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INTRODUCCIÓN
Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) es un patógeno aviar presente en el tracto respiratorio de diversas especies de aves domésticas y silvestres (Vandamme et al., 1994; Hafez y Reinhard, 1999). La infección puede causar una alta mortalidad y pérdidas económicas para los avicultores (Vandamme et al., 1994; Macagnan, 2006).
O. rhinotracheale pertenece al orden Flavobacteriales, familia Flavobacteriaceae y género Ornithobacterium, que tiene una única especie. O. rhinotracheale (Vandamme et al., 1994; Van Empel y Hafez, 1999) y fue aislada por primera vez en 1983 por Vandamme et al. (1994). Se describió como un bacilo gramnegativo pleomórfico, de colonias convexas, lisas, hemolíticas (Van Empel y Hafez, 1999), habiéndose reportado en numerosos países (Amonsin et al., 1997; Sakai et al., 2000; Hung y Alvarado, 2001; Van Veen et al., 2001; Turan y Ak, 2002; Koga y Zavaleta, 2005; Hassanzadeh et al., 2010; Espinosa et al., 2011). Actualmente se conocen 18 serotipos nombradas con letras de la A hasta la R, y son determinadas por métodos serológicos (Van Empel et al., 1997; Turan y Ak, 2002). Algunos serovares (A, B, D, E) causan reacciones cruzadas a nivel serológico, indicando la posibilidad de que existan subespecies de esta bacteria (Macagnan, 2006; Hafez y Vandamme, 2011).
El uso del PCR para la detección molecular de O. rhinotracheale en el Perú ha mostrado buenos resultados (Hung y Alvarado, 2001), y además permite detectar las variaciones genéticas existentes por interacciones entre serotipos peruanos mediante análisis de ADN entre los aislados de O. rhinotracheale (Koga y Zavaleta, 2005; Macagnan, 2006). De otra parte, métodos de tipificación molecular como el Multilocus Sequence Typing - MLST están disponibles y son los métodos de elección para identificación de los genotipos existentes (Sakai et al., 2000).
La tipificación molecular basada en secuencias multilocus (MLST) permite caracterizar aislados de especies bacterianas utilizando secuencias conservadas de siete genes housekeeping: (adk): Adenylato kinasa, (aroE): Shikimate 5-dehydrogenase, (fumC): Fumaras e class II, ( gdhA): Glu tama t e dehydrogenase, (pgi): Glucose-6-phosphate isomerase, ( p mi ) : Phosphomannose isomerase (Coll et al., 2005; Thieme et al., 2016a). Las bases de datos disponibles para secuencias MLST permiten la fácil comparación de perfiles alélicos entre aislados y/o clonas (Thieme et al., 2016a,b; Pubmlst.org, 2018).
En el Perú se carece de estudios de tipificación actuales que permitan determinar la variabilidad genética y la presencia de variantes genéticas en O. rhinotracheale. El objetivo del trabajo fue genotipificar 36 cepas de O. rhinotracheale procedentes de cinco regiones del Perú mediante MLST.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material Biológico
Se utilizaron 36 cepas de O. rhinotracheale, aisladas de muestras clínicas de aves con signos clínicos y lesiones histopatológicas compatibles con la infección bacteriana entre 2015 y 2017, provenientes de Lima, Libertad, Arequipa, Ica y Ucayali. Las muestras correspondieron a pulmón, hí- gado, sacos aéreos, corazón y cerebro. Las cepas fueron aisladas de gallinas de postura (Hyline) (n=9), broilers (n=4), gallinas reproductoras (n=22) y de gallos de pelea (n=1).
Se realizó una impronta de cada órgano e hisopado en una placa de agar sangre y luego, con un asa de siembra se agotó la muestra por estrías en el medio de cultivo, incubándose a 37 ºC durante 24-48 h en jarra con cuatro velas (microaerófilo), aunque se reconoce que existen ORT que necesitan más de 48 horas de cultivo. Se consideraron como colonias sospechosas aquellas que eran puntiformes, pequeñas, grises a grises-blanquecinas, opacas, de 1-3 mm de diámetro, convexas, de superficie lisa, hemolítica o no hemolítica (Soriano et al., 2003). Las cepas con características microbiológicas idénticas a O. rhinotracheale fueron liofilizadas y almacenados en el banco de cepas del labora- torio de Bioservice.
Extracción de ADN de O. rhinotracheale
Se extrajo el ADN genómico de las 36 cepas utilizando el método de membranas de sílica gel con el GF-1 Tissue DNA Extraction Kit (Vivantis), de acuerdo con las indicaciones del laboratorio fabricante.
