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INTRODUCCIÓN
En la actualidad, existe deficiencia en la producción de alimentos para ratas de laboratorio de tipo comercial en Venezuela, lo cual se traduce en una reducción de los estudios médico-farmacéuticos. Ante esto, se decidió elaborar una dieta semi-purificada con base de clara de huevo (Semi-purified egg white protein diet, EWP) para roedores de laboratorio, que satisfaga sus requerimientos nutricionales y les permita un correcto desarrollo. Dicha dieta integró alimentos endógenos que combinados reunieron los requerimientos nutricionales necesarios para el crecimiento y mantenimiento de los roedores, según los lineamientos del Instituto Americano de Nutrición (AIN) para animales de laboratorio (Bieri et al., 1977). En la experimentación animal, el AIN es ampliamente usado como referencia en estudios clínico-biológicos en ratas y ratones, ya que mantiene el crecimiento adecuado de los animales, cumpliendo con sus necesidades energéticas, de macro y micronutrientes (Reeves et al., 1993a).
MATERIALES Y MÉTODOS
Dieta
La dieta EWP fue preparada con ingredientes endógenos, bajo las indicaciones reportadas por el AIN, según los requerimientos energéticos para ratas en crecimiento y mantenimiento, AIN-93G, AIN-93M (Reeves et al., 1993b) (Cuadro 1). Todos los ingredientes fueron agregados en sus condiciones originales, salvo el maíz y el huevo. El maíz fue procesado en un molino de cuchillas (Fritsch GmbH Pulverisette11) a un tamaño de partículas de 0.5 mm y luego fue tamizado. La clara de huevo fue deshidratada en estufa Memmert U-40 a 42 °C durante la noche y pulverizada en una licuadora convencional durante 4 min. Por su parte, las vitaminas (AIN-93-VX) (UPAE-INRA) y los minerales (AIN-93G-MX) (MP Biomedicals), fueron donados al laboratorio. La composición de ambas mezclas se halla publicada en el trabajo de Reeves et al. (1993b). La harina de arroz, el aceite de maíz y el papelón negro (también conocido como dark brown sugar, panela, piloncillo o chancaca) fueron obtenidos de manera comercial. Los ingredientes fueron mezclados mecánicamente durante 15 min en un procesador de uso doméstico. Se realizó análisis proximal y mineral de las dietas (Cuadros 2 y 3).
Cuadro 1 Composición de las dietas experimentales
1 Dieta AIN para roedores en crecimiento y gestantes 2 Dieta AIN para roedores adultos 3 Dieta semi-purificada con base de clara de huevo Los valores son expresados en gramos por kilogramo de dieta (g/kg)
Cuadro 2 Análisis proximal de dietas AIN-93G, AIN-93M, control y EWP
1 Dieta AIN para roedores en crecimiento y gestantes 2 Dieta AIN para roedores adultos 3 Dieta semi-purificada con base de clara de huevo
Análisis Proximal y de Minerales
La composición química se determinó según los métodos estándares indicados por la Asociación Oficial de Químicos Agrícolas (A.O.A.C.) (Horwitz y Latimer, 2005). El contenido de carbohidratos totales fue calculado por diferencia en base seca. El contenido mineral en las muestras se determinó según métodos descritos en la literatura (Windsor y Denton, 1978; Olivares et al., 2016).
Animales
Las ratas se obtuvieron del Bioterio Central del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC). Se mantuvieron con agua y comida ad libitum hasta el día de su sacrificio y se alojaron en salas con temperatura controlada (22 °C) con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12h. Las ratas fueron manipuladas de acuerdo con las recomendaciones del Comité de Bioética del IVIC y la Directiva de la CE 86/609/CEE para experimentos con animales.
Experimento 1
Se trabajó con 12 ratas macho de la cepa Sprague Dawley (SD), los cuales fueron alimentados desde su destete (cuarta semana de vida), con dieta control (dieta comercial estándar para roedores: Protinal®). En el transcurso de la semana cinco a seis de vida, las ratas fueron distribuidas de manera aleatoria en dos grupos: seis alimentadas con dieta control y seis con dieta EWP, esta última preparada en el Laboratorio de Fisiología Molecular del Centro de Biofísica y Bioquímica del IVIC. Ambos grupos se mantuvieron bajo tratamiento durante seis semanas. Se registró el peso corporal (PC) cada dos días y la evaluación clínica diariamente, agrupando los datos por semana de tratamiento. En la semana 4 del estudio, las ratas se sometieron a caja metabólica durante 48 horas (Figura 1) para la obtención de muestras de orina y heces. Las ratas fueron sacrificadas en la semana 6 mediante extracción total de sangre por punción cardíaca bajo anestesia con Tiopental sódico (20-25 mg/kg), por vía intraperitoneal. La sangre fue recolectada en tubos heparinizados y centrifugados a 3500 g durante 10 min a 4 °C. El plasma se separó y almacenó a -20 °C hasta su análisis.
