INTRODUCCIÓN
La alimentación a base de carne cruda para gatos y perros se incrementado a nivel mundial (Schlesinger y Joffe, 2011). Estas dietas crudas se les denomina «Alimento Crudo Biológicamente Apropiado» (ACBA) o en inglés «Biologically Appropriate Raw Food» (BARF), pudiendo ser elaborados de forma casera y a nivel comercial. En general, se elabora a base de ingredientes crudos derivados de animales, pudiendo incluir músculos, órganos internos, grasa y huesos de mamíferos, peces o aves de corral, así como leche sin pasteurizar, huevos crudos y diversos vegetales (Freeman et al., 2013), y son vendidos en forma fresca o congelada (Freeman et al., 2013; Dadd et al., 2019).
Entre los beneficios de la alimentación con este tipo de dietas se encuentra la calidad nutricional, mejor palatabilidad, dientes y encías más sanas, pelaje más brillante, mejor microbiota intestinal, heces más duras y mejora de la energía del animal (Craig, 2020). Este tipo de alimentación cruda promueve un crecimiento más equilibrado de comunidades bacterianas y, por ende, un cambio positivo para las funciones intestinales saludables (Sandri et al., 2017); sin embargo, los perros poseen un mayor riesgo de infecciones oportunistas (Kim et al., 2017).
Morelli et al. (2019) encontraron que el 60% de los propietarios eligieron este tipo de alimentación por información encontrada en el Internet y que el 94% considera el BARF como una alimentación segura. No obstante, Anturaniemi et al. (2019) reportó la trasmisión de patógenos desde el alimento crudo para mascotas a los humanos, donde Escherichia coli (E. coli) fue el agente causal. En la actualidad, existen diversos estudios que indican los riesgos potenciales para la mascota asociados al uso de la alimentación con BARF (Aquino, 2020), siendo una minoría de estas dietas elaboradas por médicos veterinarios especializados en el área de nutrición (Morelli et al., 2019). Se ha reportado que hasta el 95% de recetas elaboradas en casa presentan por lo menos un nutriente por debajo del mínimo dado por la Association of American Feed Control Officials (AAFCO) y que hasta 83% contenía múltiples deficiencias (Stockman et al., 2013).
El tema más discutido en la actualidad es el riesgo para la salud animal y la salud pública, debido a la posible contaminación de BARFs con agentes patógenos. Van Bree et al. (2018) evaluaron 35 dietas comerciales congeladas de ocho empresas a base de carne cruda, aislando E. coli O157:H7 en el 23%, E. coli productoras de betalactamasas de espectro extendido en el 80%, además de contaminaciones con Listeria monocytogenes, Salmonella spp y parásitos como Sarcocystis cruzi y Toxoplasma gondi; evidenciando la presencia de múltiples agentes patógenos en las dietas BARFs.
E. coli es un patógeno que toma gran relevancia en enfermedades trasmitidas por alimentos (ETA). Es un bacilo gramnegativo, anaerobio facultativo, de la familia Enterobacteriaceae, la cual puede encontrarse como miembro comensal de la microbiota intestinal de animales y humanos; sin embargo, algunas cepas resultan ser patógenos causales de enfermedades intestinales y extra intestinales (Mainil, 2013). La presencia de E. coli patógena puede generar en el perro una colibacilosis, produciendo daño a nivel del tracto gastrointestinal (Zotta et al., 2015).
Los serotipos de E. coli patógenos que causan daño a nivel intestinal ocasionando diarreas en el hospedador se les denomina E. coli diarreogénica, los cuales a su vez se subdividen en seis patotipos: enterotoxigénica (ECET), enteropatógena (ECEP), enteroinvasiva (ECEI), enteroagregativa (ECEA), enterohemorrágica (ECEH) y de adherencia difusa (ECAD) (Rodríguez-Angeles, 2002; Mainil, 2013). La ECEH también es conocida como productora de toxina Vero o toxina semejante a Shiga (VTEC o STEC); siendo la cepa más frecuente de este subgrupo la E. coli serotipo O157:H7 (Saeedi et al., 2017), Esta cepa tiene gran relevancia en investigaciones a nivel mundial, debido a su alta patogenicidad, y su relación en cuanto a su presencia en productos crudos de consumo humano y animal, teniendo al bovino como su principal reservorio (Rodríguez-Angeles, 2002; Saeedi et al., 2017).
