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INTRODUCCIÓN
El maíz es uno de los cultivos más utilizados para la preparación de ensilados como fuente alimenticia del ganado (Neves et al., 2015; Junior et al., 2017). El ensilado en un proceso fermentativo y anaerobio, donde el ácido láctico es el responsable de mantener un medio adecuado para el crecimiento bacteriano en un pH entre 4.0 y 4.2, inhibiendo de esta forma el desarrollo de microorganismos que provocan la putrefacción (Wong, 2001). El proceso de ensilado permite reciclar y conservar productos y subproductos de cosecha por largos periodos bajo diferentes escenarios climáticos (Aragadvay- Yungán et al., 2015; Wendling y Pinheiro, 2018).
Esta herramienta tecnológica es, por otro lado, una alternativa para prevenir la contaminación ambiental (Llano y López, 2008), fortaleciendo además la sostenibilidad de la ganadería mediante el uso eficiente de forrajes ricos en nitrógeno y evitando su liberación al medio ambiente (Llano, 2012). Sin embargo, una alta degradabilidad de proteínas de los ensilajes disminuye su uso como fuentes de proteínas, de allí que el aumento de nitrógeno amínico durante el almacenamiento debe utilizarse como una guía para determinar el grado de descomposición de las proteínas y la calidad de la fermentación del ensilado (Llano, 2012). En este sentido, en la elaboración de ensilaje de maíz se han utilizado diferentes aditivos, tanto solos como combinados con urea (Llano y López, 2008), óxido de calcio (Cristina et al., 2015) y glicerina (Bensimon et al., 2015), entre otros.
El uso de levaduras como Saccharo- myces cerevisiae (Sc) es un aditivo que puede ser utilizado en la elaboración de ensilajes. Todas las especies de levaduras del género Saccharomyces fermentan ciertos tipos de azúcares en medios anaerobios (Barnett, 1976). Durante el proceso de ensilado se pro- duce una fermentación láctica en un ambiente anaerobio, donde los carbohidratos hidrosolubles, principalmente azúcares como hexosas (glucosa) y pentosas (D-xilosa), son los principales sustratos (Lezcano et al., 2017). Sc es una levadura que no puede fermentar glucosa y D-xilosa (Barnett, 1976); sin embargo, puede degradar lentamente la D-xilulosa, que es un cetoisómero de la D- xilosa. Por lo tanto, se considera que la D- xilulosa-5-fosfato formada de este modo entra en la ruta metabólica de la pentosa 5-fosfato (Wang y Schneider, 1980) para la obtención de piruvato, que puede ser utilizado por las bacterias lácticas durante la fermentación.
Por otro lado, se ha utilizado Sc modificados o añadidos con enzimas específicas para permitir la acumulación intracelular de xilosa y permitir un metabolismo eficiente de la D- xilosa y celobiosa (Kotter y Ciriacy, 1993; Ha et al., 2011). Es así que, el objetivo del estudio fue determinar el valor nutricional, producción de gas in vitro y degradación ruminal in situ de ensilajes de maíz enriquecidos con Saccharomyces cerevisiae para obtener un alimento estratégico para rumiantes.
MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación y Tratamientos
La investigación fue desarrollada en el laboratorio de ruminología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Técnica de Ambato (UTA). Se utilizó forraje de maíz blanco (Zea mays, variedad INIAP 101 maíz blanco) sembrado el 4 de abril de 2019 en el centro experimental de la UTA y cosechado a los 182 días. Las plantas fueron picadas inmediatamente después de la cosecha en trozos de 2.5 cm, utilizando una picadora JF 30 EVO®. El forraje fue pesado y guardado en 24 bolsas de polietileno de 0.07 mm bajo la forma de microsilos. En cada microsilo se añadió, según su peso fresco, 0, 10 y 20% de levadura de panadero (Fleishmann® células activas de Saccharo- myces cerevisiae) que correspondieron al tratamiento control (T0), tratamiento 1 (T1) y tratamiento 2 (T2), respectivamente. El aire de cada bolsa fue extraído y las bolsas fueron selladas con cinta adhesiva. Cada microsilo tenía un peso de 4 kg y fueron abiertos a los 70 días.
Para determinar el pH, se tomaron de 20 g de cada microsilo, se colocaron en una licuadora con 180 ml de agua destilada a temperatura ambiente por 30 s. La mezcla fue pasada por cuatro capas de tela manta de cielo y el pH se midió en el extracto con potenciómetro digital (Aragadvay-Yungán et al., 2015).
