INTRODUCCION
Las quemaduras oculares producidas por agentes químicos o físicos son una verdadera emergencia que genera un daño tisular en el globo ocular y/o estructuras anexas (Bradford, 2004). Al mismo tiempo, la mala cicatrización provocada por ulceración corneal constituye una de las principales causas de ceguera y de deterioro de la visión (Arenas y Torres, 2008). Se estima que cerca de 500 000 lesiones oculares ocasionan ceguera a nivel mundial, donde el trauma es la causa principal unilateral (Geerling et al., 2004), con mayor frecuencia en adultos jóvenes que se encuentran dentro de la población económica productiva (Ministerio de Salud, 2009), donde dos terceras partes ocurren en el trabajo y el resto por accidentes domésticos (Díaz-Mendoza et al., 2019). Hospitales de España, Francia, Reino Unido y Estados Unidos reportan entre 5 a 8& de las emergencias atendidas (Edwards, 1987; Nash y Margo, 1998; Girard et al., 2002; Sánchez et al., 2004). n estos casos, las producidas por álcalis son dos veces más frecuentes que las producidas por ácidos, debido a que son muy usados en el hogar y las industrias (Kanski, 2008)..
Según el informe del Boletín del Anua- rio Estadístico mensual de notificaciones de accidentes de trabajo, incidentes peligrosos y enfermedades ocupacionales del ministerio del trabajo y promoción del empleo del Perú de junio del 2020 (MTPE, 2020), las lesiones oculares ocupan el primer lugar con 10.2% en los cuadros de partes del cuerpo lesionadas. Asimismo, según el departamento de estadística del Instituto Nacional de Oftalmología (INO), las lesiones oculares que afectaron la córnea hasta el tercer trimestre de 2019 bordearon los 12 700 casos, ocupando el tercer lugar de frecuencias de atenciones (INO, 2019).
Las lesiones oculares se pueden clasificar según su agente causal, en quemaduras químicas generadas por álcalis o ácidos y quemaduras físicas por agentes térmicos o radiación ultravioleta (Dua et al., 2001; Spector y Fernández, 2008) y la severidad del daño ocular, ya sea producido por álcali o acido, se determina por el tipo de químico, la concentración de la solución, la superficie de contacto, la duración de exposición y grado de penetración (Gandaho et al, 2016). Una vez producida la lesión se manifiestan signos y síntomas como dolor, epifora, fotofobia, llegando inclusive a necrosis de la córnea, isquemia del limbo y hasta complicaciones como opacidad de la córnea y ceguera (Nishida et al., 1996).
El suero autólogo no solo actúa como lubricante en la superficie ocular, sino que también proporciona varias sustancias esenciales para la recuperación del epitelio daña- do, incluida la vitamina A, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), la fibronectina y una variedad de citocinas (Tsubota et al., 1999; Vercesi et al., 2009). Estos factores de crecimiento tisular en el suero se facilita la proliferación, migración y diferenciación del epitelio de la superficie ocular (Acosta et al., 2014).
Tsubota et al. (1999), al evaluar la efectividad del suero autólogo en 20 pacientes demostraron que las gotas oftálmicas de plasma rico en plaquetas (PRP) reducían la recidiva de erosiones corneales sin complicaciones significativas. Asimismo, Vercesi et al. (2009), demostraron en conejos que la utilización del uso tópico de factores de crecimiento puede constituirse en una herramienta útil para el manejo de úlceras de córnea de difícil tratamiento, en tanto que Acosta et al. (2014) concluyeron que el PRP demostró ser tan efectivo como el producto comercial SolcoserylR para el tratamiento de regeneración de úlceras corneales profundas y extensas.