Experimento 2
En esta fase, las ratas (machos y hembras SD) fueron seleccionadas para apareamiento según edad y condición clínica. Se realizó un apareamiento monogámico por siete días, durante el cual se alimentaron con dieta control o EWP según el grupo experimental. En el día 8 los machos fueron retirados y las hembras fueron alojadas en cajas individuales de plexiglass, para continuar con su posible gestación en ambiente controlado con la misma dieta que consumieron durante el periodo de monta. Se registró el peso de las hembras cada dos días, considerándose como gestantes aquellas que tuvieron mayor aumento de peso corporal.
Se trabajó con 10 ratas SD gestantes (14 semanas de edad y 1 semana de gestación). Los animales fueron alimentados durante su gestación y lactancia con dieta control (n=5) y dieta EWP (n=5). Las crías fueron pesadas al nacimiento, y fueron destetadas a las cuatro semanas de vida. Al destete, se seleccionaron siete ratas por grupo de alimentación (dieta control y dieta EWP). Ambos grupos se mantuvieron bajo el mismo tratamiento original durante seis semanas. El registro de peso, evaluación clínica y toma de muestras de heces y orina y sacrificio se hizo como se indica en el Experimento 1 (Figura 2).
Parámetros Clínico-Metabólicos
- Peso corporal. Los animales fueron pesados de manera individual e interdiaria, empleando una balanza electrónica Körper EK3651.
- Evaluación clínica. Se realizó revisión directa diaria de signos físico-clínicos, llenando un instrumento de observación descrito por Morton y Griffiths (1985). Los resultados fueron analizados mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov.
- Motricidad. Los animales fueron colocados en una caja de plexiglás transparente y grabados por medio de un programa de seguimiento y cuantificación de pasos «Video Tracker Software» (OSP, Física de Código Abierto) (VT) (Endo et al., 2016). Se estandarizó el tiempo exploración, el cual osciló entre 40 segundos y 2 minutos. A partir de allí, se cuantificó el número de movimientos ejecutados por cada rata en 2 minutos contados desde su ingreso a la caja. Los datos numéricos arrojados por VT fueron graficados en los programas Microsoft Office Excel o Graphpad y comparados con los gráficos arrojados por VT. Se estableció una comparación entre la cantidad de movimientos de las ratas y sus controles.
- Caja metabólica. Para cuantificar la ingesta de agua y alimento, la excreción de orina y heces, y observar el comportamiento aislado de cada rata, los grupos fueron colocados individualmente en una caja metabólica estándar para ratas (Tecniplast, USA) durante 48h. El agua y el alimento fue suministrado ad libitum y la orina y heces fue recolectada cada 24h en recipientes volumétricos calibrados (Tecniplast, USA). Las heces fueron pesadas y sometidas a deshidratación por 24h a 50°C en una estufa Heratherm 51028123 (ThermoFisher). El balance hídrico se calculó restando el total de egresos (orina + heces) al total de ingresos (agua consumida) y dividido entre el peso corporal, (Saínz, 2005; Cheuvront et al., 2011; Rieble y Davy, 2013). El porcentaje de excreción se calculó tomando como punto de inicio el agua neta consumida (100%) y restando el egreso como porcentaje excretado. Estas estimaciones no incluyen pérdidas de agua de otro tipo.
Parámetros Biológicos
Se determinó la concentración de proteínas en plasma y orina con un espectrofotómetro Spectronic 1201 (Milton Roy) mediante la técnica de Bradford (Bradford, 1976). El hemograma fue determinado mediante métodos convencionales (Blumenreich, 1990), con el analizador hematológico de micro-muestreo ABX MICROS ES60. Se determinaron los valores de leucocitos (WBC), hemoglobina (HGB), eritrocitos (RBC) , hematocrito (HCT) volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH) y concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), así como el tamaño y dispersión de los eritrocitos (RDW-CV, RDW-SD), el conteo de plaquetas (PLT), volumen plaquetario medio (MPV), índice de distribución de plaquetas (PDW), porcentaje de procalcitonina (PCT), y concentración de glucosa (GLU), colesterol (COL), triglicéridos (TRI) y lipoprot eínas de muy baja densidad (VLDL).
