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INTRODUCCIÓN
La neumonía aguda de las crías destaca como una de las principales causas de mortalidad en alpacas neonatas y tuis del altiplano en el Perú (FAO, 2005), pudiendo ocasionar mortalidades hasta del 27% (Ramírez, 1989), lo que se traduce en enormes pérdidas económicas por disminución de individuos logrados al destete, menor proporción de hembras y machos de reemplazo, y reducción de la producción de fibra (FAO, 2005).
Pasteurella multocida (PM) es un cocobacilo Gram negativo causante de graves enfermedades en un gran número de especies animales (Hunt et al., 2000). Estas infecciones son causadas por específicos tipos capsulares (A, B, C y D) y serotipos (1-16) (Carter, 1952; Heddleston et al., 1972). Además, es el principal agente bacteriano aislado de casos de neumonía aguda en alpacas. Esta bacteria invade el tejido pulmonar luego de un evento de estrés, como exposición al frío extremo, mala nutrición, o por previa infección viral (Cirilo, 2012; Rosadio et al., 2011). En el Perú ha sido reportado el tipo capsular A y genotipo L6 (Rímac et al., 2017), correspondiente a los serotipos 10, 11, 12 y 15 de PM en alpacas fallecidas por neumonía aguda (Harper et al., 2015).
La pasteurelosis neumónica, nombre que reciben todas las infecciones del parénquima pulmonar provocadas por P. multocida es altamente contagiosa y su tratamiento puede ser largo, costoso e inefectivo (Kehrenberg et al., 2001). La prevención mediante medidas de manejo y uso de vacunas son las mejores herramientas para su control (Hurtado et al., 2017). El desarrollo de vacunas implica ensayos in vitro, cuyos resultados deben ser evaluados en la especie de destino para medir su inmunogenicidad y eficacia protectora (OIE, 2008). Diversos autores describen a las proteínas de membrana externa (OMPs) como blancos vacunales promisores en diversas bacterias de importancia en medicina veterinaria, como Bacillus anthracis, Brachispyra hyodisenteriae y Haemophilus parasuis (Ariel et al., 2002; Song et al., 2009; Li et al., 2016). Para la evaluación de la inmunogenicidad de una vacuna usualmente se emplea la prueba de ELISA indirecta, la cual mide el nivel relativo de anticuerpos séricos (Subhash, 2015).
El uso de herramientas bioinformáticas y el conocimiento del genoma de una cepa de P. multocida aislado de un brote de neumonía en alpacas (Hurtado et al., 2017) permitió la determinación in silico de proteínas fuertemente inmunogénicas de PM, dentro de los cuales la proteína P6-like, una OMP asociada al peptidoglicano, tuvo características ideales para su expresión (Juscamayta et al., 2014). Posteriormente, la inmunogenicidad de la rP6-like fue evaluada in vitro, e n células mo nonucleares de sangre periférica (PBMC) de alpaca, donde se corroboró un patrón de expresión celular principalmente de tipo Th2, el cual se relaciona fuertemente con la producción de anticuerpos IgG (Maximiliano et al., 2018). Sin embargo, todavía no se cuenta con estudios que describan el efecto de la rP6-like sobre la inmunidad mediada por anticuerpos en alpacas. El presente estudio tuvo como objetivo determinar la capacidad inmunogénica in vivo de tipo IgG, que puede generar la rP6-like en alpacas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar de Ejecución
El ensayo de campo se ejecutó en enero de 2017, en el Centro de Investigación y Producción C.I.P. La Raya, de la Universidad del Altiplano. El centro se encuentra en el distrito de Santa Rosa, provincia de Melgar, región Puno, Perú, a 4200 msnm. El procesamiento de las muestras se hizo en la Unidad de Biología y Genética Molecular de la Facultad de Medicina Veterinaria (FMV) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM), Lima, Perú.
