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INTRODUCCIÓN
La raza Highlander fue creada por Rissington Breedline Ltd. en Nueva Zelanda en el año 2000, combinando genética de las razas Finnish Landrace (50%), Romney Marsh (25%) y Texel (25%) (Rissington Co., 2001). Se emplea como «compuesto maternal» en cruzamientos con padres de razas sintéticas para la producción de corderos Premium. Se caracteriza por ser una raza prolífica con 10-12% de trillizos, superando 180% de corderos nacidos. Las hembras demuestran una gran precocidad, ya que con 6-7 meses de edad y 40 kg de peso vivo entran a servicio alcanzando 90% de preñez, siendo utilizadas para la producción de cordero ter- minal cuando son cubiertas por líneas paternas, como Suffolk, Poll Dorset u otras. En el servicio por monta natural se utiliza 1.5% de machos, dada su alta libido y capacidad de servicio (Agromeat, 2013). En Argentina se introdujo la raza en el año 2006, mediante la importación de embriones congelados que fueron transferidos con acuerdos de servicios entre el INTA y Rissington Sudamérica, comenzando con las pruebas de performance reproductiva en hembras (Sanchez et al., 2014).
Cox et al. (2015) evaluaron las características seminales de carneros Highlander en estación reproductiva, pero no existe información en la bibliografía internacional del efecto de la estación del año (fotoperiodo) sobre las características reproductivas en general (comportamiento sexual, calidad seminal y testosterona plasmática). Por otro lado, el consenso general es que los machos ovinos se ven menos afectados por el fotoperiodo que las hembras y aunque su actividad reproductiva se encuentra disminuida en el fotoperiodo creciente, conservan su capacidad fecundante durante todo el año (D’Occhio y Brooks, 1983). Asimismo, también existen variaciones entre individuos, pudiendo deberse en parte, a que la reproducción estacional y los mecanismos endocrinos involucrados están afectados por estímulos conductuales que emergen de las relaciones sociales que los animales establecen con otros de su misma especie (Rosa y Bryant, 2002).
La hipótesis de trabajo fue que las características reproductivas de los carneros Highlander varían según la estación del año, siendo el otoño (fotoperiodo decreciente) la estación con mejor aptitud reproductiva. En consecuencia, el objetivo del presente estudio fue determinar el efecto de la estación del año sobre la circunferencia escrotal, peso y volumen testicular, capacidad de servicio, concentración plasmática de testosterona y características cuali-cuantitativas del semen fresco.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar de Estudio
El trabajo se llevó a cabo entre marzo de 2017 y marzo de 2018 en la Estación Experimental Balcarce perteneciente al Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), ubicada en la provincia de Buenos Aires, Argentina (37°45' latitud sur, 58°18' longitud oeste, 130 msnm). Las estaciones del año consideradas fueron otoño (21/03-20/ 06), invierno (21/06-20/09), primavera (21/09-20/12) y verano (21/12-20/03). Se registró diariamente la temperatura máxima, mínima y media, humedad relativa, precipitación y horas luz/día, datos provistos por el Sistema de Información y Gestión Agrometeorológica (SIGA-INTA). Los horarios de salida y de entrada del sol, horario de inicio del crepúsculo civil matutino y de finalización del crepúsculo civil vespertino fueron provistos por el Servicio de Hidrografía Naval (SNHN).
Animales
Se utilizaron seis carneros adultos (5-6 años) de la raza Highlander nacidos por transferencia de embriones congelados importados y elegidos por su alta tasa de concepción en servicios naturales controlados. Los animales se manejaron bajo un sistema de pastoreo rotativo de avena (Avena sativa) (08:00 a 14:00 h) y suplementación a corral (15:00 a 07:00 h) con 400 g/animal de una ración comercial y rollo de pasturas asociadas (alfalfa [Medicago sativa], festuca [Festuca arundinacea], trébol [Trifolium repens L]) con disponibilidad de agua ad libitum. Previo al inicio del ensayo, se descartó la infección por Brucella ovis y Brucella melitensis, mediante análisis serológico y se realizó control de parásitos internos por medio del conteo de huevos por gramo de materia fecal (hpg) cada 45 días y parásitos externos por observación visual, administrando antiparasitarios según las necesidades.
