ 10 µl para su cuantificación microscópica a 10x utilizando una cámara de Neubauer mejorada. La solución de huevos se mantuvo a temperatura ambiente hasta ser utilizada en los diferentes niveles de tratamiento experimentales dentro del estudio.
Diseño Experimental
Se realizaron exámenes coprodiagnósticos a muestras de heces (50 g) de seis caninos domésticos de edad entre 60-75 días, previamente desparasitados para verificar la ausencia de huevos de parásitos gastrointestinales. Las heces colectadas tenían consistencia firme a pastosa, color café claro a oscuro y forma alargada cilíndrica característica de la especie. Con la solución obtenida previamente (10-12 huevos/10 µl) se contaminaron las muestras de materia fecal fresca libres de huevos de parásitos a concentraciones de 10, 50, 75, 100, 250, 500, 750 y 1000 huevos de T. canis/g de materia fecal (hpg) siguiendo pautas propuestas por Becker (2016), siendo estos niveles de contaminación el gold standard dentro del grado de precisión del estudio. Para cada concentración de huevos se tuvieron tres réplicas para cada una de las cuatro técnicas coprodiagnósticas en evaluación, obteniéndose 96 muestras para el análisis.
Todos los animales utilizados en esta investigación se les garantizó condiciones de bienestar animal y fueron tratados bajo los preceptos de guías internacionales de animales experimentales (NRC, 2004), salvaguardando su integridad según normatividad vigente en el territorio colombiano (Ley 84 de 1989 «Estatuto Nacional de Protección de los Animales»), así mismo, se contó con el concepto técnico favorable del Comité de Bioética de la Universidad de los Llanos (Colombia), según Acta N.° 07 de 2019.
Técnicas Coprodiagnósticas
Todas las muestras fueron procesadas y analizadas el mismo día por los métodos Kato-Katz, MacMaster, MacMaster modificada mejorada y Faust, descritas a continuación:
Kato-Katz.
Los frotis espesos de Kato-Katz se prepararon de acuerdo con lo recomendado por la OMS (2019). Se colocó 1 g de heces en una caja de Petri, se le agregó la concentración correspondiente de huevos de T. canis y se homogeneizó. La muestra se colocó sobre el papel absorbente y se cubrió con una malla de acero inoxidable de 80 µm. El material colectado se llevó a una lámina portaobjeto con una plantilla plástica con agujero con capacidad de 50 mg de heces. Luego, la plantilla se retiró del portaobjetos y se cubrió el montículo de heces con papel celofán hidrófobo de 25x30 mm previamente sumergido (24 H) en la solución de Kato-Katz (100 ml de glicerina, 100 ml de agua destilada y 1 ml de azul de metileno 3%). Finalmente, se realizó el conteo de los huevos de T. canis colocando el portaobjetos en el microscopio a 40x. El número total de huevos observados se multiplicó por 50 como valor constante para establecer la cantidad de hpg.
McMaster
Se procedió según lo propuesto por Gibbson et al. (2010). Se dispusieron 3 g de heces en un vaso espumado de 6 oz, se agregó la concentración correspondiente de huevos de T. canis, se homogeneizó con 42 ml de solución azucarada (gravedad específica de 1.27 g/ml). El contenido se pasó a través de un tamiz de 80 µm. Se retiró una submuestra con una pipeta Pasteur y se llenó la cámara de McMaster (EggzaminTM, Oregon, EEUU). Posteriormente, se observó al microscopio 4x y a 10x para contar los huevos. Para calcular el número hpg se contó el número de huevos dentro de la cuadrícula de cada cámara, multiplicando el total de huevos por un factor de 50.