Detección Molecular de O. rhinotracheale
Las cepas de O. rhinotracheale fue- ron detectadas mediante amplificación de PCR. Se utilizó un fragmento de 784 bp del gen 16S rRNA, utilizando los cebadores forward: OR16S - F1 (5’GAGAATTAAT- TTACGGATTAAG) y reverse: OR16S-R1 (5’TTCGCTTGGTCTCCGAAGAT). La re- acción de PCR se realizó en un volumen fi- nal de 20 µl conteniendo 10X Buffer PCR, 25 mM de dNTPs, 25 mM de MgCl, 10 pmol de cada cebador, 1 U Taq DNA polimerasa (Fermentas) y 30 ng de ADN genómico. Se emplearon los siguientes ciclos termales: Un ciclo de desnaturalización inicial de 95 ºC durante 4 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94 ºC durante 30 s, alineamiento de 58 ºC durante 60 s, 1 extensión de 72 ºC durante 90 s y 1 ciclo de extensión final de 72 ºC durante 5 min, en un termociclador Veriti Thermal Cycler (Life Technologies) (Espinosa et al., 2011; Koga y Zavaleta, 2005, Soriano et al., 2003).
Secuenciamiento del Gen 16S
Se realizó la amplificación del gen 16S mediante los cebadores: 27 F (5‘AGAGT- TT GAT CMTGGC TC AG‘ 3) y 14 92 R (5‘AAAGGAGGTGWTCCAR CC‘3). Los dos productos de PCR fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % en buffer TBE 1X (Tris, Borato, EDTA) durante 45 min a 100 v y visualizados bajo luz UV. Los productos se enviaron a secuenciar a la empresa Macrogen Inc. (Corea del Sur) (Lillo et al., 2006).
Multilocus Sequence Typing (MLST)
Un total de siete genes housekeeping fueron utilizados p a r a M LST de O. rhinotracheale. Estos fueron seleccionados de estudios previos en aves de corral y aves silvestres por su alta semejanza con los genes de O. rhinotracheale (Cuadro 1). Así, dos genes (aroE y fumC) fueron seleccionados a partir de estudios de análisis de MLEE de O. rhinotracheale (Amonsin et al., 1997) y cinco genes (adk, mdh, pgi, gdhA y pmi) a partir del análisis de MLST de Pasteurella multosida (Thieme et al., 2016a). Las secuencias de los cebadores, las condiciones de amplificación por PCR, secuencias alélicas, tipos de secuencias y aislados de referencia fueron obtenidos a partir la base de datos M LS T de la Universidad de Oxford (Pubmlst.org., 2018). Los productos de PCR fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TBE 1X (Tris 0.89 M, Borato 0.02 M, EDTA 0.89 M, pH 8.3) y visualizados mediante luz UV. Los productos de PCR fueron analizados en base a su tamaño de acuerdo con lo reportado en la base de datos de MLST. Los productos de PCR fueron secuenciados por ambas hebras mediante BigDye v. 3.1 sequencing terminator kit (Life Technologies) y un analizador genético ABI 3137 XL (Life Technologies). El servicio fue proveído por la empresa Macrogen Inc. (Corea del Sur) (Subaaharan et al., 2010).
Curado y Alineamiento de las Secuencias MLST
Las 504 secuencias de los siete genes (36 cepas) por forward y reverse se analizaron y se realizó (curado) el control de calidad de cada secuencia para garantizar los SNPs correctos y no producto de un error durante el secuenciamiento (gaps o solapamientos de nucleótidos) y eliminar los extremos cortos de secuencias que normal- mente presentan errores. Se utilizó el software Chromas Lite v. 2.6.6. Luego se realizó el alineamiento de las secuencias por cada gen Housekeeping y se hizo una comparación de los sitios variables obtenidos median te el software MEGA v. 6.0. Las secuencias en formato FASTA se llevaron a la base de datos (Pubmlst.org., 2018).
Figura 1 Detección de Ornithobacterium rhinotracheale del gen 16S rRNA. Línea 1 al 2: O. rhinotracheale, Línea 3 (control negativo): P. multocida ATCC, línea 4 (con- trol positivo): O. rhinotracheale ATCC 51464, línea 5: Blanco; M, GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder Thermo Scientific (Thermo Scientific)
Análisis de Secuencias de MLST
Los perfiles alélicos fueron determina- dos a partir de secuencias de siete genes Housekee p in g d e l a s cepas de O. rhinotracheale y su comparación con las secuencias tipo (ST) presentes en la base de datos MLST.
El nivel de recombinación entre secuencias fue calculado mediante el índice de asociación (IA) descrito por Maynard Smith (Smith et al., 1993), usando el software START.2 (Jolley et al., 2001; Jolley y Maiden, 2010). Un árbol filogenético fue construido utilizando los perfiles alélicos para los siete genes concatenados, mediante el método de Neighbor Joining, disponible en el software MEGA v. 6.0 (Tamura et al., 2013; Thieme et al., 2016a,b; Pubmlst.org., 2018).
RESULTADOS
Los resultados de las muestras secuenciadas fueron comparados con los datos de la base de datos del GenBank (Fig. 1). Los genes Housekeeping obtenidos por PCR muestran en la Figura 2.
Los 504 cromatogramas obtenidos del secuenciamiento fueron analizados mediante el software Chromas Lite a fin de discriminar y corregir las secuencias durante el curado. Posteriormente, mediante el software Mega v. 6.0 se determinaron los sitios variables y se seleccionaron alelos polimórficos, obteniéndose los sitios tipos (ST) por comparación con los perfiles alélicos almacenados en la base de datos del NCBI. Un total de cuatro ST fueron encontrados (ST1, ST NT 1, ST NT 2 y ST NT 3), siendo el perfil alélico ST1 (1, 1, 1, 1, 1, 1,1) el más frecuente con presencia en 32 muestras de ORT, representando un 88.89% del total (Cuadro 2, Figura 3).