Se tomaron muestras de cada microsilo (100 g) para la determinación de materia seca (MS). El contenido restante de los micro silos se desecó en una estufa de aire forzado a 60 °C hasta alcanzar un peso constante. Se tuvo en cuenta durante el secado el uso de factores de corrección cuando no se utiliza la técnica de arrastre de tolueno (Dulphy y Demarquilly, 1981), que toma en cuenta las pérdidas de compuestos volátiles multiplicando por el factor 1.08 cuando la MS oscila entre 20 a 29%, como en el presente trabajo. Todas las muestras secas se molieron para reducir el tamaño de la partícula usando un molino de martillo con un tamiz de 1 mm, y se almacenaron para su posterior valoración nutricional y ensayos in vitro.
Análisis Químico
La MS se determinó mediante el secado de 1 g en una estufa de aire forzado a 100 °C durante 24 h.
Las cenizas fueron determinadas mediante incineración en mufla durante 4 h a 450 °C (AOAC, 1990).
La materia orgánica (MO) se calculó restando las cenizas del contenido de MS total.
El nitrógeno (N) se determinó por el método de micro Kjeldahl (AFRC, 1993), y la proteína cruda (PC) se calculó como el producto de N x 6.25.
La fibra neutro detergente (FND) y la fibra ácido detergente (FAD) se determinaron usando técnicas recomendadas (Ankom, 2005).
La energía metabolizable (EM) fue estimada multiplicando la digestibilidad de la MO (DIVMO) x 0.0157 (Ankom, 2005).
Producción de Gas in vitro
La cinética de fermentación de los tratamientos fue determinada por la técnica de producción de gas in vitro (PGIV) (Theodorou et al., 1994). La producción de gas se midió con un transductor de presión Delta OHM DO 9704 (Delta OHM, Padova, Italia) en botellas de 100 ml. Se incubó 0.5 g de MS en ocho botellas (repeticiones) por tratamiento con sus respectivos blancos. La prueba se hizo por duplicado en 24 botellas para PG y 24 para digestibilidad in vitro. En cada botella se adicionaron 60 ml de inóculo ruminal (70:30 medio amortiguador: liquido ruminal respectivamente) bajo un flujo de CO2 constante.
El líquido ruminal fue colectado de dos toros adultos fistulados, con peso promedio de 380 kg, con una alimentación basada en una mezcla forrajera (70% gramíneas y 30% leguminosas) cortada y suministrada en comederos individuales para cada animal y acceso a agua a voluntad. El líquido ruminal fue colectado en las primeras horas del día, filtrado a través de cuatro capas de tela manta de cielo y colocado en termos a 39 °C para su transporte al laboratorio
Las botellas de gas fueron selladas e incubadas a 39-40 °C. La producción de gas se determinó con el transductor de presión a las 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36 y 48 h de incubación. Los parámetros de fermentación in vitro se estimaron mediante el ajuste del volumen de gas acumulado de cada botella, mediante la fórmula PGIV = B (1 - exp -r (t-lag)) (Krishnamoorthy et al., 1991), donde: PGIV = producción total de gas in vitro (0.5 g/g MS); B = producción asíntota de gas; r = porcentaje de producción de gas en un tiempo t; y lag = tiempo transcurrido antes del inicio de la fermentación de los carbohidratos estructurales.
Digestibilidad in vitro
La digestibilidad in vitro de la MS (DIVMS) y de la MO (DIVMO) se evaluó-transcurrido las 48 h de incubación. El sustrato residual se removió con agua destilada y se filtró en papel filtro (Camlab® 1171058 grado 601/ 5-13 µm retención de partícula). La MS residual se colocó en estufa a 105 °C hasta llegar a peso constante. La DIVMS se determinó por diferencia de peso entre la MS inicial y la MS residual. La MS residual fue colocada en una mufla a 450 °C durante 4.5 h para determinar el contenido de cenizas y poder calcular la MO residual. La DIVMO se calculó por diferencia de peso entre la MO inicial y la MO residual.
