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INTRODUCCIÓN
En países de Sudamérica, la cría de llamas (Lama glama) y alpacas (Lama pacos) es una actividad altamente importante para miles de familias nativas que viven en los Altos Andes de Perú, Bolivia, Argentina y Chi- le. En las especies animales de producción, las pérdidas embrionarias ocurren durante los primeros 30-45 días de gestación. En el caso de las alpacas, la tasa de fertilización es moderadamente alta, donde se ha encontrado que el 70-80% de los cigotos recuperados tres días después del apareamiento estuvieron en proceso de división, pero solo 50% de los cigotos fertilizados sobrevivieron más de 30 días de gestación (Fernández-Baca et al., 1970). En otros estudios, se estimó que la mortalidad embrionaria temprana fue de 10- 15% de todas las preñeces en los primeros 60 días de gestación (Bravo et al., 1995), pero en extremas condiciones de subnutrición puede alcanzar hasta el 80% en los primeros 90 días de gestación (Alarcón et al., 1990). Estudios realizados por Leyva y García (1999) reportaron 12% de mortalidad embrionaria en los primeros 5 días posovulación, mientras que según Tibary et al. (2006), dependiendo de las regiones, pueden ocurrir abortos de origen infeccioso desde 10% a más del 70% de la población de hembras.
La progesterona (P4) tiene un rol clave en los eventos reproductivos asociados con el establecimiento y mantenimiento de la gestación. Estudios en bovinos (Carter et al., 2008) y en ovinos (Parr et al., 1987), demostraron que elevadas concentraciones de P4 en el periodo inmediato posterior a la concepción soporta el establecimiento de la gestación, estimula la elongación del conceptus, aumenta la producción de interferon-tau (IFN-τ) y, por lo tanto, resulta en mayores tasas de preñez.
En llamas y alpacas no preñadas, la función del cuerpo lúteo (CL) es finalizada por la liberación de prostaglandina F2α (PGF2α) desde el útero (Fredriksson et al., 1988). Por otro lado, oleadas repetidas de PGF2á han sido observadas desde el día 9 al 12 después del apareamiento, indicando una vida media del CL de 8 a 9 días en llamas (Aba et al., 1998). En hembras preñadas, una rápida disminución en la concentración de P4 plasmática ocurrió después del día 8 posterior al aparea- miento y todos los valores registrados después del día 10 fueron signficativamente más altos que aquellos registrados en el día 8 (Aba et al., 1997). Concomitantemente, esta disminución temporal en la concentración plasmática de P4 es coincidente con el momento estimado de reconocimiento materno de la gestación (Adams et al., 1991). Por lo tanto, esta insuficiente función luteal es probablemente una de las causas de pérdida de preñez (Vaughan y Tibary, 2006). Causas de pérdida embrionaria/fetal requieren evaluaciones críticas sobre la existencia e incidencia de la insuficiencia luteal en camélidos sudamericanos.
El efecto de la suplementación exógena con P4-larga acción (P4LA) administrada en el periodo temprano después del apareamiento natural sobre las tasas de gestación y mortalidad embrionaria/fetal no han sido estudiadas en llamas. La hipótesis de este trabajo fue que la suplementación con P4LA después del apareamiento natural aumenta las tasas de preñez o reducen la mortalidad embrionaria/fetal hasta el día 60 de gestación. Por lo tanto, el objetivo fue evaluar el efecto de la administración de P4LA dos días después de la ovulación sobre la concentración plasmática de P4, la tasa de preñez y las pérdidas gestacionales de llamas naturalmen- te apareadas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar de Estudio
El trabajo se realizó durante la temporada reproductiva (diciembre a marzo de 2020) de los camélidos sudamericanos en la Estación Experimental Abra Pampa del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), ubicada en la provincia de Jujuy (22º 49‘S, 65º 47´W), Argentina, a una altitud de 3484 m sobre el nivel del mar.
Todos los procedimientos experimentales fueron realizados teniendo en cuenta las normas éticas y de bienestar animal y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación (CICUAE, Protocolo CRS-J Nº 9/19) del INTA, establecido por el principio de las tres R: reducción del número de animales, refinamiento de la técnica y reemplazo de animales por otras técnicas.