La resistencia bacteriana a antimicrobianos adquiere importancia debido a que puede ser adquirida por las mascotas a través del consumo de productos BARFs contaminados. Una investigación en Lima, Perú, reveló un elevado nivel de resistencia de antimicrobianos en carne de pollo, res y cerdo de mercados de abasto (Ruiz-Roldan et al., 2018). Asimismo, se ha reportado un alto porcentaje de resistencia a antimicrobianos de bacterias presentes en dietas crudas, especialmente a cefalosporinas de tercera generación y productoras de betalac-tamasas de expectro extencido (BLEEs) (Nuesch-Iderbinen et al., 2019).
Se plantea que los médicos veterinarios deben tomar un rol más activo con relación a la toma de decisión de los dueños en cuanto a la alimentación de su mascota y los riesgos que implican las dietas tipo BARF. Para que la intervención del veterinario tenga más relevancia, es importante que posean los conocimientos y la data previa necesaria para entender en su totalidad la situación epidemiológica y poder asesorar correctamente a los propietarios (Hinney, 2018). De esta manera, el objetivo del presente estudio fue determinar la presencia de E. coli O157:H7 y resistencia antimicrobiana en alimentos tipo BARF para perros, que se comercializan en los distritos de Lima, Perú.
MATERIALES Y MÉTODOS
Población y Muestra
La población del estudio comprendió unidades de dietas comerciales BARF congeladas, que son comercializadas en Lima Metropolitana y que fueron obtenidas entre julio y diciembre de 2019. El tamaño de muestra se estimó utilizando 23% de prevalencia obtenida de un estudio similar realizado en Europa (Van Bree et al., 2018), debido a que no existen estudios similares realizados en el Perú o Latinoamérica. Se empleó un 95% de confiabilidad y 5% de error; utilizándose la siguiente fórmula de presencia o ausencia (Thrusfield, 2005): n = (1-(1-NC)1/d) * (n-(d1)/2), donde NC = Nivel de confianza, N = Tamaño de la población de referencia, d = Prevalencia esperada, n = Tamaño mínimo de muestra. El tamaño muestral mínimo obtenido fue de 120 muestras; sin embargo, se evaluaron 124 muestras, las cuales fueron obtenidas de 15 marcas comerciales disponibles en la ciudad.
Muestreo y Lugar de Estudio
El estudio fue de tipo observacional, prospectivo, descriptivo y transversal. Se realizó un muestreo aleatorio en el universo de muestras disponibles en comercialización. Se seleccionó como muestras a aquellos alimentos tipo BARF para perros, fabricados a base de carne cruda de origen animal y de vegetales crudos, los cuales se encontraron de forma congelada. Estos productos eran comercializados vía delivery y/o en tiendas veterinarias.
El procesamiento de las muestras se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Científica del Sur, localizada en Villa el Salvador, Lima, Perú. Las muestras fueron almacenadas en congelamiento (-18 °C) y llevadas al laboratorio dentro de cajas térmicas, conservando la cadena de frío. Una vez recibidas en el laboratorio fueron descongeladas y llevadas a temperatura ambiente.
Identificación de Escherichia coli
Los alimentos fueron homogenizados. La identificación de E. coli se realizó de forma convencional (INS, 2001). Para esto, se tomaron 10 g por muestra homogenizada y puestas en un enriquecimiento previo en caldo Tripticasa de soya a 37 °C por 24 h, luego fueron sembradas en agar MacConkey y EMB (Eosina y Azul de Metileno agar) e incubadas a 37 °C por 24 h. Las cepas sospechosas de E. coli fueron confirmadas a través de las pruebas bioquímicas: LIA (Lisina Hierro agar), citrato de Simmons, SIM (sulfidrilo-indol-motilidad), urea y TSI (Triple Sugar Iron agar), cultivadas a 37 °C por 24 h. Además, algunas de las cepas confirmadas se les hizo la tinción Gram para ser observadas al microscopio.
