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INTRODUCCIÓN
La vibriosis son enfermedades originadas por bacterias del género Vibrio (Ji et al.,2020), y afectan al camarón Litopenaeus vannamei en cultivo. Ciertas cepas de Vibrio son responsables de una reciente y grave enfermedad llamada necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) (Santos et al.,2020), que surgió en Asia y pasó a Norte América, habiendo causado fuertes pérdidas en ambas regiones (Guía et al., 2020; Santos et al., 2020; de Souza y Wan, 2021). La AHPND se ha expandido a América del Sur donde, sin embargo, no ha originado graves problemas (Saavedra-Olivos et al., 2018; Aranguren et al., 2020).
Ecuador y Perú ocupan el primer y tercer lugar, respectivamente, en producción de camarón en América del Sur; siendo el cultivo de camarón el que origina el mayor ingreso de divisas por exportaciones acuícolas en ambos países; sin embargo, dicho cultivo se ve afectado frecuentemente por vibriosis distintas a la AHPND que reducen su potencial productivo (FAO, 2018; Produce, 2018; Tarazona et al., 2018; CNA, 2020).
El tratamiento de la vibriosis en camarón se realiza con antibióticos como oxitetraciclina, enrofloxacina, florfenicol y, en algunas ocasiones, norfloxacina (Bermúdez-Almada et al., 2014; Varela-Mejías y Alfaro-Mora, 2018). No obstante, dichos antibióticos se aplican a menudo de manera inadecuada, sin hacer análisis de sensibilidad antibiótica, en dosis excesivas y, a veces, como preventivo, lo que propicia el desarrollo de resistencia bacteriana (Varela-Mejías y Alfaro-Mora, 2018; Sotomayor et al., 2019; Varela y Choc Martínez, 2020).
El surgimiento de resistencia para uno o varios antibióticos en las cepas de Vibrio spp es un asunto preocupante para el cultivo de Litopenaeus vannamei (Stalin y Srinivasan, 2016), habiéndose reportado múltiples casos en Brasil (Rebouças et al., 2011; Albuquerque et al., 2015), Malasia (Banerjee et al., 2012), India (Stalin y Srinivasan, 2016), Ecuador (Sotomayor et al., 2019) y Perú (Rosado, 2018). La resistencia antibiótica de estas cepas hace que la eficacia del tratamiento antibiótico sea cada vez menor; representando un riesgo para el ambiente y la salud humana, pues las cepas resistentes pueden llegar al público a través del consumo de camarones y transferir sus genes de resistencia a cepas patógenas para humanos (Jeyasanta et al., 2017; Zhao et al., 2018; Sotomayor et al., 2019).
Se tiene una fuerte regulación que impide la utilización de nuevos antibióticos en acuicultura (Saxena et al., 2018; Khan y Lively, 2020), por lo que al no contarse con más alternativas antibióticas, se están ensayando otras opciones terapéuticas, como son los fitobióticos (extractos y aceites esenciales de plantas) (Sotomayor et al., 2019). El neem Azadirachta y el orégano Origanum vulgare son plantas utilizadas comúnmente en la medicina alternativa, habiéndose ensayado también en el tratamiento de enfermedades en acuicultura (Banerjee et al., 2012; Thanigaivel et al., 2015; Morales-Covarrubias et al., 2016; Domínguez-Borbor et al., 2020), por lo que son una alternativa a evaluarse para el tratamiento de vibriosis en el cultivo de camarones. En esta investigación, se determinó la resistencia, frente a 10 antibióticos, de cepas de Vibrio spp aisladas de camarones de cultivo en Santa Rosa (Ecuador) y Tumbes (Perú), y su sensibilidad frente a extractos de neem y orégano.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar del Estudio y Camarones
El estudio se realizó en los laboratorios de Acuicultura II y Biología Molecular de la Facultad de Ingeniería Pesquera y Ciencias del Mar de la Universidad Nacional de Tumbes, ubicada en la localidad de Puerto Pizarro, Región Tumbes, Perú.
Se obtuvieron 14 camarones de tres estanques de una empresa camaronera en el cantón Santa Rosa en la provincia de El Oro (Ecuador). Se seleccionaron estanques de cultivo semi-intensivo que tuvieron problemas periódicos de mortalidad atribuida a vibriosis. Los camarones fueron transportados vivos, en bolsas plásticas con agua de sus estanques, hasta el Laboratorio de Acuicultura II, ubicado a 1 h 30 min del lugar de colecta.