La solución de las lesiones que afectan la superficie ocular constituye un problema de salud pública a resolver, puesto que el tratamiento convencional no siempre permite una evolución favorable. Debido a la evidencia científica que demuestra que los factores de crecimiento mejoran la cicatrización de tejidos blandos con epitelios muy parecidos a los originales, el presente estudio tuvo como objetivo determinar mediante un estudio piloto en conejos el efecto del Suero Autólogo (SA) rico en factores de crecimiento aplicado en estas lesiones traumáticas de la superficie corneal de evolución lenta e incierta, evaluando el tiempo de recuperación al inducir mejor cicatrización, la calidad del tejido resultante y las complicaciones infecciosas propias de estas lesiones.
MATERIALES Y METODOS
Lugar del Estudio
Se realizó un estudio piloto preclínico experimental de caso-control, aleatorio y enmascarado en todas sus etapas en lesiones de 15 mm2 en córneas de conejos producidas por abrasión quirúrgica controlada y posterior contacto al alcohol o ácido sulfúrico pH 1 (ácido de batería), en los laboratorios de la Universidad Ricardo Palma, Lima.
Animales y Tratamientos
Se trabajó con 10 unidades oculares provenientes de cinco conejos jóvenes machos (Oryctolagus cuniculus), raza Nueva Zelanda, de peso 2.5 ± 0.5 kg, provenientes del bioterio del Instituto Nacional de Salud (INS). Los conejos, previo al estudio, recibieron aclimatación por una semana en jau- las individuales. Se les proporcionó alimento y agua ad libitum en una habitación con temperatura controlada (21 ± 5 °C), manteniendo ciclos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.
Los especímenes se distribuyeron en dos grupos: A (dos conejos - 4 unidades oculares) a quienes se les aplicó alcohol al 70% en los ojos; B (3 conejos - 6 unidades oculares) a quienes se les aplicó ácido sulfúrico pH 1. La aplicación abrasiva, en todos los casos fue en un ojo, dejando el otro ojo como control (caso-control), donde se aplicó suero fisiológico (SF). El enmascaramiento se dio por parte de las evaluaciones oftalmológicas y las de anatomía patológica, quienes desconocían las unidades caso-control.
Las variables de estudio fueron: la evaluación del dolor durante la etapa de estudio con la escala de la mueca del conejo - Rabbit Grimace Scale - RbtGS - (Benato et al., 2020) que arroja una puntuación de 0 (no presente), 1 (moderadamente presente) y 2 (obviamente presente); evolución del área de la lesión con la prueba de fluoresceína; transparencia corneal y fotografía en macro; aparición de infecciones; y evaluación histopatológica de las muestras corneales post mortem.
Procedimientos
La anestesia fue de acuerdo con la clasificación ASA 2. Se utilizó Propofol 5-14 mg/kg EV, para el manejo del dolor se utilizó Ketamina 15-20 mg/kg EV y para revertir el efecto de la sedación se usó Yohimbina 0.2- 1 mg/kg EV. Los fármacos fueron aplicados a través de la vena auricular marginal.
El Suero Autólogo (SA) se extrajo bajo técnica cerrada al vacío con nula manipulación, según la normativa española, mediante el Real Decreto 175/2001 (BOE N.° 065-2001 de 16/03/2001: 9746- 9755). La sangre (10 ml) se colocó en seis tubos estériles al vacío de
3.5 ml con citrato de sodio 3.2%, los que se sometieron a centrifugación (Greed-Med GT 119-100T) a 3500 rpm durante 8 min. Se obtuvo de 5 a 7 ml de SA acondicionados en goteros y se almacenaron a 4 ºC para su aplicación durante los siguientes 5 días. Cada frasco podía contener entre 100 y 140 gotas.
La lesión corneal controlada se dio el Día 0 en las instalaciones del laboratorio de cirugía experimental de la Escuela Profesional de Ciencias Veterinarias de la de la Universidad Ricardo Palma. Se hizo, de manera controlada, una laceración superficial con un bisturí 11º en un área aproximada de 50 mm2, con posterior lavado con solución fisiológica y limpieza con lactantes de celulosa para eliminar restos. La aplicación inmediata de los agentes agresores (alcohol y ácido sulfúrico) fue de manera aleatoria bajo el mismo periodo anestésico.