Degradación Ruminal in situ
Se utilizó la técnica de la bolsa de nylon en el rumen (Ørskov et al., 1980). En cada bolsa se colocaron 3 g de MS de cada tratamiento (cinco bolsas por tratamiento / repeticiones). Las bolsas se colocaron en el rumen de uno de los toros fistulados indicados anteriormente durante 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 72 y 96 h. Las bolsas fueron removidas luego de los respectivos periodos de incubación, lavadas con agua corriente y secadas a 60 °C. Las bolsas de 0 h no fueron colocadas en el rumen y solo fueron lavadas con agua corriente. La desaparición de la materia seca fue calculada como una proporción del material incubado y residual y los datos fueron ajustados a la ecuación: Y = A + B (1 - e-ct) (Ørskov y McDonald, 1979), donde A = fracción soluble; B = fracción insoluble pero potencialmente fermentable; c = tasa de degradación en un tiempo t. El cálculo de la degradación ruminal de la MS se estimó con el programa Graphpad Prism 6 (San Diego, USA).
Análisis Estadístico
Se utilizó un diseño completamente al azar bajo el modelo Yij = ì + Ti+ eij; donde Yij es la variable de respuesta perteneciente al jésimo elemento y al i-ésimo tratamiento, ì es la media general, T es efecto debido al iésimo tratamiento y eij es el error experimental asociado al j-ésimo elemento del i-ésimo tratamiento. Las tendencias lineales (L) o cúbicas (C) para cada variable en los tratamientos fueron analizadas mediante polinomios ortogonales con el modelo t Cj= S Cij Ti i=1; donde C es el contraste, Cij es el coeficiente del tratamiento en el contraste j y Ti es el total del tratamiento i. Se utilizó el paquete estadístico SAS v. 9.2 (SAS Institute, USA) para determinar las variables de valor nutritivo, digestibilidad, parámetros de producción de gas y degradación in vitro y el análisis de polinomios ortogonales. Se empleó el análisis de varianza para cada variable y en los casos de diferencias estadísticas (p<0.05) se utilizó la prueba de Tukey para determinar diferencias entremedias. Las tendencias L y C en el análisis de polinomios ortogonales se consideraron diferentes si p<0.05.
RESULTADOS
El valor nutricional de los ensilajes de maíz se muestra en el Cuadro 1. El valor de pH fue significativamente mayor (p<0.0001) en T1 (4.1) y T2 (4.2) comparados con T0 (3.5). El valor de MO fue mayor en T0 y disminuyó significativamente en T1 y T2 (p=0.0007), mientras que el valor de las cenizas tuvo un comportamiento opuesto. El con- tenido de FND y FAD fue similar entre T1 y T2, pero menor a T0 (p=0.0022 y p=0.0004, respectivamente). Por otro lado, el contenido de MS y PC fue similar entre tratamientos. El contenido de MO, FND y FAD mostró una tendencia lineal decreciente con respecto al incremento de los niveles de Sc en los ensilajes.
La digestibilidad de la MS, MO y EM fue similar entre tratamientos (Cuadro 2). Sin embargo, la DIVMO y la EM mostraron una tendencia lineal decreciente a medida que los niveles de Sc (0, 10 y 20) se incrementaron.
Los parámetros de producción de gas in vitro de los ensilajes se muestran en el Cuadro 3. La menor producción de gas correspondió a T1 (118.75 ml gas/0.5 g-1 MSF). El porcentaje de producción de gas en el tiempo y la tasa de producción de gas disminuyó significativamente (p<0.0001) en los tratamientos enriquecidos con Sc. Por otro lado, la producción de total de gas mostró una tendencia cuadrática a medida que los niveles de la levadura fueron incluidos en los ensilajes.
Los parámetros de degradación ruminal in situ de los ensilajes se muestran en el Cuadro 4. La mayor cantidad de fracción soluble degradada (A) se evidenció en T2 (328.12 g/ kg-1 MS), mostrando además una tendencia lineal creciente con la adición de Sc. Similar comportamiento se observó para la fracción insoluble, pero potencialmente degradable (B), que fue significativamente menor en T2 (472.29 g/kg-1 MS). Por otro lado, la tasa de degradación y el potencial total de degradación fueron similares entre tratamientos.
Por otro lado, la degradación ruminal in situ (Figura 1) mostró en las primeras 12 horas pos-alimentación un mayor porcentaje de degradación de la MS total en T2 (328.12 g/kg MS), relacionado a un mayor contenido de carbohidratos solubles en este tratamiento (proteínas y carbohidratos solubles especialmente), y que consecuentemente afectaría a cambios en las concentraciones de los microorganismos ruminales y su capacidad de adhesión a este tipo de carbohidratos.