Aislamiento de Cepas de Vibrio spp
Los camarones fueron sacrificados siguiendo las directivas de la Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA, 2016). De estos se tomaron 46 muestras del hepatopáncreas, intestino, hemolinfa y de heridas de la superficie corporal. Se aislaron, purificaron e identificaron las cepas de Vibrio siguiendo el método de Jeyasanta et al. (2017) con modificaciones. En breve, las muestras de tejidos (a excepción de la hemolinfa) fueron trituradas en solución de NaCl al 0.85%; se realizaron diluciones de 100 a 10-4 de los tejidos triturados, totalizando 174 diluciones de todas las muestras, las que fueron sembradas por el método de agotamiento en placas petri con agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS) ajustado a 2.5% de NaCl. Las placas se incubaron a 37 °C por 24 a 48 h.
Las colonias de Vibrio spp crecidas en el agar TCBS (medio selectivo para Vibrio), mostraron coloración verde o amarilla, con formas circulares; tamaños de 1-5 mm, con bordes enteros y elevación ligeramente convexa, que son características típicas Vibrio (Sabir et al., 2013). Dichas colonias fueron sub cultivadas en placas petri con agar tripticasa soya (TSA) ajustado a 2.5% de NaCl, hasta que en cada placa solo se observó un tipo de colonia. Se realizó tinción de Gram, prueba de catalasa y oxidasa y crecimiento de las cepas en soluciones de NaCl, según el método de Rosado (2018).
Se aislaron 14 cepas de Vibrio spp. De otro lado, se utilizaron 14 cepas adicionales de Vibrio spp que fueron aisladas de Litopenaeus vannamei de cultivo en Tumbes (Perú), en un estudio previo. En el caso de éstas últimas, se realizó el mismo procedimiento para verificar que correspondieran a Vibrio spp (crecimiento en TCBS y TSA, tinción de Gram, pruebas de catalasa y oxidasa, y crecimiento en soluciones de NaCl).
Extractos de Neem y Orégano
Se obtuvo hojas maduras de un árbol de neem de aproximadamente 6 m de altura que se encontraba en las instalaciones de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Tumbes, el distrito de La Cruz, Tumbes (Perú). También se colecta- ron hojas maduras de plantas de orégano de 30-50 cm de altura de un huerto doméstico en el mismo distrito.
Se preparó un extracto etílico (EE), uno acuoso (EA) y un extracto procesado con soxhlet y rotaevaporador (EPSR) de cada una de las plantas. Para el EE se tomó 5 g de hojas secadas a la sombra, las cuales fueron pulverizadas y mezcladas con 50 ml de alcohol etílico al 96%, el extracto se dejó reposar por 24 h. Para la preparación del extracto acuoso (EA) se colocaron hojas secas pulverizadas en cantidad de 5 g/200 ml en agua destilada hirviendo, dejando reposar el extracto por 24 h.
El sobrenadante de los extractos fue separado por filtración. El extracto procesado con soxhlet y rotaevaporador (EPSR) se preparó colocando 5 g del polvo de hojas y 100 ml de alcohol etílico de 96% en un equipo soxhlet y concentrando el extracto con un rotaevaporador.
Ensayo de Resistencia de Cepas de Vibrio spp
El ensayo de resistencia antibiótica fue realizado por el método de difusión en agar (método de Kirby-Bauer). Se realizó un ensayo por cada cepa. Las cepas fueron cultivadas en caldo tripticasa soya (TSB) por 24 h, y luego se estandarizó sus densidades a 1.5×108 UFC/ml, comparándolas con un patrón 0.5 de McFarland. Las cepas se sembraron en placas petri con agar Mueller Hinton (MH), y se les colocó discos comerciales de 10 antibióticos (representativos de seis familias antibióticas): familia aminoglucósidos: gentamicina (10 µg); familia fosfonatos: fosfomicina (50 µg); familia fenicoles: cloranfenicol (30 µg) y florfenicol (25 µg); familia penicilinas: ampicilina (10 µg); familia quinolonas: ácido nalidíxico (30 µg), enrofloxacina (5 µg) y norfloxacina (10 µg); familia tetraciclinas: oxitetraciclina (30 µg) y tetraciclina (30 µg).