Análisis Estadístico
Los valores son expresados como media ± SEM. Las diferencias entre los grupos experimentales fueron determinadas mediante análisis de varianza de dos vías seguido del ensayo de Tukey. Se uso el análisis de Kolmogorov-Smirnov en datos cualitativos. Las diferencias fueron consideradas significativas a partir de p<0.05. Se utilizó Graphpad Prism (Systat Software Inc., USA) como programa para análisis de datos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Experimento 1
Conforme a lo observado en investigaciones de AIN con di etas purificadas. (Reeves et al., 1993a), en este estudio no hubo diferencias en PC entre las ratas alimentadas con dieta control y con dieta EWP entre el destete hasta las 11-12 semanas de vida (355.75 ± 13.39 g y 341.17 ± 8.24 g, respectivamente) (Figura 3).
Figura 3 3. Evolución del peso corporal en ratas Sprague Dawley alimentadas con dieta control o EWP (semi-purificada con base de clara de huevo). Los valores se expresan como medias ± SEM en gramos (n=6 por grupo)
Tal como se esperaba, ambos grupos mostraron un comportamiento clínico normal, libre de patologías o afecciones en apariencia y fisiología al alimentarse con la dieta EWP (Semon et al., 1987) (Cuadro 4). La literatura ha demostrado la utilidad de cuantificar el movimiento espontáneo en los roedores, bien sea mediante la codificación ciega de expresiones faciales o sobre el tiempo empleado en explorar su entorno, como parte de una evaluación físico-clínica completa (Sotocinal et al., 2011). El presente estudio confirma el bienestar de los animales en motricidad y comportamiento general, según lo esperado en este tipo de investigaciones (Morton y Griffiths, 1985; Endo et al., 2016).
Cuadro 4 Evaluación clínica de ratas Sprague Dawley alimentadas con dieta control o dieta EWP (semi-purificada con base de clara de huevo) durante seis semanas a partir del destete
Los valores se expresan como número de animales respondedores/número de ratas en el grupo estudiado. Análisis estadístico realizado por Kolmogorov-Smirnov Parámetros como respiración, micción, sudoración o suavidad del pelaje, entre otros, se categorizan como “normal” para continuar el experimento, “monitoreo continuo” para observar con mayor detalle al grupo o individuo, “modificar tratamiento” para continuar con el suministro de la dieta, o “detener el tratamiento” para evitar el sufrimiento y malestar de los animales (Morton y Griffiths, 1985).
En el Cuadro 5 se presentan los resultados de la caja metabólica. A pesar de que el contenido de Na en dieta EWP (0.23% Na p/p, normosódica [Martus et al., 2005]) es ligeramente mayor que en el grupo control, el grupo EWP mostró una menor ingesta de alimentos comparado (Control: 21.95 ± 0.38 g; EWP: 18.63 ± 0.79 g) y, por consiguiente, un menor peso de heces (3.75 ± 0.13 g y 1.08 ± 0.07 g, respectivamente). Diversos factores pueden estar asociados al menor consumo de alimento como sabor y textura del alimento (Naim et al., 1986) o contenido de Na (Rondón et al., 2014). Sin embargo, la reducción en la ingesta no afectó la ganancia de peso ni el estado clínico de las ratas. Asimismo, el balance hídrico corregido por PC indicó un balance significativamente más bajo en ratas alimentadas con dieta EWP (-0.012 ± 0.001 comparado con su control); sin embargo, este dato se correlaciona correctamente con el ingreso y el egreso de agua (Cheuvront et al., 2011). Por otra parte, el porcentaje de excreción de agua demostró que no hubo diferencia significativa entre grupos (67.4 ± 1.71% en grupo control y 70.6 ± 2.23% para EWP). Esto se asocia con una funcionalidad correcta de los riñones por equilibrio hidroelectrolítico de los fluidos corporales (Roumelioti et al., 2018).