E. coli serotipo O157:H7
Las cepas compatibles con E. coli fueron subcultivadas en agar MacConkey sorbitol. Las colonias que no fermentaron sorbitol (colonias incoloras) fueron aisladas y sometidas al E. coli O157 Latex Test (Oxoid TSMX4147C), el cual posee partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos específicos reactivos al antígeno somático O157. Para la serotipificación se utilizó RIM E. coli O157:H7 Latex Test (Oxoid TSMX9410), con similar mecanismo a la prueba antes mencionada, resultando positivo la aglutinación.
Resistencia a Antimicrobianos
Las cepas positivas a E. coli confirmadas mediante las pruebas bioquímicas fueron almacenadas en crioviales con caldo Tripticasa de soya hasta ser nuevamente analizadas. Se determinó la sensibilidad antimicrobiana frente a 12 fármacos, mediante el método de difusión en disco (método KirbyBauer), siguiendo el modelo de la guía CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI, 2018). Los antimicrobianos fueron: Ac. Nalidíxico (30 µg/ml), Azitromicina (15 µg/ml), Imipenem (10 µg/ml), Cotrimoxazol (25µg/ml), Gentamicina (10 µg/ml), Cloranfenicol (30 µg/ml),Amoxicilina con Ácido clavulánico (30 µg/ml), Ciprofloxacina (5 µg/ml), Furazolidona (100 µg/ml), Nitrofurantoina (300 µg/ml), Ampicilina (10 µg/ml) y Tetraciclina (30 µg/ml). Las cepas fueron sembradas en agar Muller Hinton, posteriormente se ubicaron seis discos en cada placa, y se incubaron nuevamente a 37°C por 24 h.
RESULTADOS
El 65.32% (81/124) de las muestras fueron positivas a E. coli (IC95%: 56.9-73.7%), sin que se haya identificado alguna cepa como E. coli serotipo O157:H7. Los resultados indican que 8 de las 15 marcas comerciales presentaron no menos del 80% de muestras positivas a E. coli (Cuadro 1).
De los insumos, la carne de res fue el tipo de proteína más utilizada y evaluada, encontrando 73.3% (22/30) de muestras positivas a E. coli. Asimismo, de las muestras con pollo el 38.1% resultó positivo (8/21) y las de pavo 85.7% (12/14) (Cuadro 2).
Del total de muestras positivas a E. coli, 38.2% de las colonias evaluadas resultaron resistentes y el 17.0% fueron intermedias. En ampicilina, cotrimoxazol, ácido nalidixico y cloranfenicol se encontró un porcentaje de resistencia superior al 50%, mientras que para la tetraciclina, furazolidona e imipenem fue superior al 30%. Solo una colonia evaluada contra azitromicina resulto resistente (Cuadro 3).
DISCUSIÓN
El presente estudio no identificó cepas E. coli O157:H7 en las muestras analizadas; sin embargo, a nivel de Latinoamérica se han reportado prevalencias de 1.4 y 3.5% en Argentina y Brasil, respectivamente de E. coli O157:H7 productora de toxina Shiga en productos cárnicos de res (Morato et al., 2007; Jure et al., 2015), y 1.5% en carne molida en Perú (Mendez et al., 2013). A nivel internacional, se ha reportado en Turquía y Etiopia 1.9 y 10.2% de muestras positivas de carne de pollo y en carnes, respectivamente (Bekele et al., 2014; Dincoglu y Gunulalan, 2016), en tanto que en España en preparados cárnicos y en Sudáfrica en carne seca, carne picada y embutidos se le aisló en 19.4 y 2.8% de las muestras, respectivamente (Abong’o y Momba, 2009; Ripodas et al., 2017). Los reportes de hallazgos en diversos países confirman la alta posibilidad y el potencial riesgo de la presencia de este serotipo; por lo que, el uso de una técnica más sensible, otras circunstancias de muestreo, o un mayor número de muestras analizadas podría haber permitido el aislamiento de cepas E. coli O157:H7 en el presente estudio.
El 65.3% (81/124) de las muestras positivas a E. coli (IC : 56.9-73.7%) en el presente estudio se encuentra dentro del rango de resultados reportados en muestras de mercados de abasto de la ciudad de Lima. Así, Mendez et al. (2013) reportó 87.2% positivos en muestras de carne molida y Lucas et al. (2016) de 42% de puestos de venta de carne de pollo. Esto representa un riesgo importante, pues la mayoría de los insumos necesarios para la elaboración del BARF son adquiridos en este tipo de mercados. A su vez, Weese et al. (2005) reportaron que los coliformes fueron hallados en todas las muestras de dieta cruda comercial que evaluaron, donde E. coli fue identificada en el 64%, similar al reporte del presente estudio. En este sentido, Van Bree et al. (2018) reportaron un porcentaje aún más elevado (86%) de aislamiento de E. coli en dietas crudas comerciales congeladas.