La selección de tales antibióticos se basó, en el caso de la oxitetraciclina, enrofloxacina, florfenicol y norfloxacina, en que son los antibióticos más usados en el tratamiento de vibriosis en camarones (Bermúdez-Almada et al., 2014; Varela-Mejías y Alfaro-Mora, 2018), y en el de los restantes, debido a que fueron incluidos en otros estudios (Albuquerque et al., 2008; Rebouças et al., 2011; Jeyasanta et al., 2017), donde se determinó que cepas de Vibrio spp aislados de camarones fueron resistentes a dichos antibióticos.
Luego de 24 h de incubación a 37 °C, se midieron los diámetros de los halos de inhibición y se determinó su resistencia a los antibióticos comparando con los puntos de corte establecidos en el Cuadro 1. Se calculó para cada cepa el índice de resistencia múltiple a antibióticos (IRMA), dividiendo el número de antibióticos al que es resistente la cepa, entre el número total de antibióticos ensayados. También se determinó la multirresistencia, definida por Magiorakos et al. (2012) como la resistencia de una cepa a cuando menos un producto en tres o más familias de antibióticos.
Ensayo de Sensibilidad de las Cepas Resistentes a los Extractos de Neem y Orégano
El ensayo siguió el diseño completamente al azar, teniendo como tratamientos experimentales los extractos (EE, EA y EPSR) de neem y orégano en sus distintas diluciones. Como control positivo se tuvo discos de oxitetraciclina (30 µg), seleccionado por ser el antibiótico más utilizado en el tratamiento de vibriosis en Tumbes y Ecuador; y como control negativo el solvente utilizado para preparar el extracto (agua destilada o alcohol de 96%). Se prepararon discos esterilizados de papel filtro de 6 mm de diámetro, a los que se les aplicó 20 µl de los EA, EE y EPSR de neem y orégano (en concentraciones de 100, 50 y 25%, cada una de ellas con diluciones sucesivas de 100 hasta 10-3).
Se sembraron cepas de Vibrio spp a una densidad de 1.5 x108 UFC/ml en placas petri con agar MH (cinco repeticiones por tratamiento) y se colocaron los discos impregnados con los extractos así como los controles positivo y negativo. Las placas petri se incubaron por 24 h, para luego determinar el diámetro de los halos de inhibición formados. Los datos obtenidos fueron procesados con análisis de varianza y prueba de Duncan, ambas con 0.05 de nivel de significancia.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Sensibilidad de Cepas de Vibrio spp a Antibióticos
Todas las cepas de Vibrio spp aisladas tanto en Santa Rosa como en Tumbes fueron resistentes a uno o más de los antibióticos utilizados (cuadros 2 y 3), superando los niveles de resistencia antibiótica de 61% reportado para camarones en cultivo en Brasil (Rebouças et al., 2011) y de 75% indicado por Albuquerque et al. (2015), aunque similares a los niveles indicados por Banerjee et al. (2012), lo cual demuestra la variabilidad respecto a la resistencia a antibióticos en diferentes regiones; sin embargo la resistencia de Vibrio spp a múltiples antibióticos, incluso a cefalosporinas de tercera generación, es común habiendo sido detectada en camarones y otros organismos acuáticos (Lee et al., 2018; Letchumanan et al., 2019; Das et al., 2020; Hossain et al., 2020).
Las cepas mostraron índices de resistencia múltiple antibiótica (IRMA) entre 0.1 a 0.8. De estas, la cepa CD09 fue la que mostró resistencia al mayor número de antibióticos (Figura 1), siendo resistente a 8 de 10, con un IRMA de 0.8 (cuadros 2 y 3).
Las cepas aisladas de Santa Rosa fueron mayormente resistentes a fosfomicina (78.6%) y gentamicina (64.3%), pero sensibles a tetraciclina (71.4%), norfloxacina (71.4%) y florfenicol (71.4%). Las cepas procedentes de Tumbes fueron mayormente resistentes a ampicilina (78.6%), fosfomicina (71.4%) y oxitetraciclina (71.4%), pero sensibles a cloranfenicol y (92.9%) y florfenicol (92.9%). Al considerar las cepas de ambas zonas en conjunto, estas fueron más resistentes a fosfomicina (75.0%), gentamicina (64.3%) y ampicilina (57.1%) (Cuadros 4 y 5).
