INTRODUCCIÓN
Colombia se ubica entre los primeros 11 productores de carne a nivel mundial; sin embargo, las exportaciones de este producto son bajas (<1%) (MADR - MCIT, 2010), debido a la falta de calidad de carne competitiva que requieren los mercados mundiales. Según el CONPES 3376 de la política sanitaria y de inocuidad de las cadenas de carne bovina y leche, solo el 1% de las 1311 plantas de beneficio que aproximadamente existen en el país, cumplen con los requisitos sanitarios y ambientales (CONPES, 2005).
Escherichia coli es un bacilo gramnegativo de la familia Enterobacteraceae. Bacteria anaeróbica facultativa, quimiorganotrófica, capaz de crecer con metabolismo respiratorio y fermentativo. E. coli tiene una función útil en el cuerpo inhibiendo el crecimiento de especies de bacterias patógenas y sintetizando cantidades apreciables de vitaminas (Stecher y Hardt, 2008; Bélanger et al., 2011). E. coli biotipo 1 no patógena, llamada también E. coli genérica, es indicador de contaminación de los alimentos con materia fecal por bacterias perjudiciales o patógenas para el hombre que tienen como hábitat común el intestino (Michanie, 2003).
E. coli se clasifica en seis grupos: E. coli enteropatógena (EPEC), STEC, E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), y un nuevo patotipo E coli invasiva adherente (AIEC) (Croxen et al., 2013). E. coli enterohemorrágica es un subconjunto de cepas patógenas STEC (OMS, 2015; Heredia y García, 2018). E. coli O157:H7, del grupo filogénico E, es una cepa enterohemorrágica (EHEC) que produce grandes cantidades de una o más toxinas relacionadas, que causan daño severo en el revestimiento del intestino (Feng y Reddy, 2013; OMS, 2018); toxinas que están estrechamente relacionadas con las toxinas producidas por Shigella dysenteriae. La enfermedad aguda causada por la bacteria es llamada colitis hemorrágica y es caracterizada por severos cólicos y diarrea (OMS, 2018). Adicionalmente, la infección por E. coli O157:H7 puede causar el síndrome urémico hemolítico (SUH), enfermedad severa caracterizada por hemolisis y fallos renales (Raina et al., 2019). Su nombre se origina del antígeno somático [O] 157 identificado y el séptimo antígeno flagelar [H]. El antígeno [O] se deriva de la pared celular y el [H] del flagelo que se encuentra solo en especies motiles (Bryan et al., 2015).
El ganado es uno de los principales reservorios de E. coli O157:H7. La contaminación de la canal durante el sacrificio es la ruta primaria que últimamente conduce a la contaminación de la carne picada de vacuno (Varela-Hernández et al., 2007; FSIS, 2015; Jure et al., 2015; ACHIPIA, 2018). Sin embargo, también se ha identificado a otros alimentos como la lechuga, coles de bruselas, hortalizas, leche cruda y el agua como vehículos de su transmisión (Rubeglio y Tesone, 2007; Puig-Peña et al., 2013; CDC, 2018).
Asimismo, el contacto directo con animales portadores del microorganismo se ha reconocido como una fuente de infección (FAO, 2011; Franco-Anaya et al., 2013).
Por otro lado, la alta demanda de productos animales para el consumo como fuente principal de proteínas en la dieta, debido al crecimiento de la población humana y la globalización, han conllevado a un mayor movimiento de alimentos a nivel mundial (OMS, 2015), que junto a malas prácticas en el procesamiento, aumentan el riesgo de contaminación por patógenos transmitidos por alimentos en cualquier punto desde la granja hasta la cadena de tenedores (Wilson et al., 1996; FAO, 2007; Dhama et al., 2013; Heredia y García, 2018).
Este microorganismo fue identificado en Colombia en 1996; sin embargo, son pocos los trabajos realizados acerca de la frecuencia de esta bacteria en productos alimenticios. En la sabana de Bogotá, se registró E. coli O157 en 1/300 muestras de productos cárnicos y lácteos artesanales (Franco et al., 2001) y en Córdoba se identificó E. coli O157:H7 en el 2% de canales bovinas y 10% en carne molida (Piedrahita et al., 2001), de allí la importancia que este microorganismo se contemple dentro de análisis de riesgos y puntos críticos de control de las plantas de beneficio, al ser un agente etiológico de brotes de Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) en la región (Mattar et al., 2001; Medina et al., 2010; Rúgeles et al., 2010; GómezDuarte, 2014). Se desconoce la prevalencia de E. coli O157: H7 en carne bovina en el departamento del Atlántico, a pesar de contar con las plantas de beneficio más grandes del país (Bonivento-Calvo et al., 2011). Ante esto, el objetivo del presente trabajo consistió en determinar la prevalencia de E. coli biotipo I y E. coli O157:H7 en los bovinos sacrificados en plantas de beneficio del departamento del Atlántico (Colombia).