En el total de muestras de cinco marcas se aisló E. coli como contaminante, pese a que las muestras provenían de lotes diferentes. Esto posiblemente se debe a que los insumos utilizados ya se encontraban contaminados desde el puesto de venta donde fueron adquiridos (mercados de abasto), o que en uno o varios puntos de la cadena de producción haya un mal manejo o equipos contaminados, representando un riesgo permanente de contaminación.
El gran porcentaje de positivos (65.3%) a E. coli puede deberse a que las dietas BARF son productos altamente manipulados, incrementando de esta manera el riesgo a la exposición de agentes patógenos. La carne molida, base de la mayoría de las dietas evaluadas, por su gran manipulación es aún más susceptible a la contaminación microbiana (Mendez et al., 2013).
La carne de res fue el tipo de proteína más utilizado en la preparación de las dietas BARF, y pese a que no se encontró E. coli O157:H7, el bovino es considerado como su principal reservorio. No obstante, el 73.3% de muestras positivas a E. coli en alimentos con base de carne de res fue encontrado en el estudio, valor superior al 65.7% reportado por Strohmeyer et al. (2006). Por otro lado, la carne de aves de corral, ingredientes muy utilizados en las dietas crudas, se convierte en posible fuente de contaminación, debido a una potencial contaminación cruzada durante su manipulación (Lucas et al., 2016).
No solo los productos de origen animal son una fuente de contaminación. Un estudio realizado en Lima por Muñoz et al. (2013), reportó que el 18.9% de verdura fresca presentó niveles de E. coli fecales superior a lo establecido como apto por la ICMSF (International Commission on Microbiological Specification for Foods), siendo la espinaca la más contaminada.
Se encontró 38.2% de nivel de resistencia a 12 antimicrobianos, porcentaje mayor al 23% reportado por Nilsson (2015) en muestras de dietas crudas para perros. Ampicilina fue el antimicrobiano con el mayor nivel de resistencia (68.67%), porcentaje inferior al 94.6% reportado en carne de pollo y del 95.4% en carne de cerdo, pero superior al 44% en carne de res (Ruiz-Roldan et al., 2018). En segundo nivel de resistencia está el cloranfenicol (67.26%), porcentaje inferior al 82.1% encontrado en carne de pollo, pero superior al 4% en carne de res y de 54.5% en carne de cerdo (Ruiz-Roldan et al., 2018). Los resultados indican que este tipo de dietas puede ser una fuente potencial de agentes resistente a fármacos de primera elección (Nilsson, 2015).
A diferencia de los alimentos de consumo humano, no hay una autoridad especifica que sea responsable del monitoreo microbiológico continuo de los alimentos para perros a base de productos crudos como las dietas tipo BARF (Strohmeyer et al., 2006). En el Perú, el Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA), es la entidad encargada de la inocuidad agroalimentaria, mas no posee reglamentación específica para las dietas crudas para mascotas; exponiendo a estos animales a este tipo de prácticas.
La ausencia de positivos para la cepa O157:H7 en este estudio pudo ser distinto con la utilización de otro tipo de serotipificación, tal como la separación inmunomagnética (Jure et al., 2015), test de concentración por inmunocaptura (Marzocca et al., 2006) o molecularmente mediante PCR (Mora et al., 2007; Mendez et al., 2013; Lucas et al., 2016), reportes que respaldan la presencia de esta bacteria en diversos productos cárnico.
CONCLUSIONES
No se aisló E. coli serotipo O157:H7 en las muestras de alimentos tipo BARF destinadas a la alimentación de perros en la ciudad de Lima, Perú.
En el 65.3% (81/124) de las muestras analizadas de alimento tipo BARF se aisló E. coli.
El 100% de las cepas presentaron resistencia a al menos a un antimicrobiano, siendo la resistencia a la ampicilina la frecuencia más alta (68.7%, 46/67) y la frecuencia más baja correspondió a la azitromicina con un 1.5% (1/67).