El 57.1% de las cepas fueron resistentes a ampicilina, lo cual es una resistencia bastante común en Vibrio de ambientes marinos (Oh et al., 2011), tal y como lo confirman los hallazgos de Albuquerque et al. (2008), Mendoza et al. (2016), Rosado (2018) y Letchumanan et al. (2019), quienes hallaron 50-75, 65, 57 y 85%, respectivamente, de cepas resistentes a este antibiótico. Esta resistencia se explica por la presencia de un gen de β-lactamasa que se encuentra en el ADN cromosómico de Vibrio (Hossain et al., 2020).
La oxitetraciclina es el antibiótico más usado en Perú y Ecuador para tratar la vibriosis en camarones. El 28.6% de las cepas de Santa Rosa y 71.4% de las cepas de Tumbes fueron resistentes a este antibiótico. Rebouças et al. (2011) en Brasil y Kim et al. (2003) en Japón encontraron 25.8 y 54.3% de cepas de Vibrio spp resistentes a oxitetraciclina. La menor resistencia observada en Brasil, según Rebouças et al. (2011) se debe a que este antibiótico no está aprobado para uso en la acuicultura en dicho país.
Cuadro 2 Sensibilidad antibiótica de las cepas de Vibrio spp aisladas de camarones cultivados en Santa Rosa (Ecuador)
Figura 1 Placas petri mostrando el resultado del antibiograma de una de las cepas de Vibrio spp (Cepa CD09). CN= gentamicina, AMP = ampicilina, FOS = fosfomicina, C = cloranfenicol, FFC = florfenicol, OT = oxitetraciclina, NA = ácido nalidíxico, NOR = norfloxacina, TE = tetraciclina, ENR = enrofloxacina
Cuadro 3 Sensibilidad antibiótica de las cepas de Vibrio spp. aisladas de camarones cultivados en Tumbes (Perú)
Cuadro 6 Diámetro del halo de inhibición (promedio ± desviación estándar, mm) de los EPSR de neem y orégano en cepas de Vibrio spp
En el presente estudio el antibiótico que mostró más efectividad fue el florfenicol, pues 82.1% de las cepas fueron sensibles a este antibiótico; resultado que concuerda con el 100% de cepas sensibles hallado por Rebouças et al. (2011), toda vez que este antibiótico no es muy utilizado en el tratamiento de vibriosis, lo que explica su menor nivel de resistencia.
Las cepas de Vibrio spp mostraron resistencia contra 1 a 5 de las familias de antibióticos. Por otro lado, 8 de las 14 cepas evaluadas en Santa Rosa mostraron ser multirresistentes (57.1%) y 10 de las 14 cepas de Tumbes, también fueron multirresistentes (71.4%). Cuatro cepas, dos de Santa Rosa (HP2-V y HP4-V1) y dos de Tumbes (CD09 y CD11), que representaron el 14.3% de las cepas, mostraron la máxima multirresistencia, siendo resistentes a 5 de las 6 familias de antibióticos (Figura 2), aunque varias de ellas no son utilizadas comúnmente en acuicultura. Esta resistencia, por lo tanto, pudo haber sido generada por otros factores antropogénicos como son la descarga de aguas residuales en el manglar o ríos que desembocan en este (Mendoza et al., 2016; Zhao et al., 2019).
Figura 2 Resistencia de cepas de Vibrio spp a seis familias de antibióticos del estudio. Las cepas cuyas barras superan la línea roja horizontal, son multirresistentes.
Figura 3 Análisis de sensibilidad de las cepas de Vibrio spp al EPSR de neem y orégano. A) Cepa CD13 (resistente a oxitetraciclina), pero sensible al EPSR de orégano sin diluir. B) Cepa HP2-V (multirresistente, sensible a oxitetraciclina) que fue sensible al EPSR de neem sin diluir. OT = oxitetraciclina, O = EPSR de orégano sin diluir, N= EPSR de neem sin diluir.