Pasados 30 segundos, se realizó el lavado con SF (Cuadro 1). Las gotas oftálmicas con SA y SF fueron aplicadas en la unidad caso y en la unidad control, respectiva- mente. Desde el día 0 hasta el día 2 se les aplicó una gota cada 2 h y del día 3 al 4 una gota cada 4 h. La primera dosis se hizo a las 2 horas de la lesión (Cuadro 1). Todos los casos y controles recibieron un total de 36 gotas oftálmicas de suero autólogo y de suero fisiológico respectivamente. La dosificación de las gotas oftálmicas en condiciones normales y fuera del periodo de la anestesia se hizo sin generar estrés en los animales.
Todas las evaluaciones fueron realizadas por el mismo oftalmólogo, y se efectuaron antes del procedimiento, a las 2 horas de producida la lesión y se continuó con una evaluación diaria hasta el día 4. En el día 5 y luego del sacrifico de los animales, se extrajeron los ojos y se procedió al aislamiento de las corneas para su inmediato traslado al laboratorio donde las córneas extraídas se fija- ron en formol al 10% para su tinción e inclusión en hematoxilina-eosina y cortes de 14 µm. Para la evaluación histopatológica, un juego de muestras se analizó en el Laboratorio de Anatomía Patológica de la Facultad de Medicina de la Universidad Ricardo Palma, y un segundo set de láminas en el Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Nacional ESSALUD - Edgardo Rebagliati Martins.
Análisis Estadístico
Los datos recolectados se registraron a doble ciego en una hoja de Excel 2017 contrastándola con las hojas de recolección de datos para evitar la omisión o el ingreso de datos erróneos. Se le asignó un código a cada unidad de trabajo. Las variables cualitativas se describieron a través de frecuencias y porcentajes. Para el análisis de la normalidad se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk y la prueba U de Mann-Whitney. Para el análisis bivariado se utilizó la prueba Exacta de Fisher función hibrida para variables politómica disponible en el software Stata (p<0.05, IC del 95%).
Aspectos Éticos
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Estudios en Animales de la Universidad Ricardo Palma (URP). Los procedimientos estuvieron de acuerdo a las normas de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (normas ARVO) relacionadas con el uso de animales en investigación.
RESULTADOS
Escala de la Mueca del Conejo (RbtGS)
El tipo de agente agresor tuvo efectos significativos sobre la puntuación RbtGS. El ácido sulfúrico pH 1 fue más «doloroso» para el animal que el alcohol (Figura 1). Esta última se vio reflejada en el bienestar de los animales a partir de las dos horas de la intervención. Todos los conejos disminuyeron progresivamente su malestar hasta el día 4, excepto un espécimen del Grupo B que mantuvo un malestar moderadamente presente hasta el final del estudio (Figura 2).
Test de Fluoresceína (Efecto Reparador)
Los ojos tratados con SA (Figura 3) mostraron reducción significativa del perímetro de la lesión y mayor transparencia (p<0.008). Asimismo, se observa que el tratamiento con SA promovió una reparación más eficiente que los tratados con SF (p<0.05) (Cuadro 2).
Al analizar el promedio de reducción de las lesiones corneales se encontró que el grupo que recibió el SA tuvo una reducción porcentual significativamente más rápida que los del grupo control (p=0.005 de U de Mann- Whitney). El total de casos tuvo un porcentaje de reducción del 85.2% a diferencia del porcentaje de reducción de los controles que fue del 47.4% (Cuadro 3).
Estudio Histopatológico
Las muestras histopatológicas teñidas con hematoxilina-eosina fueron analizadas por dos patólogos ajenos al estudio. El daño del epitelio corneal mostró ser similar para ambos agentes agresores (ácido sulfúrico pH 1 o alcohol 70%). En ambos casos se encontró un tejido conjuntivo hialino con células fusiformes de aspecto fibroblaìstico, estroma laxo con zonas basófilas y presencia de leve infiltrado inflamatorio.