Las variables físicas, como peso vivo (PV), condición corporal (CC; escala de 0 a 5; Russel et al., 1969) y circunferencia escrotal (CE) fueron determinadas una vez por mes. Para la medición de la CE se utilizó una cinta métrica metálica (Knight, 1977) y para la determinación del volumen (VT) y el peso testicular (PT) se utilizó un calibre electrónico (Schuifmaat, 0-150 mm), siendo la longitud medida en el sentido más largo de la gónada, excluyendo cabeza y cola de epidídimo, y el ancho, en la región ecuatorial de cada testículo. Posteriormente se empleó la fórmula de peso testicular [PT=0.5533 x (L) x (A)2] y volumen testicular [VT=4/3 x (ð) x (L/2) x (A/2)2], siendo L=longitud y A=ancho del testículo (Bailey et al., 1998) y los resultados finales se expresan para ambos testículos.
El comportamiento sexual se evaluó mediante la prueba de capacidad de servicio, donde cada carnero fue expuesto a tres ovejas ovariectomizadas sujetadas en bretes durante 20 min, registrándose el número de montas totales y cópulas completas (Ibarra et al., 1999). Esta determinación se realizó dos veces por estación y la eficiencia del servicio se calculó mediante la fórmula: número de cópulas completas/número de montas totales x 100, propuesta por Boyd et al. (1991) para toros jóvenes.
Se tomaron muestras de sangre de la vena yugular en tubos heparinizados que inmediatamente se centrifugaron a 600 g durante 10 min para la obtención del plasma sanguíneo. Posteriormente se almacenó a - 80 °C hasta la determinación de la concentración de testosterona plasmática mediante un kit comercial de radioinmunoanálisis (RIA) (IM1119, Beckman Coulter Inc., USA). Todas las muestras se procesaron con un coeficiente de variación intra-ensayo menor al 9% para concentraciones comprendidas entre 0.09 y 22.0 ng/ml y una sensibilidad estimada de 0.10 ng/ml. Estos muestreos se realizaron una vez por mes.
La colecta de semen se realizó con vagina artificial atemperada a 42 ºC, dos veces por semana, durante las cuatro semanas centrales de cada estación (desde la quinta hasta la octava semana), colectando ocho eyaculados/carnero/estación. Para este procedimiento se utilizó una oveja ovariectomizada como súcubo y la recolección se realizó después de 5 min de pre-excitación y de una falsa monta previa. El tubo con el semen recién extraído fue inmediatamente transferido al laboratorio y colocado a baño maría (Vicking, Masson II®, Argentina) a 32 °C para su evaluación. Las características seminales evaluadas fueron: volumen, pH, motilidad de masa microscópica (escala de 0 a 5), concentración espermática (espectofotómetro Accuread, IMV Technologies, Francia), motilidad total (%), motilidad individual progresiva (%), vigor (escala de 0 a 5), relación vivos/muertos (%, coloración eosinanigrosina) y morfología espermática (Ax et al., 2000), utilizando un microscopio óptico (Nikon. Alphaphot 2 ys2-t®, Japón).
Todos los procedimientos experimentales fueron realizados teniendo en cuenta las normas éticas y de bienestar animal y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Experimetación (CICUAE, Protocolo N.º 025) del INTA, establecido por el principio de las tres R, reducción del número de animales, refinamiento de la técnica y reemplazo de animales por otras técnicas.
Análisis Estadístico
Para la evaluación de las variables físicas, capacidad de servicio, concentración de testosterona y características seminales se ajustaron modelos lineales mixtos para medidas repetidas en el tiempo. Se consideraron los meses/estaciones del año como efecto fijo y el carnero, como efecto aleatorio y en algunos casos se incorporó una estructura autorregresiva entre los errores del mismo carnero dentro de una misma estación. La heterogeneidad de varianza se modeló en las variables donde fue necesario, para seleccionar el modelo adecuado. Además, se realizaron gráficos de diagnóstico de los residuales y pruebas de cociente de máxima verosimilitud restringida, para comparar modelos en cada variable. Se realizaron pruebas de Tukey para determinar diferencias de medias entre variables. Correlaciones de Pearson fueron determinadas entre las variables físicas, concentración plasmática de testosterona y las horas luz/día. Se trabajó con un nivel de significación del 5% para considerar efectos significativos. Los análisis se efectuaron empleando el software R (R Core Team, 2016) mediante la interfaz RStudio (v. 0.99.903). Los gráficos se realizaron con el paquete lattice (Deepayan, 2008) y los ajustes de modelos mixtos se realizaron con el paquete nlme (Pinheiro et al., 2013).
RESULTADOS
La cantidad de horas luz/día promedio por estación se calculó como la diferencia en horas, entre el crepúsculo civil vespertino y el crepúsculo civil matutino. La menor cantidad de horas luz/día se registró a comienzo del invierno (9.32 h/día) y la mayor cantidad de horas luz/día se registró a comienzo del verano (14.48 h/día). La disminución en la cantidad de horas luz/día marca el comienzo del fotoperiodo decreciente (Figura 1).