Animales y Material Biológico
Se formaron cuatro grupos de 20 alpacas tuis Huacaya hembras, seleccionadas al azar dentro de un rebaño de aproximadamente 300 tuis hembra. Los animales tenían aproximadamente 12 meses de edad y se encontraban clínicamente sanos. De cada grupo se tomaron cinco animales al azar para el seguimiento. Se inoculó una dosis única de 2 ml a cada animal de cada grupo: G1 (n=5) 2 x 108 UFC/ animal de la bacterina; G2 (n=5) 10 µg/animal de la proteína recombinante rP6-like; G3 (n=5) 10 µg de rP6-like + 1 x 108 UFC/animal de ambos productos; G4 (n=5, grupo control) Solución salina normal. La inoculación se realizó por vía subcutánea, en la región axilar derecha.
Se tomaron muestras de sangre de la vena yugular los días 0 (tiempo control), 5, 7, 9, 12 y 15. Se centrifugó la sangre a 1600 g durante 10 min. Las muestras de suero recuperadas se mantuvieron a -20 °C hasta su procesamiento en el laboratorio.
Preparación de la bacterina
Se utilizó el protocolo empleado por Hsuan et al. (2009). La bacterina está compuesta por una suspensión en Caldo BHI (Brain-Heart Infusion) de P. multocida (cepa nativa), aislada de un caso en alpacas de la región de Puno, a una concentración de 1 x 108 UFC/ml. Fue inactivada con formaldehido al 0.25% y como adyuvante fue añadido hidróxido de aluminio al 0.25% (v/v). La bacterina se almacenó a 4 °C y se mantuvo con geles refrigerantes durante el procedimiento de inoculación.
Preparación de la proteína recombinante para inoculación
Se utilizó una vacuna de tipo subunidad compuesta por la proteína denominada rP6-like obtenida en la Unidad de Biología y Genética Molecular (FMV-UNMSM). Luego del procedimiento de purificación, la proteína fue diluida en PBS y mezclada con hidróxido de aluminio. La mezcla se almacenó a 4 °C y se mantuvo con geles refrigerantes durante el procedimiento de inoculación.
Preparación de antígeno total de PM para iELISA
Los antígenos para el inmunoensayo fueron preparados usando el protocolo modificado de Ledesma et al. (2016). Para ello, la cepa de P. multocida (cepa nativa) fue cultivada en caldo BHI a 37 °C por 24 h, con agitación continua. El medio de cultivo fue centrifugado en tubos Falcon de 50 ml a 7000 g por 15 min y el pellet fue lavado tres veces con buffer fosfato salino PBS. La lisis de las bacterias fue obtenida suspendiendo el pellet en 10 ml de PBS frío y se realizaron tres ciclos de congelación y descongelación en nitrógeno líquido. Se sonicaron las células bacterianas en siete pulsos de 10 s cada uno, y fueron centrifugadas a 12 000 g por 30 min a 4 °C. El sobrenadante fue separado para su uso posterior. La proteína total de PM fue cuantificada mediante fluorometría usando QubitTM Thermo Scientific y el lisado fue distribuido en alícuotas y almacenado a -4 °C hasta su uso en iELISA.
Preparación de proteína recombinante para ELISA
Los procedimientos de clonación, expresión y purificación son los mismos que se detallan en «Preparación de la proteína recombinante para inoculación». El producto de esta purificación se cuantificó mediante QubitTM Thermo Scientific para diluirla con PBS 0.1M y obtener una dilución final de 100 µg/ml. Esta se almacenó en refrigeración a 4 °C hasta su evaluación mediante la prueba de iELISA.
Estandarización de iELISAs
En la estandarización de la primera p rue b a de ELISA par a detección de anticuerpos anti-rP6-like, los pocillos se tapizaron con rP6-like a concentraciones de 100, 50, 25, 12.5, 6.25 y 3.1 µg/ml y el suero se diluyó a concentraciones de 1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, encontrándose concentraciones óptimas de rP6-like de 3.5 µg/ml y en el suero de 1/200. Para la estandarización de la segunda prueba de ELISA con la proteína total de P. multocida se usaron las concentraciones de antígeno de 140, 70, 35, 16.5, 8.25 y 4.1 µg/ml y el suero se diluyó a concentraciones de 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 y 1:800, encontrándose concentraciones óptimas de proteína total de 35 µg/ml y en el suero de 1:200. Luego de obtener las concentraciones óptimas de antígeno y suero se probaron concentraciones de agente bloqueante (BSA) de 1, 3 y 5% (m/v), donde se eligió la concentración de 3%. El conjugado y cromógeno fueron usados a las concentraciones recomendadas por los fabricantes.