DISCUSIÓN
La adición de Sc en el ensilaje de maíz incrementó el pH, resultado similar encontrado en otras investigaciones (Mafakher et al., 2010). El pH se encuentra relacionado a la estabilidad aeróbica (Bensimon et al., 2015), capacidad buffer y buen proceso de conservación (Pippard et al., 1996). Por otro lado, el contenido de MS estuvo por debajo de valores reportados por otros autores (Hernández-Ortega et al., 2011; Aragadvay- Yungán et al., 2015). La MS es un nutriente importante por su relación directa con consumo voluntario, digestibilidad, granos y pro- porciones de fibra en el ensilaje (Martin et al., 2012).
Cuadro 1 Valor nutricional del ensilaje de maíz (EMz) enriquecido con tres niveles de Saccharomyces cerevisiae (Sc)
Cuadro 2 Digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) y de la materia orgánica (DIVMO), y energía metabolizable (EM) estimada del ensilaje de maíz (EMz), enriquecido con tres niveles de Saccharomyces cerevisiae (Sc)
El contenido de PC se encontró en rangos similares a los reportados en otros estudios (Ítavo et al., 2006). Sin embargo, los contenidos son bajos y pueden comprometer la disponibilidad de péptidos, aminoácidos libres y amoniaco que son fuentes de N para el crecimiento microbiano, el cual debería encontrase entre el 14 al 15% de la MS en la dieta.
Cuadro 3 Producción de gas in vitro (PGIV) por materia seca fermentable (MSF) del ensilaje de maíz (EMz), enriquecido con tres niveles de Saccharomyces cerevisiae (Sc)
Cuadro 4 Degradación ruminal in situ de la fracción soluble (A), fracción insoluble pero potencialmente fermentable (B), tasa de degradación en un tiempo t (c) y potencial total de degradación (A+B) del ensilaje de maíz (EMz) enriquecido con tres niveles de Saccharomyces cerevisiae (Sc)
Los contenidos de FDN y FDA disminuyeron significativamente en T1 y T2, lo que equivaldría a un aumento de polisacáridos solubles. Estos contenidos favorecen a la disponibilidad de sustratos para las bacterias, protozoos y hongos que comparten relaciones comunes de crecimiento y adhesión a las partículas del alimento en el rumen (Hoover y Stokes, 1991). La disminución del contenido de FDN con el incremento de Sc se debió posiblemente al favorecimiento de las levaduras al utilizar la hemicelulosa (o incrementar la disponibilidad de la pared celular al facilitar su destrucción para que las bacterias hagan su función de degradación). Esto se ve reflejado en T2 que incrementa la tasa de degradación de A (fracción soluble) y numéricamente disminuye la tasa de degradación; es decir, se incrementa el tiempo de retención de las partículas en el rumen. Esto podría favorecer el consumo de MS in vivo (Van Soest, 1994).
Los valores de DIVMS, DIVMO y EM fueron similares entre tratamientos. Estos valores pueden estar relacionados positivamente (Yan y Agnew 2004) con los valores de PC que tampoco mostraron diferencias. Al contrario, Niderkorn y Baumont (2009) indican que los bajos contenidos de EM en ensilajes de maíz-girasol se deben a una disminución de la digestibilidad.
La menor PGIV en T1 podría estar relacionada a la naturaleza del sustrato y que a su vez se asocia con el tipo de carbohidratos estructurales que la constituye (García- Rodriguez et al., 2005), lo que estaría en concordancia con el menor contenido de FDN y FDA mostrado en T1. Asimismo, la tasa de producción de gas (r, %/h) disminuyó al enriquecer el ensilado con Sc, sin afectar a la tasa de degradación de la MS (c, %/h). La tasa de degradación de la materia seca está directamente relacionada con la proporción de almidón, pectinas y azúcares (Hoover y Stokes, 1991).
Se encontró un mayor porcentaje de degradación de la MS total en T2 (328.12 g/ kg MS) (Figura 1). En este sentido, Hoover y Stokes (1991) mencionan que los primeros sustratos en degradarse corresponden a los azúcares, almidones y pectinas, dado su grado de solubilidad. Estos resultados son similares a los reportados por Popova et al. (2011) y Bissi et al. (2018).
La cantidad degradada de la fracción soluble (A) de la MS se comportó inversamente proporcional a la fracción insoluble pero potencialmente degradable (B), comportamiento similar a lo encontrado por Junior et al. (2017), y relacionado a la disponibilidad de carbohidratos solubles en las primeras horas de degradación en el rumen. Por otro lado, las diferencias en la degradación de fracción B entre tratamientos se relacionarían al incremento en el contenido de FDN.