El PV (kg) promedio (±EE) anual de los animales fue de 72.4 (±0.6) kg. Se registró un aumento promedio de aproximadamente 4% entre estaciones (2.5% otoño-invierno, 4.6% invierno-primavera y 3.8% primavera-verano) y un aumento total de 10.6% entre el otoño y el verano siguiente. La CC promedio (±EE) anual fue de 2.7 (±0.1). En ambas variables el mayor (p<0.05) valor de CC se observó en el verano (Cuadro 1).
Cuadro 1 Promedio (±EE) del peso vivo (PV) y condición corporal (CC) de carneros Highlander en las cuatro estaciones del año
a,b,c,d Valores con letras diferentes dentro de columnas difieren significativamente (p<0.05)
Los promedios (±EE) anuales de la CE, PT y VT fueron 30.8 (±0.2) cm, 380.5 (±4.3) g y 360.4 (±6.9) cm3 respectivamente. En las estaciones de verano y otoño se observaron los mayores (p<0.05) valores en los tres parámetros evaluados (Figura 2).
Figura 2 Variación mensual (promedio ± EE) de la circunferencia escrotal (A), volumen testicular y peso testicular (C) de ambos testículos en carneros Highlander. Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05)
El número promedio mensual de montas totales disminuyó hacia el comienzo del verano (enero), observándose el máximo valor al comienzo del invierno (julio) y una disminución hacia el final de dicha estación, para continuar con una escasa variación (p>0.05) hasta el final del periodo de evaluación. Sin embargo, al analizar los promedios de cada estación, se observaron diferencias significativas (p<0.05) entre el invierno (15 montas) respecto de la primavera (10) y el verano (8.5) (Figura 3A). No se observaron diferencias significativas (p>0.05) en los porcentajes promedio mensuales de la eficiencia de servicio dentro de cada estación; sin embargo, se detectó un menor (p<0.05) valor en el invierno (44%) (Figura 3B) al analizar las diferencias en los porcentajes promedio entre estaciones.
Figura 3 Variación mensual (promedio ± EE) del número de montas totales, cópulas completas y eficiencia de servicio (%) (B) (
contrastes entre estaciones) en carneros Highlander. Letras diferentes indican diferencia significativa (p<0.05)
La Figura 4 muestra que la mayor (p<0.05) concentración de testosterona plasmática fue determinada en el verano (enero: 15.2 ± 4.32 ng/ml), disminuyendo en forma constante hasta el final del invierno (agosto: 0.12 ± 0.1 ng/ml).
Figura 4 Variación mensual (promedio ± EE) de la concentración plasmática de testosterona en carneros Highlander. Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05)
Entre las variables con correlaciones positivas superiores a 0.5, se observó que las variaciones de la CE se asociaron con el volumen y el peso testicular. Asimismo, el peso y el volumen testicular presentaron una relación directa. La regresión lineal indica que, a medida que aumentó 1.0 cm la CE, aumentó 24.0 cm3 el volumen y 24.0 g el peso testicular (R2=0.61). Por otro lado, la concentración de testosterona plasmática estuvo asociada con las horas luz/día (Cuadro 2).
Cuadro 2 Matriz de coeficientes de correlación de Pearson entre las variables físicas, la capacidad de servicio, la concentración plasmática de testosterona y las horas luz/día en carneros Highlander
*p<0.05; **p<0.001; ***p<0.0001
Los resultados de calidad espermática de los 192 eyaculados se presentan en el Cuadro 3. En primavera se observó un menor volumen comparado con el otoño e invierno (p<0.05), sin embargo, no se observaron diferencias con el verano. Los valores del total de espermatozoides fueron más altos en otoño e invierno (p<0.05) y la concentración espermática, la motilidad de masa microscópica, la motilidad total y el vigor fueron más bajos en el verano (p<0.05). De otra parte, no se observaron diferencias significativas entre estaciones en pH y motilidad individual progresiva (p>0.05). El porcentaje de espermatozoides vivos fue menor (p<0.05) en el otoño comparado con el verano. No se observaron diferencias significativas (p>0.05) en el porcentaje de espermatozoides norma- les entre estaciones.