La córnea de los conejos tratados con SA al día 4 mostró un epitelio corneal uniforme, no discontinuo. La membrana de Bowman se encuentra visible. El estroma laxo con formaciones basófilas con un leve infiltrado inflamatorio local. La membrana de Descemet y el endotelio corneal se encuentran conservados. En las córneas control se observó discontinuidad del epitelio corneal, degeneración vacuolar epitelial e hiperplasia papilar con pequeñas cavidades dilatadas de aspecto quístico y neovascularización, además de inflamación aguda con presencia de infiltrado polinuclear de aspecto leucocitario e inflamación crónica con presencia mononuclear de aspecto linfocitario (Figura 4).
DISCUSION
Se vienen desarrollando técnicas y tratamientos dirigidos a favorecer la regeneración de los tejidos corneales, entre ellos el concentrado Autólogo de Plaquetas (Bonilla-Gutierrez et al., 2017). En el presente estudio se utilizó el suero autólogo generado de la extracción proceso de centrifugación, debido a que dentro del suero se encuentra diversas proteínas que intervienen en la reparación, pero que no estarían involucradas dentro del plasma rico en plaquetas, lo que podría explicar los resultados obtenidos en comparación con otros reportes.
En la reparación tisular se llevan a cabo complejos procesos en los que intervienen multitud de factores, entre ellos células, proteínas y citoquinas. Las plaquetas y sus agentes son columnas importantes en la construcción del entramado que restaura las heridas (Borzini y Mazzucco, 2007). Los factores de crecimiento contenidos en el SA son útiles y de demostrada eficacia en determinadas patologías oftalmológicas, como es el caso de las úlceras corneales, el síndrome de ojo seco, el síndrome post-LASIK, la perforación ocular, la disfunción de la glándula lagrimal, los agujeros maculares y los trasplantes de limbo (Solans Pérez et al., 2015). En este sentido, Montón-Echevarría et al. (2007) concluyen que la utilización de los factores de crecimiento incrementa la reparación de tejidos blandos, disminuyendo las infecciones concomitantes, las postoperatorias y el dolor.
En la búsqueda de alternativas a los agentes químicos presentes en las lágrimas artificiales se encontró que el SA tiene el mismo pH y osmolaridad de la lágrima (Geerling et al., 2004). Esto en parte explicaría la tole- rancia y rápida adaptación del empleo del SA
en el presente estudio. No obstante, existen reportes de estudios comparativos en otros animales donde no se encontró diferencias significativas entre el grupo caso y control en el marco de la opacidad y reparación de la córnea (Vercesi et al., 2009; Acosta, 2017).
Si bien es cierto, los hallazgos del presente estudio son prometedores y se viene manejando parámetros estandarizados de procesos en la obtención, aplicación y concentraciones de suero autólogo, no existe un consenso hasta el momento en referencia a este tema. Se utilizó SA al 100% sin manipulación alguna de tejidos con un solo ciclo de centrifugación y con aplicación de 1 gota cada dos horas con disminución progresiva de la dosis. Otros autores manifiestan diferencias en las concentraciones y goteo en el tiempo, incluso que la concentración de este debería ser al 20% (Young et al., 2004; Vercesi et al., 2009; Acosta, 2017). En esta línea, en este estudio se optó por no utilizar coadyuvantes como analgesia o antibióticos de dosificación ocular sin que se hayan desarrollado procesos infecciosos agregados, a diferencia de otros estudios (Noble et al., 2004; Young et al., 2004).
CONCLUSIONES
El tratamiento con suero autólogo pro- mueve una reparación de las lesiones corneales de manera más eficiente que los tratados con suero fisiológico.
El estudio histopatológico mostró una mejor distribución, regeneración y conservación de las capas cornales con el uso del suero autólogo.