La diferenciación de los ST se logra mediante la similitud en los perfiles alélicos. El ST N.T1 (1, 17, 7, 8, 7, 25, 1) difiere al perfil ST10 (7, 9, 7, 8, 7, 8, 8) en 4 alelos. El ST N.T2 (24, 2, 26, 6, 23, 25, 25) y N.T3 (24, 2, 26, 6, 2, 1, 25) son distintos al ST32 (24, 2, 26, 24, 23, 25, 25) en 3 y 1 alelo. Esta información determinaría tres nuevas secuencias tipo (ST) dentro de esta investigación (Cuadro 3).
Figura 2 Los siete 7 genes Housekeeping obtenidos por PCR. Línea 1, 2, 3 y 4: Ornithobacterium rhinotracheale, (adk): Adenylato kinasa, (aroE): Shikimate 5-dehydrogenase, (fumC): Fumarase, class II, (gdhA): Glutamate dehydrogenase, (pgi): Glucose-6-phosphate isomerase, (pmi): Phosphomannose isomerase; (mdh) Malate dehydrogenase (NAD), M, GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder Thermo scientific (Fermentas, EEUU)
DISCUSIÓN
La variabilidad genética de O. rhinotracheale es mayor que en otros microorganismos (Amonsin et al., 1997; Soriano et al., 2003; Montes de Oca et al., 2018), lo cual complica la identificación eficaz de linajes clonales. En este caso, se logra una mejor caracterización molecular y agrupamiento con el método MLST (Amonsin et al., 1997; Montes de Oca et al., 2018; Tabatabai et al., 2010). Los resultados del MLST corroboran lo reportado por Thieme et al. (2016a,b), quienes identifican la prevalencia del perfil alélico ST1 en aves domésticas, en varios continentes, en tanto que Smith et al. (1993) y Thieme et al. (2016b) reportan una alta heterogeneidad de perfiles alélicos en aves silvestres. En base a estos hallazgos, este estudio apoya la probable introducción de nuevos perfiles alélicos (ST) a partir de poblaciones de aves silvestres a domésticas (Amonsin et al., 1997; Chou et al., 2009).
Los resultados del presente estudio sugieren la presencia de moderada variabilidad genética presente e n cepas de O. rhinotracheale provenientes de sistemas de producción avícola en el Perú, con la presencia de cuatro perfiles alélicos ST (ST1, ST N.T 1, ST N.T 2 y ST N.T 3), tres de los cuales no ha sido reportado previamente. Además, se encontró 19 alelos únicos y 229 sitios polimórficos. El menor número de sitios de polimorfismo con el estudio de Thieme et al. (2016a) se debería a la cantidad de cepas dispuestas en el trabajo. El índice de asociación (IA) calculado para las 36 cepas analizadas fue de 4.7327 (Jolley et al., 2001, 2010). Se detectó un desequilibrio de ligamiento significativo que indica estructuras de población clonal. Los resultados son comparables al estudio de Thieme et al. (2016a) donde las 36 cepas de O. rhinotracheale son clones que están estrechamente relacionadas genéticamente, pero no tienen relación con el tipo de hospedero (gallinas, pollos y gallos); por otro lado, no se podría inferir una relación geográfica debido a la cantidad de muestras analizadas.
Cuadro 2 Perfiles alélicos de Multilocus Sequence Typing (MLST), hospedero, origen geográfico y año de aislamiento de 36 cepas de Ornithobacterium rhinotracheale
Figura 3 Árbol filogenético basado en el método estadístico (Neighbor joining) utilizando Maximum Composite Likelihood, a partir de los perfiles alélicos de MLST en 36 cepas representativas de Ornithobacterium rhinotracheale. El dendograma fue construido mediante el programa Mega 6.0
Los resultados podrían sugerir un incremento de la variabilidad genética en los últimos años con la presencia de al menos cuatro genotipos circulantes basados en el análisis de M LS T. La mayor variabilidad intraespecífica observada en la región de Lima (ST N.T1) guarda correspondencia con la mayor concentración de crianzas avícolas presentes en esta región; sugiriendo que la interacción entre tipos de crianza (carne / huevo) podría explicar la existencia de genotipos distintos, tal como es mencionado por otros autores (Van Empel et al., 1998; Turan y Ak, 2002; Macagnan, 2006).
CONCLUSIONES
El genotipo ST1 fue el más frecuente en los 36 aislados con 91.4%, siendo la región de Lima la que concentra la mayor variabilidad de genotipos.
Los resultados sugieren la presencia de tres nuevos perfiles alélicos STN.T 1, ST N.T 2 y ST N.T 3 en referencia con la base de datos de MLST.
Se identificaron 19 alelos únicos y 229 sitios polimórficos en los cuatro genotipos descritos.
El índice de asociación (IA) calculado fue de 4.7327 para las 36 cepas analizadas.