Cuadro 3 Parámetros seminales (media ± EE) de los eyaculados de carneros Highlander
abc Valores con letras diferentes en la misma columna difieren significativamente (prueba de Tukey; p<0.05)
n = N.° de eyaculados; VOL: Volumen seminal; pH: pH seminal; CONC: Concentración espermática; TESPZ: Total de espermatozoides; MMM: Motilidad de masa microscópica; MT: Motilidad total; MIP: Motilidad individual progresiva; EV: Espermatozoides vivos
El porcentaje de espermatozoides con anormalidades a nivel de la cabeza se incrementó desde el otoño e invierno hasta alcanzar el máximo (p<0.05) en el verano. En el otoño se observó el mayor (p<0.05) porcentaje de espermatozoides con anormalidades a nivel de la pieza intermedia y en el verano el menor (p<0.05) porcentaje de espermatozoides con anormalidades a nivel de la cola (Cuadro 4).
Cuadro 4 Anormalidades espermáticas (media±EE) en semen fresco de carneros Highlander (48 eyaculados por estación)
ab Valores con letras diferentes en la misma columna difieren significativamente (prueba de Tukey; p<0.05)
EN: Espermatozoides normales; EACA: Anormalidades de cabeza; EAPI: Anormalidades de pieza intermedia; EAC: Anormalidades de cola
DISCUSIÓN
Los datos del presente trabajo muestran que los carneros Highlander mantienen sus características reproductivas a través de las cuatro estaciones, y con valores dentro del rango para la especie. No obstante, se observaron fluctuaciones estacionales en la concentración de testosterona circulante, circunferencia escrotal, peso y volumen testicular, con máximos valores en el verano y otoño (fotoperiodo decreciente). Por otro lado, los parámetros de calidad seminal evaluados fueron superiores en el otoño e invierno.
El peso vivo de los carneros aumentó en forma progresiva desde el inicio (otoño) del estudio, observándose más de 10% de aumento hacia el verano, debido a que el aporte energético/proteico de la dieta suministrada superó los requerimientos de mantenimiento. La CC se mantuvo constante durante el año, observándose un aumento al final del estudio (verano).
La actividad gonadal está regulada por cambios en la duración de las horas luz/día (fotoperiodo) (Lincoln et al., 1990; Dickson y Sanford, 2005; Gómez-Brunet et al., 2008; Sarlós et al., 2013). Asimismo, el tamaño de los testículos es un buen indicador de la capacidad espermatogénica de un semental (Coulter y Foote, 1979; Toe et al., 2000). De otra parte, la CE tiene una alta correlación con el peso y el volumen testicular (Notter et al., 1981; Bailey et al., 1998). En el presente trabajo, la mayor CE se registró en las estaciones de verano y otoño (fotoperiodo decreciente) y la menor, en invierno y primavera (fotoperiodo creciente). Similar comportamiento se observó en los parámetros de biometría testicular (peso y volumen), los cuales, a su vez, presentaron una correlación positiva con la CE, lo cual concuerda con otros reportes en razas como Texel, Suffolk e Ile de France (Mandiki et al., 1998), Corriedale (Gastel et al., 1995) y Karakul (Kafi et al., 2004). Cox et al. (2015) encontraron en carneros Highlander adultos en Chile una mayor CE en la época reproductiva (38.1 cm) que en este estudio (34.0 cm), diferencia que no puede ser atribuida a la calidad nutricional (Brown, 1994) ya que la ración suministrada fue adecuada.
En la prueba de capacidad de servicio se tuvieron en cuenta los tiempos de evaluación indicados por Ibarra et al. (1999) y Cox et al. (2015), reduciendo la duración de la prueba de 40 a 20 minutos, haciéndola más práctica y sin perder eficacia en la detección de carneros con alta y baja capacidad de servicio. La capacidad de servicio tiene una moderada heredabilidad (0.22) y alta repetibilidad (0.72) (Snowder et al., 2002) y se requieren de al menos seis pruebas individuales para obtener una fiabilidad del 95% (Stellflug y Berardinelli, 2002). La capacidad de servicio se manifestó durante todo el año; sin embargo, el mayor número de cópulas completas se registró en el otoño y el mayor número de montas totales en el invierno (Figura 3). El primer caso, se podría explicar que fue debido a una mayor libido asociada al fotoperiodo decreciente, el cual actúa regulando positivamente la secreción de gonadotrofinas (Bustos Obregón y Torres, 2012); sin embargo, el número de montas totales estuvo asociado al fotoperiodo creciente. Similares resultados fueron reportados por Schanbacher y Lunstra (1976) para las razas Suffolk y Finnish Landrace (componente genético de la raza Highlander) y por D’Occhio y Brooks (1983) para las razas Border Leicester, Poll Dorset, Romney y Suffolk. En contraste, Kafi et al. (2004) observaron un menor número de cópulas completas en el otoño y un mayor número en el invierno para la raza Karakul.