Animales y Diseño Experimental
A un total de 115 llamas adultas sin cría y con peso promedio (±DE) de 105.3 ± 6.3 kg y condición corporal de 3.9 ± 0.7 (escala de 1 a 9) se realizó ultrasonografía ovárica (Honda HS101V, Japón), con transductor lineal de 5-MHz por un mismo operador (día - 2). Las hembras con presencia de un folículo ovárico >7 mm (n=92) fueron naturalmente apareadas (servicio individual controlado) con machos de probada fertilidad y tratadas con 100 µg de un análogo de GnRH (gonadorelina, IM, Gonasyn GDR®, Zoetis, Argentina) para asegurar la ovulación. En el día 0, se realizó el examen ultrasonográfico para confirmar la ocurrencia de la ovulación, evidenciada por la desaparición del folículo >7 mm observado en el primer examen.
En el día 2, las hembras que ovularon (n=73) fueron asignadas aleatoriamente a tres tratamientos: 1) Grupo P4LA50 (n=32): 50 mg IM de P4LA (MAD4®, Allignani Hnos, Argentina); 2) Grupo P4LA100 (n=29): 100 mg IM de P4LA (n=22); y Grupo Control (n=31): 5 ml de solución de ClNa 0.9%. Al día 7, se realizó ultrasonografía para confirmar la ovulación por medio de la presencia de un cuerpo lúteo. El diagnóstico de preñez se realizó mediante ultrasonografía a los 30 y 60 días después del apareamiento para evaluar la pérdida embrionaria/fetal durante dicho periodo. En el caso de las llamas preña- das al día 30, pero no al día 60, se les consideró que habían tenido pérdida embrionaria/ fetal.
Determinaciones Hormonales
Muestras de sangre fueron colectadas por punción de la vena yugular en tubos de vidrio heparinizados (Fada Pharma, Argenti- na) en los días 0, 3, 7, 10 y 14 después de la ovulación para determinar la concentración de P4 plasmática. Las muestras fueron inmediatamente centrifugadas a 1500 g por 20 min y el plasma fue almacenado a -20 ºC. Las concentraciones de P4 fueron determinadas por la técnica de quimioluminiscencia de micropartículas (CMIA) utilizando un kit comercial (Architect Progesterone 7K77, Abbott, Irlanda). Todas las muestras fueron procesadas por duplicado en un único ensayo. El coeficiente de variación intra-ensayo fue <7.2% para concentraciones comprendidas entre 0.1 y 40.0 ng/ml, el cual estuvo dentro de los rangos convencionales informados por el fabricante.
Análisis Estadístico
El análisis de los datos fue realizado utilizando el software SAS. Los diámetros foliculares al momento del apareamiento (Día -2) fueron comparados entre grupos por análisis de varianza seguido por el test de Tukey. El análisis de las concentraciones de P4 fue realizado por análisis de varianza para mediciones repetidas (Proc Mixed) con el grupo de tratamiento como variable, para determinar diferencias de concentraciones entre grupos dentro de los días 0 (día de ovulación), 3, 7, 10 y 14 después de la ovulación y entre días dentro de un mismo grupo. La hembra dentro de tratamiento fue incluida en el modelo como efecto aleatorio. Las concentraciones de P4 fueron solo analizadas en hembras que fueron diagnosticadas como preñadas al día 30, y de esta forma, asegurar que todas las hembras tuvieron un CL funcional hasta el día 14. Las proporciones fueron comparadas entre grupos por el test de Chi cuadrado. Probabilidades <5% (p<0.05) fueron consideradas estadísticamente significativas.
RESULTADOS
En el día -2, 92 llamas con un folículo ovárico >7 mm de diámetro fueron sexualmente receptivas y exitosamente apareadas. No hubo diferencias significativas (p=0.66) en el diámetro folicular al momento del apareamiento entre grupos (Cuadro 1). En el día 0 (día de ovulación), 73 (79.3%) llamas habían ovulado, por lo tanto, las hembras que no ovularon (n=19) fueron excluidas del estudio. No se observaron diferencias (p=0.85) en las tasas de ovulación entre grupos y todas las hembras que ovularon desarrollaron un CL observado por medio de ultrasonografía al día 7. Las tasas de preñez fueron similares entre grupos, tanto al día 30 (p=0.20) como al día 60 (p=0.28; Cuadro 1). Las tasas de mortalidad embrionaria/fetal determinadas entre el día 30 y 60 de gestación no fueron significativamente diferentes (p=0.86) entre grupos de tratamientos (Cuadro 1).