McMaster Modificado Mejorado
La técnica fue aplicada según lo descrito por Taylor et al. (2015). Se preparó una solución de ZnSO4 con una gravedad específica de 1.2 g/ml. Se colocó 3 g de heces en un vaso espumado de 6 oz, con la concentración correspondiente de huevos de T. canis. Se añadió 30 ml de agua destilada y se homogeneizó la muestra, se filtró a través de un tamiz de malla 80 µm. Se tomó 13 ml de la solución y se centrifugó a 50 g x 2 minutos. Se retiró el sobrenadante y se adicionó 3 ml de la solución de ZnSO4 , se agitó hasta suspender el sedimento y se completó con solución de ZnSO4 para obtener 13 ml. Se tomó una submuestra con la pipeta Pasteur para llenar los compartimentos de la cámara de McMaster (EggzaminTM, Oregon, EEUU) y se observó al microscopio a 4x y a 10x para contar los huevos. Para el cálculo del número de hpg se contó el número de huevos dentro de la cuadrícula de cada cámara, y se multiplica el total por 50.
Faust (Flotación-Sedimentación)
Se procedió según lo propuesto por Bartlett et al. (1978). Se preparó previamente la solución de ZnSO4 con una gravedad específica de 1.2 g/ml. Se pesó 1 g de heces frescas en un vaso espumado de 6 oz, se agregó el número de huevos de T. canis correspondiente para cada nivel de tratamiento, homogenizándose en 10 ml de agua destilada, se tamizó utilizando una malla 80 µm y se llevó a un tubo de ensayo para centrifugar a 50 g x 1 minuto. Se descartó el sobrenadante y se mezcló el sedimento con la solución de ZnSO4 llenado el tubo de ensayo hasta 1 cm del borde del tubo. Se centrifugó nuevamente a 50 g x 1 minuto, volviéndose a llenar el tubo con solución ZnSO4 hasta formar un menisco. Se colocó un cubreobjetos sobre el menisco. Se colocó la lámina de cubreobjetos sobre la lámina portaobjetos, y se observó al microscopio a 10x y 40x para contar los huevos. El contaje resultante es el número de hpg reportados.
Diseño Estadístico
Se realizó estadística descriptiva para expresar los resultados como media y desviación estándar. Para determinar la sensibilidad (%) de cada una de las pruebas diagnósticas se procedió según lo descrito por Bravo y Cruz (2015), así como el nivel de sensibilidad a través de la curva ROC (IC 95%, p<0.05). Todos los resultados se compararon con el gold standard (100% sensibilidad); es decir, con la concentración de huevos de T. canis conocidas (10, 50, 75, 100, 250, 500, 750 y 1000 hpg).Al realizar la prueba de homogeneidad de varianza de Kolmogorov-Smirnow para los datos obtenidos en cada técnica y establecer que no cumplen con los supuestos de normalidad, se procedió a comparar las técnicas a través de la prueba no paramétrica de los rangos con signo de Wilcoxon, adoptando una significancia de p<0.05. Estas acciones se ejecutaron utilizando el software GraphPad Prism 5.0.
RESULTADOS
Los resultados del análisis de las muestras de heces con las soluciones de huevos de T. canis se muestran en el Cuadro 1 y Figura 1. Se evidencia que la técnica de Faust fue la única de las cuatro en estudio capaz de detectar la presencia de los huevos de T. canis, incluyendo las concentraciones mínimas de huevos no embrionados (10 y 50 hpg); aun cuando no existió una similitud cuantitativa con la concentración gold standard (Figura 1c); es decir, presenta diferencias significativas con los valores patrones (p<0.05). La técnica de Faust presentó en todas las concentraciones de huevos una alta desigualdad estadística (p<0.001 a p<0.0001), por debajo de los grados de contaminación de la gold standard.
La técnica de Kato-Katz, aun cuando no evidenció presencia de huevos de T. canis en las concentraciones de 10 y 50 hpg, se comportó con precisión a partir de 75 hpg y sin diferencias significativas con el gold standard para detectar cuantitativamente en la mayoría de las concentraciones de contaminación de muestras con huevos de T. canis (Figura 1d); no obstante, en las concentraciones de 100 y 250 hpg presentó resultados superiores (p<0.001) al gold standard.
La técnica de McMaster solo detectó la presencia de huevos de T. canis a partir de la concentración de 100 hpg, y siempre estuvo por debajo en la detección cuantitativa del grado de contaminación de las muestras fecales con huevos de T. canis (Figura 1a), encontrando diferencias significativas respecto al gold standard (p<0.05 y p<0.001), con excepción de la concentración de 500 hpg. Por último, la técnica de McMaster modificada mejorada detectó la presencia de huevos de T. canis a partir de la concentración de 70 hpg, pero tan solo en las concentraciones de 100 y 250 hpg fue similar al gold standard (Figura 1b).