Cuadro 5 Ingesta de alimento y agua, excreción de orina, contenido de agua en heces y peso seco de heces en ratas Sprague Dawley alimentadas con dieta control y EWP (semi-purificada con base de clara de huevo)
Los valores se expresan como media ± SEM (n=6) El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student para datos no apareados seguida de la prueba F para comparar las varianzas. *** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05 Balance hídrico (ml) = (Ingreso (ingesta de agua) - Egreso (orina + heces))/PC Balance hídrico (%) = (Egreso(ml)*100)/Ingreso(ml)
Experimento 2
En la Figura 4 se observa el PC y evolución del PC en ratas SD alimentadas con las dietas en las fases de neonatos, lactancia y destete-crecimiento. El PC de neonatos al nacimiento fue mayor en el grupo de madres alimentadas con EWP (+1.56 ± 0.18 g) (Figura 4A), resultado que puede deberse al contenido de grasas y carbohidratos totales en la dieta EWP (Ramirez y Friedman, 1990). A pesar de ello, a los tres días de nacidos igualaron el PC con el grupo alimentado con la dieta control, siendo similar durante toda la lactancia (27 días) (Figura 4 B), así como durante la fase de destete-crecimiento (Figura 4C), excepto en la semana 5 de vida, donde la ganancia de peso fue mayor en el grupo EW, posiblemente debido al proceso de adaptación al cambio de alimento en el destete (Levin y Keesey, 1998).
Figura 4 Evolución del peso corporal en ratas Sprague Dawley alimentadas con dieta control o dieta EWP (semi-purificada con base de clara de huevo). (A) Recién nacido; (B) Lactancia; (C) Destete y crecimiento. Los valores se expresan como medias ± SEM en gramos (n=6 por grupo). El análisis estadístico se realizó utilizando t student seguido por el método de corrección para múltiples comparaciones de Holm-Sidak. *** p<0.001
Tal como se observó en el Experimento 1, ambos grupos presentaron signos físico-clínicos y motricidad similares, así como un comportamiento semejante sin cambios anormales (Cuadro 6).
Cuadro 6 Evaluación clínica de ratas Sprague Dawley alimentadas con dieta control o dieta EWP (semi-purificada con base de clara de huevo) durante seis semanas a partir del destete
Los valores se expresan como número de animales respondedores/número de ratas en el grupo estudiado. Análisis estadístico realizado por Kolmogorov-Smirnov Parámetros como respiración, micción, sudoración o suavidad del pelaje, entre otros, se categorizan como “normal” para continuar el experimento, “monitoreo continuo” para observar con mayor detalle al grupo o individuo, “modificar tratamiento” para continuar con el suministro de la dieta, o “detener el tratamiento” para evitar el sufrimiento y malestar de los animales (Morton y Griffiths, 1985).
Al igual que en Experimento 1, las ratas alimentadas con dieta EWP mostraron una menor ingesta de alimento y, por ende, un menor peso de heces secas que en el grupo alimentado con dieta control (-4.36 ± 0.53, - 5.71 ± 0.27, respectivamente) (Cuadro 7). A pesar de que se encuentra en un rango de normalidad (Rieble y Davy, 2013), el balance hídrico corregido por peso corporal es significativamente menor en el grupo EWP que en el grupo control (-0.019 ± 0.001) tendiendo ambos a 0, indicando un balance hidroelectrolítico adecuado. No obstante, contrario a lo observado en el Experimento 1, el porcentaje de excreción de agua fue significativamente superior en el grupo EWP comparado al grupo control (+9.76 ± 1.13) (Cuadro 7).
Cuadro 7 Ingesta de alimento y agua, excreción de orina, contenido de agua en heces y peso seco de heces en ratas Sprague Dawley alimentadas con dieta control y EWP (semi-purificada con base de clara de huevo)
Los valores se expresan como media ± SEM (número de ratas entre paréntesis) El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student para datos no apareados seguida de la prueba F para comparar las varianzas. *** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05 Balance hídrico (ml) = (Ingreso (ingesta de agua) - Egreso (orina + heces))/PC Balance hídrico (%) = (Egreso(ml)*100)/Ingreso(ml)
Por otra parte, a pesar de que la excreción de agua y el balance hídrico en el Experimento 2 fueron diferentes entre sí, los valores se encuentran dentro de los rangos de normalidad establecidos (Rieble y Davy, 2013). No obstante, el tiempo de experimentación en esta fase del estudio es más prolongada que el Experimento 1, abarcando desde la gestación y lactancia, hasta la semana 11 del experimento; lo que podría llevar a cambios metabólicos-fisiológicos importantes. (Kind et al., 2006. Cristians et al., 2019). A su vez, se debe considerar que la dieta EWP posee menor cantidad de potasio (K) y fibra que la dieta control, generando un tránsito intestinal más lento, lo que podría producir una mayor absorción de agua a nivel intestinal y, por ende, mayor excreción (Qian, 2018).