MATERIALES Y MÉTODOS
Población de Estudio y Muestreo
La población de estudio estuvo conformada por canales de bovinos de las plantas de beneficio ubicadas en los municipios de Soledad, Malambo, Galapa y Sabanalarga en el departamento del Atlántico, Colombia durante los meses de marzo a septiembre de 2013. En la Región Caribe, el periodo de las precipitaciones anuales se presenta entre mayo a octubre y el periodo seco entre de diciembre a abril. Estas empresas se encuentran registradas ante el Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos (INVIMA).
Para la selección de las plantas de beneficio se realizó un muestreo aleatorio simple y se calculó el tamaño de la muestra a través del software Epi Info 3.2.2, basándose en una prevalencia de E. coli O157: H7 del 2%, con un nivel de confianza de 95% y un error permitido de 5%. El tamaño de la muestra calculado fue de 224 canales de bovino; los cuales, se distribuyeron de forma proporcional de acuerdo con el porcentaje que aporta cada planta de beneficio al total de producción día.
Las muestras de canales de bovino se tomaron empleando el método de la esponja (Malandrini et al., 2001; Rodríguez-Cordero y Carrascal-Camacho, 2016). Durante el proceso de toma de muestras se recolectó información epidemiológica de los bovinos analizados tales como: sexo, edad, procedencia del animal y número de guía de transporte. Las muestras se mantuvieron en cadena de frío a 4 °C y se transportaron al Laboratorio de Salud Pública del departamento del Atlántico para su procesamiento.
E. coli Biotipo 1 y E. coli O157:H7
La determinación de E. coli O157:H7 se realizó empleando el método de VIDAS UP E. coli O157 (incluyendo H7) (ECPT) que se basa en la metodología ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay). El análisis se realizó teniendo en cuenta los procedimientos establecidos para leche cruda, quesos de leche cruda y muestras ambientales de entornos de producción. Los resultados positivos fueron aislados en Agar McConkey sorbitol (SMAC) (bioMérieux) con cefixima y telurito e incubados a 37±1 °C, durante 1824 horas y Agar ChromoID O157:H7 (bioMérieux), sin la mezcla de cefixima y telurito e incubados a 37 °C durante 18-24 horas. Los resultados de colonias sorbitol negativas positivas para E. coli O157:H7 fueron confirmadas utilizando el kit E. coli O157 Látex Test (Oxoid, Alemania) para la aglutinación con suero anti-O157.
La determinación de E. coli biotipo 1 se realizó en agar TBX pH 7.2 (Tryptone Bile Glucuronic Agar, por sus siglas en inglés, Oxoid) por el método ISO 16649-2:2000: Microbiology of food and animal feeding stuffs-horizontal method for the enumeration of β-glucuronidase positive E. coli.
Cepas de Referencia y Metodología
Como cepas de referencias se incluyeron las cepas de E. coli ATCC 25922 y un aislado de E. coli O157:H7 donado por el Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos (INVIMA) y utilizados en los procesos de verificación y aseguramiento de calidad. Asimismo, se incluyó la cepa Staphylococcus aureus ATCC 29213 como control negativo en los procesos de aseguramiento de calidad de determinación de E. coli biotipo 1.
Se realizaron pruebas de estandarización del inóculo de E. coli O157:H7, con concentraciones bacterianas teóricas de 1000, 100, 10 y 1 UFC/ml, con un tiempo de incubación de 24 horas. En la verificación de la metodología VIDAS se realizó la adición de E. coli O157:H7 a muestras de superficie de carne de canal adicionada con vancomicina, con el objeto de verificar la capacidad de recuperación del microorganismo en la matriz de trabajo. Se trabajaron las diluciones: 10-10, 10-9, 10-8 y la concentración de UFC fue confirmada por recuento en placa con Agar Plate Count (Merck) realizado por duplicado.
Los medios de cultivos utilizados durante el desarrollo del estudio fueron valorados de acuerdo con lo descrito por la norma ISO 11133-2/ 2011.