Al comparar el hpg acumulado para cada una de las técnicas (Figura 2), se evidencia que la técnica de Kato-Katz presentó un comportamiento similar en grado de precisión cuantitativo que el gold standard, mientras que las otras tres técnicas fueron significativamente inferiores en detectar la cantidad de hpg (p<0.05).
La sensibilidad asociada al grado de precisión cuantitativo de cada una de las técnicas coprodiagnósticas respecto al gold standard se obtuvo a través del cálculo aritmético y mediante la curva ROC (Cuadro 2). Se evidencia que al reunir los resultados de las ocho concentraciones conocidas de huevos de T. canis en heces frescas de canes (gold standard) y al compararlos con los resultados obtenidos en cada una de las técnicas cuantitativas, el grado de precisión absoluto de la técnica Kato-Katz es alto (sensibilidad calculada de 74.72% (IC 95% 72.93-80.22 y curva ROC 0.53 IC 95% 0.36-0.70)).
Al analizar la precisión de cada prueba de coprodiagnóstico con las concentraciones de huevos de T. canis (Figura 3), se evidencia que el comportamiento de la sensibilidad diagnóstica para la mayoría de las técnicas en las concentraciones de 75 a 250 hpg se mejora notablemente respecto al gold standard (entre 60 y 100% de sensibilidad). Asimismo, a mayores concentraciones de hpg (750-1 000 hpg) existe un comportamiento de pérdida considerable de la sensibilidad diagnóstica a rangos oscilantes entre 45% a menos del 20%. Por su parte, la técnica de Kato-Katz presenta una sensibilidad diagnóstica cuantitativa constante entre 90-100% a partir de una concentración de 75 hpg.
DISCUSIÓN
Son muy pocos los estudios previos que se han centrado en la investigación de la sensibilidad de las técnicas coprodiagnósticas que se utilizan como pruebas rutinarias para la detección de parásitos gastrointestinales en su fase embrionaria (huevos), evaluando concentraciones conocidas (gold standard) de huevos de T. canis, nematodos que afectan con mayor frecuencia a perros, y donde los huevos embrionados de T. canis en el ambiente se consideran como la fuente más importante de toxocariasis humana (Nijsse et al., 2020). Por ello, el presente estudio es un aporte importante en determinar la sensibilidad de técnicas coprodiagnósticas para la detección cuantitativa de huevos de T. canis en heces de caninos, ofreciendo así un método diagnóstico rápido y eficiente en la práctica médica veterinaria.
Este estudio presenta un enfoque cuantitativo para estimar la sensibilidad de cuatro técnicas coprodiagnósticas que permiten la detección de huevos de T. canis. La técnica de Faust, una de las técnicas de flotación utilizadas en la rutina de diagnóstico cuantitati vo para parásitos gastrointestinales, proporcionó resultados satisfactorios en términos de detección en todas las concentraciones empleadas, aun si esta no presentó una similitud con el gold standard del estudio. Es decir, la técnica de Faust generó una apropiada capacidad de detección cualitativa de huevos de T. canis, pero no una adecuada cuantificación de estos. Estos hallazgos concuerdan con estudios que han obtenido falsos negativos, sobre todo cuando se emplea solo una muestra fecal por microscopia óptica, lo que disminuye la sensibilidad de diagnóstico (Uchôa et al., 2018), por lo que se puede inferir que la cantidad de muestras analizadas por paciente puede determinar la sensibilidad para esta técnica.