Materiales para iELISA
Se preparó buffer fosfato salino (PBS) a concentración de 0.1 M, el cual sirvió para dilución de todos los reactivos. El buffer de lavado (PBS-T) consistió en una solución de Tween 20 KPL® diluida en PBS a concentración de 0.05%. El suero problema se diluyó a razón de 1:200 en buffer de dilución, el cual está compuesto de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en PBS 0.1M. El anticuerpo conjugado fue un anticuerpo secundario policlonal de cabra anti-IgG de llama enlazado a la peroxidasa de rábano picante (HRP) Abcam® a concentración final de 1/20 000. El sustrato cromógeno 3, 3', 5, 5'- tetramethylbenzidina (TMB) SureblueTM se usó a la concentración recomendada por el fabricante (listo para usar). Para todos los procedimientos se usaron placa s de poliestireno de alta afinidad de 96 pocillos Corning®.
iELISAs de punto único
Las muestras de suero fueron analizadas por la prueba de ELISA indirecta (iELISA) de punto único siguiendo los protocolos descritos por Ledesma et al. (2016) y Shivachandra et al. (2017) para tapizado con proteína total de PM y rP6-like, respectivamente. Se utilizaron dos tipos de antígenos para recubrir las placas de poliestireno. La placa de ELISA fue tapizada con la proteína P6-like diluida en buffer fosfato salino 0.1M (PBS), pH 7.4, a una concentración de 3.5 µg/ml para la evaluación de inmunidad contra la proteína rP6-like. Para la evaluación de la inmunidad contra la bacterina y contra rP6-like + bacterina, se tapizó la placa con 100 µl de proteína total de PM a una concentración de 35 µg/ml mediante incubación a 37 °C durante 1 h. Posteriormente se hicieron tres lavados con 200 µl de PBS-T. Luego se bloquearon los pocillos con 200 µl de BSA 3% a 4 °C durante 16 h. Seguidamente se efectuaron tres lavados con PBS-T y se añadió por duplicado, 100 µl/pocillo de los sueros problema a dilución de 1/200 en solución de dilución, incubándose a 37 °C por 1 h. Se volvieron a realizar tres lavados para luego añadir 100 µl del anticuerpo conjugado con HRP a dilución 1/20 000. Se incubó una vez más a 37 °C por 1 h, se realizaron tres lavados más y se añadió 100 µl sustrato cromógeno (TMB). Finalmente se incubó a temperatura ambiente durante 10 min en la oscuridad. La placa fue leída a una longitud de onda de 650 nm en un espectrofotómetro multicanal Biorad®.
Análisis Estadístico
Se compararon las medianas de OD650 del día cero y demás días dentro de los grupos G1, G3 y G4 mediante la prueba de Wilcoxon. Se hizo un segundo análisis comparando las medianas de los OD650 del G4 y del G2 en cada día de seguimiento mediante la prueba U de Mann-Whitney con un nivel de significancia de 0.05. El software para el análisis estadístico y los gráficos fueron STATA® 15.0 y GraphPadPrism 7®, respectivamente.
Consideraciones Éticas
El manejo de los animales se realizó causando el menor estrés posible. Los muestreos tuvieron una duración promedio de Se 2h por día, desde las 07:00 hasta las 09:00 para no interrumpir el horario de alimentación de los animales. El protocolo de toma de muestra de sangre se realizó tomando en cuenta el método publicado por Morton et al. (1993).
RESULTADOS
La inoculación de la bacterina (en G) produjo un pico de elevación de anticuerpos significativamente superior al del día cero (p<0.05); sin embargo, los niveles de IgG en los días 12 y 15 pos-inoculación no fueron significativamente diferentes al día cero (Figura 1, Cuadro 1). En el Cuadro 2 se observa que 4/5 de animales del G1 aumentaron los niveles de IgG en el día 15 en comparación con sus niveles basales (día 0).