Análisis de Datos
Los datos de estandarización del inóculo fueron transformados a logaritmo base 10 y se realizó un análisis de regresión, estimándose el coeficiente de correlación de la curva. Para los análisis de prevalencia de E. coli O157:H7 y E. coli biotipo 1 se realizó un análisis univariado de las variables cuantitativas, con una estadística descriptiva de acuerdo con el tipo de variable analizada. Los datos fueron analizados a través de Microsoft Excel 2013 y SPSS v. 23. Los resultados obtenidos fueron comparados con los valores máximos permisibles descritos en la Resolución 2905 de 2007, ratificada por la Resolución 2690 de 2015 del Ministerio de Protección Social y Ministerio de Agricultura y Desarrollo Social (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural y Ministerio de Salud y Protección social, 2015).
RESULTADOS
Estandarización de Inóculo y Verificación de Método VIDAS
Los resultados de estandarización del inóculo de E. coli O157:H7 mostraron un buen ajuste de los recuentos obtenidos con un coeficiente de correlación de 0.976 de la curva de calibración del microorganismo y con medidas de dispersión que permitieron realizar fortificaciones de las muestras de frotis de canales de reses con un nivel de precisión suficiente para verificar el método VIDAS UP E. coli O157 (incluyendo H7) (Cuadro 1 y Figura 1).
En cuanto a la verificación del método VIDAS UP E. coli O157 (incluyendo H7), los resultados demostraron un límite de detección de 1.5 ± 0.7 UFC/cm2 de E. coli O157:H7. No se observaron falsos positivos ante la inoculación de otra cepa de E. coli en las muestras (Cuadro 2).
Prevalencia de E. coli O157:H7 y E. coliBiotipo 1
Se encontró una prevalencia de E. coli O157:H7 de 0.45%. Asimismo, las muestras que no se encontraron conforme a lo establecido en la Resolución 2905 de 2007, ratificada por la resolución 2690 de 2015, presentaron recuentos de E. coli biotipo 1 genérico mayores a 100 UFC/cm2 y prevalencia de 0.89% (Cuadro 3); sin embargo, las concentraciones de E. coli biotipo 1 oscilaron entre 1 UFC/cm2 y 758 UFC/cm2 en las muestras analizadas, y con presencia de E. coli en 54% de las canales. El recuento se basó en la norma NTC 1325 quinta actualización que indica como referencia <100 UFC/cm2 (39, 40) (NTC 1325, 2008).
En cuanto a la muestra positiva para E. coli O157:H7, la canal bovina correspondió a una hembra de 3 años proveniente del departamento de Sucre (Cuadro 4). Las muestras de E. coli biotipo 1 con recuentos superiores a 100 UFC/cm2 correspondieron a un macho de 3 años y una hembra de 6 años, provenientes de los departamentos de Cesar y Atlántico, respectivamente. Un alto porcentaje de las reses que fueron procesadas provenían de los departamentos de Magdalena, Atlántico y Cesar (46.4, 17.8 y 15.2%, respectivamente). Además, un gran porcentaje de las reses sacrificadas (78.1%) correspondían a machos, de estos, (68.3%) de 3 años de edad, provenientes de los departamentos de Magdalena, Cesar y Atlántico.
DISCUSIÓN
En este estudio se evidenció que 54% de las canales de bovino de 224 canales analizadas se encontró la presencia de E. coli biotipo 1 genérica a partir de técnicas microbiológicas tradicionales. La presencia de este microorganismo en un alimento indica una contaminación directa o indirecta de origen fecal; no obstante, no constituye un indicio directo de la presencia de un patógeno, sino que implica solamente un cierto riesgo de que pudiera estar presente (Stevens et al., 2003).
La determinación de E. coli O157 se realizó mediante la metodología VIDAS® UP E. coli O157 (incluyendo H7), Vitek Inmuno Diagnostic Assay System (bioMérieux), que es un método establecido como rápido y de rutina por su facilidad de ensayo, emplea anticuerpos monoclonales o policlonales para detectar microorganismos patógenos y ha sido adoptado por la Association of Oficial Analytical Chemists (AOAC). Los resultados fueron confirmados a su vez por medio del kit E. coli O157 Látex Test (Oxoid) para la aglutinación con suero anti-0157. El método VIDAS UP es mucho más rápido y efectivo que los métodos tradicionales para detectar E. coli O157 (Fung, 2002; Law et al., 2015).