AUC: área bajo la curva ROC; +: sensibilidad por cálculo aritmético; IC 95%: intervalo de confianza 95%
a Sin diferencia significativa respecto al gold standard (p>0.05)
Al igual que la prueba Faust, la técnica de McMaster es una de las más usadas en Medicina Veterinaria para la detección de huevos helmintos gastrointestinales por su practicidad y rapidez de ejecución; pero es relativamente menos precisa que otros tipos de técnicas de flotación coprodiagnósticas. Das(2020) evaluó la exactitud y precisión de las técnicas de recuento de huevos a partir de McMaster y Mini-FLOTAC en heces de pollos, encontrando una similitud con los resultados obtenidos en este trabajo entre McMaster y McMaster modificado mejorado con una mayor sensibilidad en concentraciones más bajas cuando se utilizó McMaster modificado mejorado, detectando huevos desde 50 hpg. Esto puede deberse, entre otros factores, a las cámaras McMaster, las cuales se encuentran en el mercado en varios tamaños y volúmenes. Así, Estrada et al. (2002) compararon la eficacia de una de estas cámaras que consta con dos compartimientos y la de INTA con cuatro compartimientos encontrando que ambas cámaras son confiables; sin embargo, la cámara INTA ofreció mayores ventajas para la detección de huevos e identificación de animales acumuladores.
En la determinación de la sensibilidad de las pruebas coproparasitológicas que utilizan una solución de flotación, otro factor a tener en cuenta es la relación del peso de las muestras fecales al volumen de solución de flotación (Cringoli et al., 2004, Perecki et al., 2007). Este efecto de densidad sobre el peso específico de los huevos de Toxocara spp para su flotación (gravedad específica - GE - 1.10) (Cringoli et al., 2004), pudo ser un elemento influyente en la diferencia de sensibilidad entre McMaster y McMaster mejorado modificado (Cuadro 2), dado que las dos técnicas utilizan densidades distintas de la solución de flotación y sustrato diverso para el mismo, donde la GE de 1.27 para la solución de azúcar saturada y GE de 1.2 con la solución de sulfato de zinc, respectivamente. Esta puede ser una explicación plausible para los resultados diversos encontrados entre estas dos técnicas. Por otro lado, Bartlett et al. (1978) encontró que la solución FormalinaÉter fue más eficaz que el sulfato de zinc para la ejecución del McMaster modificado mejorado en la detección de huevos de parásitos gastrointestinales.
La técnica de Kato-Katz se ha descrito como la metodología más utilizada para el diagnóstico coprológico parasitario en humanos (OMS, 2019), especialmente en el diagnóstico cuantitativo de las infecciones intestinales humanas por helmintos transmitidos por el suelo (Bosch et al., 2021). Varios estudios parasitarios gastrointestinales en humanos reportan resultados de positividad diagnóstica similar a la sensibilidad hallada en este estudio para esta técnica; así, Carvalho et al. (2012) evaluó la precisión diagnóstica de diferentes métodos, entre ellos Kato-Katz, la cual presentó una tasa de positividad alta (74.6%) para el diagnóstico de Schistosoma mansoni; en tanto que Restrepo et al. (2013) reportó mejores resultados utilizando la técnica de Kato-Katz para la determinación de parásitos helmintos trasmitido por el suelo. Estos estudios demuestran que la técnica de Kato-Katz tiene una alta sensibilidad para diferentes especies de parásitos, reportándose sensibilidades mayores al 90% en algunos estudios (Cools et al., 2019).
Aunque la técnica de Kato-Katz no posee sensibilidad a concentraciones menores de 50 hpg, esta no se ve afectada en concentraciones de hpg medias o altas (cargas parasitarias medias o altas) manteniendo una estabilidad en sus resultados; a diferencia de las otras tres técnicas. Igualmente, Kato-Katz no presentó una diferencia significativa con el gold standard. Estos resultados ponen en evidencia que esta técnica sea la mejor en este estudio experimental para evaluar cuantitativamente la presencia de huevos no embrionados de T. canis en muestras de heces frescas de canes. Los resultados obtenidos respecto a esta técnica concuerdan con estudios donde la técnica de Kato-Katz da resultados confiables con alta sensibilidad para el diagnóstico de las geohelmintiasis intestinales más frecuentes en Colombia (Montresor et al., 1998), sin que se afecte la capacidad de detección en aquellas muestras cuyos niveles de parasitosis sean leves (Giraldo y Guatibonza, 2017).