La eficiencia de servicio es la capacidad que posee un reproductor para realizar una monta y que la misma finalice en una cópula completa. En el presente estudio la eficiencia de servicio disminuyó en el invierno (Figura 3), por lo que los carneros debieron realizar un mayor número de montas por cada cópula completa. El análisis en conjunto de la capacidad y de la eficiencia de servicio, indicaría que, si bien la libido no es inhibida completamente, se observa una estacionalidad para estas variables. Los resultados indican que la eficiencia de servicio podría ser utilizada para seleccionar carneros con mayor eficiencia para aumentar la fertilidad de las majadas en programas intensivos de reproducción (Stellflug et al., 2008).
Las mayores concentraciones de testosterona plasmática se observaron en el verano, especialmente en enero, indicando una influencia del fotoperiodo creciente. Es conocido que previo a la época reproductiva, ocurre un aumento de los receptores para FSH y LH en el testículo, siendo estos últimos los encargados de estimular las células de Leydig, promoviendo la secreción de testosterona (Pelletier et al., 1982). Por lo tanto, este evento parecería ser un requisito previo para estimular al testículo a la máxima actividad estacional y podría estar relacionado con la duración (49 días) de la espermatogénesis en ovinos (Sanford et al., 1974; Lincoln et al., 1990). Por otro lado, Aller et al. (2012) reportaron un comportamiento similar en carneros Corriedale y Pampinta en Argentina.
La estación del año, frecuencia de extracción del semen, temperatura ambiental, enfermedades subyacentes, estado nutricional y la edad del reproductor influyen sobre la calidad seminal (Kafi et al., 2004; Rosa et al., 2012). En el presente estudio, el pH del semen estuvo en un rango aceptable (6.9-7.2), indicando el buen estado de salud de los carneros y del manejo del semen desde su extracción hasta su procesamiento. Demoras en la evaluación del semen produce una acidificación de la muestra (Zamiri et al., 2010). El menor volumen seminal se registró en la primavera, en tanto que la menor concentración espermática se registró en el verano, periodo que se inicia cuando las horas luz/día decrecen en la latitud en estudio (a partir del 21 de diciembre en el hemisferio sur); por lo que, posiblemente en la estación de verano, la eficiencia cuantitativa de la espermatogénesis podría encontrarse disminuida (Amir et al., 1986).
Cox et al. (2015) obtuvieron en carneros Highlander un mayor volumen seminal (1.54 ml) y una menor concentración espermática (2850 millones/ESPZ/ml) que lo observado en el presente estudio. Por otro lado, el número total de espermatozoides fue menor en la primavera y el verano, pero esta disminución no tuvo relación con la concentración espermática, por lo que este efecto es atribuido al menor volumen seminal obtenido en dichas estaciones. Los parámetros cinéticos de movilidad espermática (motilidad de masa microscópica, motilidad total y vigor) disminuyeron principalmente en el verano; sin embargo, la motilidad individual progresiva no varió entre estaciones. La disminución de la cinética espermática podría estar asociada a un menor aporte de energía en primavera por parte de las glándulas vesiculares, influenciada por la baja concentración de testosterona (Pelletier et al., 1982).
El porcentaje total de anormalidades espermáticas no varió entre estaciones, pero se pudo observar diferencias en los porcentajes relativos de las diferentes anormalidades entre estaciones. Los mayores porcertajes de anormalidades a nivel de la cabeza se encontraron en primavera y verano, de pieza intermedia en el otoño, y de cola en el otoño, invierno y primavera. Parte de la explicación podría atribuirse a la mayor temperatura ambiental registrada en el fotoperiodo decreciente (40.7 °C), la cual causa un estrés térmico a nivel testicular (Williamson, 1974). Por otro lado, Mickelsen et al. (1981) determinaron que a menor circunferencia escrotal se observó un mayor porcentaje de espermatozoides anormales y este efecto, probablemente, se encuentre asociado negativamente a la producción cualitativa de la espermiogénesis en respuesta a un fotoperiodo creciente, lo que explicaría las anormalidades de cola observadas en el invierno en el presente estudio.
CONCLUSIONES
Las variables físicas (circunferencia escrotal, peso y volumen testicular) en los carneros Highlander varían con la estación del año, con mayores valores en verano y otoño (fotoperiodo decreciente).
El número de montas completas fue mayor en otoño y la eficiencia de servicio fue menor en invierno (fotoperiodo creciente).
La concentración de testosterona plasmática presentó un patrón estacional, registrándose los máximos valores a comienzo del verano.
Los parámetros de calidad espermática fueron superiores en otoño e invierno.