Figura 1 Resultados del ELISA para los niveles promedio de IgG (OD) anti-proteína total de Pasteurella mulcocida en el grupo inoculado con una bacteria (G). Las barras de error son los errores estándar. *: Valor diferente al día cero (p<0.05)
Cuadro 1 Medidas de tendencia central y de dispersión de los cuatro grupos experimentales: (G1) inoculado con bacterina, (G2) inoculado con proteína rP6-like, (G3) inoculado con bacterina + rP6-like, (G4) control
1 Promedios en la misma columna con letras diferentes son estadísticamente diferentes con respecto al día 0 de su mismo grupo (p<0.05) 2 Promedios en la columna del grupo inoculado con la rP6-like (G2) con letras diferentes son significativamente diferentes con el grupo control (G4) DE: Desviación estándar; EE: Error estándar
Cuadro 2 Densidades ópticas para los niveles de IgG (OD650) anti-proteína total de Pasteurella multocida en cada animal inoculados con la bacterina (G1)
En el grupo inoculado con P6-like (G2), desde el séptimo día en adelante se evidenció una elevación significativa de los niveles de IgG con respecto al grupo control (p<0.05), siendo el pico máximo de IgG el día 15 (Figura 2, Cuadro 1). En el Cuadro 3 se visualiza que 5/5 animales del G2 elevaron los niveles del IgG en el día 15 con respecto al grupo de control.
Figura 2 Resultados del ELISA para los niveles de IgG (OD650) anti- rP6-like en el grupo inoculado con P6-like (G). Las barras de error son los errores estándar. *: Valor diferente al día cero del grupo control (p<0.05)
Cuadro 3 Densidades ópticas para los niveles de IgG (OD650) anti rP6-like en cada uno de los animales inoculados con la rP6-like (G2)
En el G, la inoculación de rP6-like + bacterina no estimuló un aumento significativo en los días de seguimiento con respecto al día cero (p>0.05) (Figura 3, Cuadro 1). En el Cuadro 4 se visualiza que 3/5 animales disminuyeron sus niveles del IgG en el séptimo día, y 5/5 animales disminuyeron sus niveles del IgG en el día 15 con respecto al día cero.
Figura 3 Resultados del ELISA para los niveles promedio de IgG (OD ) anti-proteína total de Pasteurella multocida en el grupo inoculado con rP6-like + bacterina (G ). Las barras de error son los errores estándar
Cuadro 4 Densidades ópticas para los niveles de IgG (OD650) anti-proteína total de Pasteurella multocida en cada animal inoculado con la bacterina + rP6- like (G3)
El grupo control no mostró variaciones significativas en los niveles de IgG durante los periodos de evaluación. Además, la desviación estándar fue pequeña en cada día de seguimiento (SD <0.10) (Cuadro 1). Individualmente, los niveles de IgG disminuyeron hasta el día 15 (Cuadro 5).
Cuadro 5 Densidades ópticas para los niveles de IgG (OD650) anti rP6-like en cada animal inoculado con solución salina normal (G4)
La zona de inoculación de no presentó alteraciones inflamatorias ni signos de enfermedad en ninguno de los animales.
DISCUSIÓN
El producto biológico que generó la mayor cantidad de anticuerpos con relación al día cero fue la rP6-like. Estos resultados complementan los hallazgos de Maximiliano et al. (2018), quienes encontraron que la rP6-like estimula una respuesta de tipo Th2 (IgG). Sumado a esto, los resultados concuerdan con Sivachandra et al. (2017), quiénes obtuvieron una elevación significativa de la IgG en el día 21 en ratones. No obstante, la elevación de IgG no fue tan marcada como los llevados a cabo en estudios en ratones (Okay et al., 2012; Shivachandra et al., 2014) debido, probablemente, a que las alpacas ya estaban expuestas a la proteína P6-like. Los resultados de la proteína son más alentadores a corto plazo que los demás productos biológicos, probablemente, debido a que la naturaleza proteica de la P6-like produjo un mayor estímulo sobre las células CD4+ Th2, con la consecuente formación de centros germinativos y generación de células B de memoria, ya que ha sido una exposición secundaria al antígeno, lo cual es compatible con lo formulado por Vinuesa et al. (2005) y Siegrist (2008).