El uso de esta metodología para la detección de E. coli O157 ha sido reportado en diversas matrices; por ejemplo, en muestras de quesos de leche cruda (Carvalho-Nunes et al., 2014), en leche cruda y muestras de menudo de pollo (Reuben et al., 2003). Así mismo, Elizaquível-Bárcenas (2009) comparó tres kits comerciales para detección de E. coli O157, incluyendo el VIDAS UP, contra una metodología de qPCR (PCR en tiempo real) demostrando una mayor especificidad para la metodología VIDAS UP, donde detectó una cantidad inicial de 10 UFC en tanto que fue de 100 UFC para qPCR.
Al realizar la estandarización de inóculos y verificación de técnicas en este estudio se pudo demostrar que la técnica VIDAS UP es igualmente eficaz en cuanto a la especificidad a lo reportado por la literatura, ya que se comprobó que la técnica detecta desde 1 UFC. Las ventajas de la PCR se cuestionan para la detección de patógenos en alimentos, ya que se puede detectar células muertas y que su sensibilidad está limitada por el tamaño de la muestra en el tubo de reacción. Estas limitaciones se han abordado introduciendo un paso de enriquecimiento previo a la detección por PCR, lo que permite el crecimiento de las células vivas y la recuperación de las células dañadas, aumentando su número y en consecuencia la sensibilidad en la detección (Elizaquível-Bárcenas, 2009).
La identificación de la presencia de E. coli O157:H7 en carne vacuna de consumo es un tema de gran impacto para la salud pública a nivel mundial. Entidades como la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) reconocen al ganado bovino como el principal reservorio natural de esta cepa infecciosa de E. coli, y a la carne fresca y la leche cruda como los vehículos más comunes de infección para el humano, principalmente el consumo de carne molida mal cocida (OMS, 2015, 2018).
Las condiciones de la cadena de producción son diferentes de un país a otro, lo que se refleja en la prevalencia de E. coli O157 en carne de bovino. En una revisión realizada en reportes del Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) en los Estados Unidos, se hallaron 350 reportes en 49 estados de brotes de la cepa de E. coli O157:H7 entre 1982 y 2002, en los cuales se confirmó a la carne molida contaminada como el vehículo de contagio en 41% de los casos (Rangel et al., 2005). Por otro lado, en Chile y Argentina se ha reportado ampliamente la presencia de esta cepa en carne vacuna para consumo, mayormente en carne molida, debido al mayor riesgo de infección durante las fases de procesamiento (Brusa et al., 2009; Masana et al., 2010; Jure et al., 2015; Cap et al., 2019). Asimismo, en un estudio realizado en México se identificó E. coli O157:H7 en el 2.6% de las muestras de canales bovinas (Reyes-Rodríguez et al., 2013), mientras que, en Lima, Perú, se aisló E coli. O157:H7 en 1.54% de 195 muestras de carne molida fresca obtenida de diferentes mercados de abastos de la ciudad (Méndez et al., 2013).
En Colombia no se ha determinado una prevalencia concreta de E. coli O157:H7 en carne bovina; sin embargo, Mattar y Vásquez (1998) indicaron una incidencia en bovino sanos de 6.5%, comprobando que el ganado sano es efectivamente un reservorio de este agente de importancia para la salud pública. Dadas estas cifras, la investigación para determinar la presencia de E. coli O157:H7 se ha convertido en un área de investigación importante para los implicados en el sector de producción bovina; sin embargo, el estudio de Rúgeles et al. (2010) y el presente, si bien determinan una baja presencia de E. coli O157:H7, también son indicativos que estas cifras han disminuido notablemente con el paso de los años, posiblemente, por la implementación de políticas públicas que han impactado en los procesos de calidad al interior de las plantas de beneficio del país. No obstante, cabe indicar que 81% de las plantas de beneficio en Colombia son propiedad de los municipios y operan sin consultar la normatividad, ni los factores ambientales, sanitarios y de mercado que los haga viables; por tanto, no cumplen los requisitos ambientales, ni sanitarios y de ellos, 41% sacrifica en el piso (Acero et al., 2013).
CONCLUSIONES
La técnica VIDAS UP aporta una alternativa con alta sensibilidad y especificidad de acuerdo con lo reportado por la literatura y lo encontrado en este estudio. Además, presentó un desempeño óptimo en las matrices cárnicas evaluadas.
Se encontró una baja prevalencia de E. coli O157:H7; sin embargo, ante la presencia de esta cepa patógena en el departamento del Atlántico, se debe fortalecer su vigilancia, extendiéndola a expendios y distribuidores.
En el 54% de las canales de bovino se evidenció E. coli biotipo 1 generica