La cantidad de proteínas de la dieta control fue superior a la concentración de proteínas de la dieta EWP; sin embargo, las excreciones urinarias de proteínas son similares entre ambos grupos experimentales, datos que concuerdan con la literatura estudiada (Shevock et al., 1993. Gautier et al., 2014). Así mismo, se evidencia en ambos grupos una concentración plasmática de proteínas en el rango de normalidad (Caridad et al., 2011) (Cuadro 7).
Parámetros Biológicos
En el análisis bioquímico de sangre se observó una diferencia significativa en el volumen corpuscular medio (MCV), con un valor de +3.3 ± 0.62 fl. También, se observó una diferencia significativa de +27.33 ± 2.43 mg/dl en COL, +25.33 ± 1.45 mg/dl en TRI y una diferencia de +5.07 ± 0.29% en el nivel de VLDL en ratas alimentadas con dieta EWP con respecto a ratas alimentadas con dieta control (Cuadro 8). El ligero aumento en COL, TRI y VLDL puede deberse al contenido de azúcares simples por añadidura de papelón en la dieta EWP. Sin embargo, los valores presentados por ambos grupos se encuentran dentro de los rangos «normales» para ratas (Caridad et al., 2011).
Cuadro 8 Análisis bioquímico de muestras de sangre en ratas Sprague Dawley alimentadas con dieta control y dieta EWP (semi-purificada con base de clara de huevo)
Los valores se expresan como media ± SEM (número de animales entre paréntesis) Análisis estadístico realizado mediante la prueba t de Student para datos no apareados. ** p<0.01, * p<0.05 Leucocitos (WBC), hemoglobina (HGB), eritrocitos (RBC), hematocritos (HCT) volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), tamaño y dispersión de los eritrocitos (RDW-CV, RDW-SD), conteo de plaquetas (PLT), volumen plaquetario medio (MPV), índice de distribución de plaquetas (PDW), porcentaje de procalcitonina (PCT), concentraciones de glucosa (GLU), colesterol (COL), triglicéridos (TRI) y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL)
Se encontró una mayor ingesta de minerales en ratas alimentadas con EWP en comparación con el control (Cuadro 9), debido posiblemente a que la dieta EWP cumple con los requerimientos establecidos por AIN (Reeves et al., 1993) (Cuadro 3). Al evaluar la concentración plasmática de minerales se evidencian rangos normales en ambas dietas (Owen y Hazelrig, 1968; Wilkins et al., 1972; Bansal, 1990; Lillie et al., 1996), a excepción de Zn, Mg y P. Esto se debe a que la concentración de dichos minerales en la dieta EWP son más cercanos a los requerimientos de AIN que en la dieta control (Cuadro 10).
Cuadro 9 Ingesta de minerales en ratas Sprague Dawley alimentadas con dieta control y dieta EWP (semi-purificada con base de clara de huevo)
Los valores se expresan como media ± SEM Análisis estadístico realizado mediante la prueba t de Student para datos no apareados. *** p<0.001
Cuadro 10 Concentración plasmática de minerales en ratas Sprague Dawley alimentadas con dieta control y dieta EWP (semi-purificada con base de clara de huevo)
Los valores se expresan como media ± SEM (Número de animales entre paréntesis) Análisis estadístico realizado mediante la prueba t de Student para datos no apareados *** p<0.001
CONCLUSIONES
La dieta EWP es una alternativa alimentaria controlada dirigida a ratas y ratones tal como lo sugieren las directrices del AIN, cubriendo los requerimientos de energía, macro y micronutrientes de las ratas Sprague Dawley, sin afecciones ni padecimientos subyacentes.
Los parámetros clínico-metabólicos y biológicos demuestran que la dieta EWP permite el desarrollo óptimo y sano de las ratas Sprague Dawley.
La dieta EWP, por ser una dieta pulverizada, permite al investigador manipular cada uno de sus ingredientes en función de los requerimientos experimentales, pudiendo elaborar dietas específicas para evaluar diferentes parámetros de índole nutricional.