La bacterina produjo una elevación de anticuerpos a partir del noveno día, pero decayeron al día 15. Estos resultados son compatibles con los hallazgos de Sun (2009), quién reportó una pobre inmunogenicidad estimulada por una bacterina de P. multocida inoculada en ovejas. Esta ineficacia de las bacterinas también se ha observado en estudios con Mycoplasma hyopneumoniae (Fisch et al., 2016), Actinobacillus pleuropneumoniae (Shao et al., 2010) y Streptococcus suis (Hsueh et al., 2017). Este suceso podría deberse a la composición múltiple de la bacterina que conlleva a una pobre estimulación de los centros germinativos (Siegrist, 2008). Esto también ha podido ocurrir debido a la disminución en la concentración de las proteínas P 6-l i ke expresadas por la cepa de P. multocida por la «domesticación» de la cepa laboratorial (Fisch et al., 2016).
Los dos productos combinados no resultaron en una elevación de los niveles de anticuerpos, a diferencia del trabajo de Hsuan et al. (2009), quiénes comprobaron que los anticuerpos aumentan considerablemente al inmunizar cerdos con rPMT junto con una bacterina. El resultado del presente estudio pudo deberse a que la bacterina posee un efecto deletéreo o anérgico, tal como los expuestos en el estudio de Dabo et al. (2007). Si este fuera el caso, la bacterina junto con la rP6-like podría ser una mala combinación para continuar con ensayos de validación.
El grupo control presentó ligeras desviaciones con respecto a la media del día 0 (Figuras 1-3), posiblemente debido a factores no controlados, como la temperatura ambiental, la cual es un factor influyente sobre la reactividad de los monocitos (Arias et al., 2016). El tiempo control de todos los grupos (día 0) presentó también niveles muy altos deanticuerpos a diferencia de otros estudios (Okay et al., 2012; Shivachandra et al., 2014; Wei et al., 2017) debido a que, probablemente, P. multocida presente en la microbiota estimuló la producción de anticuerpos anti rP6-like y anti-proteína total de P. multocida (De Steenhuijsen et al., 2015). Esto representa una limitante de las pruebas serológicas en agentes que forman parte de la microbiota; sin embargo eso no ha sido un impedimento para comprobar la eficacia vacunal, tal es el caso de la vacuna contra la enterotoxemia en alpacas (Rosadio et al., 2012).
Adicionalmente se comprobó que la inoculación de los tres productos biológicos no produce efectos adversos visibles en animales jóvenes, lo cual contribuye a los estudios de inocuidad. Estos resultados son compatibles con los trabajos de Moreno et al. (2016) y de Shivachandra et al. (2017) en alpacas y ratones, respectivamente.
Dentro de las limitaciones de este estudio, los resultados de densidades ópticas de los tres productos biológicos no fueron comparables, debido a las dos pruebas de iELISA que se utilizaron para la medición de IgG (Crowther et al., 2009). Así mismo, el tamaño de muestra reducido utilizado en el ensayo limitó el poder estadístico; sin embargo, las diferencias encontradas entre G y el grupo control fueron suficientes para no atribuirlas al error aleatorio (Triola et al., 2009). Por otro lado, el uso exclusivo de hembras tuis limita la generalización de los resultados, pese a que aún no existe evidencia que la inmunidad humoral sea diferente entre alpacas macho y hembra, a diferencia de ovinos (Sun, 2009).
Estos primeros ensayos con la proteína recombinante han permitido conocer su capacidad inmunogénica, pues se ha logrado establecer que rP6-like es capaz de generar anticuerpos específicos de manera significativa y la respuesta generada en estos primeros ensayos indican que, de manera preliminar, podría actuar mejor sola que en combinación con una bacterina. Serán necesarios más estudios para conocer el nivel mínimo protector de anticuerpos y la eficacia de la vacuna elegida.