Existe un riesgo de que la resistencia y multirresistencia a antibióticos que poseen las cepas de Vibrio spp de las zonas en estudio pueda ser transferida a bacterias de otros géneros, incluyendo a cepas patógenas para humanos, originando problemas ambientales y de salud pública, opinión que es compartida por Rortana et al. (2018).
Sensibilidad de Vibrio spp a los Extractos
Se encontró que las cuatro cepas de Vibrio spp ensayadas (dos multirresistentes, HP2-V y HP4-V1 y dos resistentes, CD13 y CD14), no fueron sensibles a los EA y EE de neem ni de orégano. Sin embargo, el EPSR de neem sin diluir pudo inhibir a una de las cuatro cepas (cepa CD13) (p<0.05) (Cuadro 6 y Figura 3), que fue una cepa resistente a la oxitetraciclina. Esto indica que el extracto EPSR de neem, que es más concentrado que el EA y EE respectivo, puede ser una alternativa para el tratamiento de ciertas cepas de Vibrio resistentes a oxitetraciclina. En este sentido, Banerjee et al. (2013), encontraron que el EA de hoja de neem no mostró efecto inhibidor en V. parahaemolyticus y V. alginolyticus aislados de L. vannamei en Malasia, pero observaron inhibición cuando emplearon el jugo de las hojas de neem; es decir un producto más concentrado.
Morales-Covarrubias et al. (2016) evaluaron el efecto de la infusión de hojas de neem en cepas de Vibrio spp aisladas de camarón, observando un efecto inhibidor pero solo cuando se aplicó sin diluir, obteniendo halos con diámetros promedio entre 9.5 y 17 mm, mientras que en este estudio los diámetros de los halos de inhibición de EPSR de neem contra la cepa CD13 fueron de 12.4 ± 1.7 mm (Figura 3), los cuales se encuentras dentro del rango obtenido por dichos autores.
El EPSR de orégano sin diluir inhibió a las cuatro cepas de Vibrio spp ensayadas (p<0.05), tanto a las multirresistentes como a las resistentes, produciendo halos de inhibición entre 8.4 ± 2.6 mm y 14.0 ± 3.2 mm, respectivamente. En estas mismas cepas, el antibiótico de referencia (oxitetraciclina) produjo halos con diámetros entre 5.4 ± 0.8 mm y 19.0 ± 3.2 mm, respectivamente. En el caso de la cepa CD13 que se mostró resistente a oxitetraciclina, el EPSR sin dilución obtuvo halos de inhibición de 14.0 ± 3.2 mm frente a los 5.4 ± 0.8 mm del disco de oxitetraciclina, un halo casi tres veces mayor al producido por la oxitetraciclina.
Morales-Covarrubias et al. (2016) ensayaron infusiones de hoja de orégano en Vibrio spp encontrando inhibición de las cepas, produciendo halos con diámetros entre 9.2 y 18.8 mm, que son parecidos a los hallados en la presente investigación (8.4± 2.6 mm a 14.0± 3.2 mm). Ante lo encontrado, se verifica que los EPSR de orégano son una alternativa interesante para el tratamiento de cepas de Vibrio spp, tanto para cepas sensibles como multirresistentes a antibióticos; mientras que el EPSR de neem podría ser utilizado como fitobiótico, pero dirigido a ciertas cepas de Vibrio spp.
CONCLUSIONES
Las 28 cepas de Vibrio spp aisladas de Litopenaeus vannamei mostraron resistencia al menos a uno de los antibióticos utilizados. De estos 50% fueron resistentes a oxitetraciclina y 64.3% fueron multirresistentes.
La cepa CD09 fue la que tuvo resistencia al mayor número de antibióticos con un IRMA de 0.8.
Los extractos acuosos y etanólicos de hoja de neem y de orégano no inhibieron el crecimiento de Vibrio spp.
Los extractos etanólicos de hoja de orégano, procesados con soxhlet y rotaevaporador, pudieron inhibir el crecimiento de todas las cepas de Vibrio spp, incluyendo a aquellas multirresistentes a antibióticos. Asimismo, el extracto preparado con hojas de neem inhibió solo a una de las cepas de Vibrio spp, pero con un poder inhibidor casi tres veces mayor a la de la oxitetraciclina.