Cuadro 1 Número (%) de llamas preñadas en los días 30 y 60 de del apareamiento natural tratadas con 50 o 100 mg de progesterona-larga acción (P4LA) dos días después de la ovulación
Cuadro 2 Concentración plasmática de progesterona (ng/ml; media ± EEM) para llamas apareadas y tratadas con progesterona-larga acción (P4LA)
Las concentraciones de P4 plasmática se presentan en el Cuadro 2. Se observó una mayor concentración de P4 (p<0.05) en el día 3 en las llamas que recibieron P4LA (50 y 100 mg) comparado con las del grupo Control, en tanto que solo la concentración de P4 en llamas del grupo LAP4100 fue más alta en el día 7 que las observadas en los otros dos grupos. Por otro lado, no se detectaron diferencias significativas (p>0.05) entre grupos en los días 10 y 14 posmonta.
Se observó una evolución similar de la P4 plasmática para los grupos P4LA50 y P4LA100, siendo similares en los días 7, 10 y 14 en ambos grupos. En el grupo Control, las concentraciones de P4 fueron similares en los días 7 y 10, pero significativamente más alta (p<0.05) en el día 14.
DISCUSIÓN
Varios informes han documentado la eficacia del tratamiento con P4 para sincronizar la emergencia de la onda folicular en llamas (Chaves et al., 2002; Aller et al., 2015; Veiga et al., 2018); sin embargo, no se ha encontrado literatura disponible sobre el efecto de la suplementación con P4-larga acción en estadios tempranos después del apareamiento sobre la tasa de preñez o sobre la mortalidad embrionaria/fetal en llamas.
Se ha demostrado que las concentraciones elevadas de P4 en los estadios tempranos después del servicio favorecen los cambios temporales que ocurren en el transcriptoma del endometrio (Forde et al., 2011) y que la consecuencia es una mayor velocidad en la elongación del conceptus asociado con una mayor sobrevivencia embrionaria (Carter et al., 2008) y una correlación positiva con la secresión del INF-τ en bovinos (Kerbler et al., 1997) y en ovinos (Satterfield et al., 2006). Estudios más recientes sugirieron que, a pesar de los efectos positivos de la administración de P4 sobre el desarrollo del conceptus, este puede no traducirse en una mayor sobrevivencia embrionaria (Beltman et al. 2009), posible- mente debido a su potencial efecto negativo sobre la síntesis y liberación de P4 del cuerpo lúteo (O´Hara et al., 2014) y, en última instancia, llevando a la luteólisis y pérdida embrionaria (Garrett et al., 1988). Este efecto negativo no fue observado en el presente estudio en llamas, dado que las tasas de gestación fueron estadísticamente similares en las llamas tratadas con P4LA y el grupo Control en los días 30 y 60 de gestación, aunque se observó un porcentaje de preñez numérica- mente superior (no significativo) en los grupos tratados comparado con el obtenido en el grupo Control.
En llamas, Palomino et al. (2006) reportaron que la administración de 15 mg de proligestona en los días 6 y 7 después del apareamiento no aumentaron la tasa de preñez observada en el día 35 de gestación comparado a hembras que recibieron placebo; sin embargo, la sobrevivencia embrionaria fue más alta en llamas que recibieron 0.2 mg/día de benzoato de estradiol comparado a la ad- ministración de proligestona. En el camello dromedario ha sido demostrado que en el periodo temprano de gestación (día 10), el embrión exhibe una alta actividad de síntesis de grandes cantidades de estradiol que podrían prevenir la luteólisis (Skidmore et al., 1994).
Otros tratamientos han sido utilizados con el objetivo de aumentar la concentración periférica de P4 y la tasa de preñez. Skidmore et al. (2002) administraron diariamente 150 mg IM de progesterona oleosa desde el día anterior a la transferencia de embriones hasta el día 25 en camellas receptoras sin observar diferencias significativas en la tasa de preñez entre las hembras tratadas con P4 (44.0%) y las hembras no tratadas (67.0%). Por otro lado, Abalos et al. (2018) observaron que en llamas tratadas con GnRH al día 7 después del apareamiento natural se desarrolló un nuevo cuerpo lúteo producto de la ovulación de un folículo dominante presente en ese día; sin embargo, ni la concentración de P4 ni la tasa de preñez fueron afectadas por el cuerpo lúteo acccesorio.
En el presente trabajo, las tasas de mortalidad embrionaria/fetal no fueron diferentes entre llamas tratadas y no tratadas con P4LA en el periodo evaluado; sin embargo, Abalos et al. (2018) no observaron mortalidad en el periodo considerado, diferencia que podría ser explicada por la baja condición corporal de las llamas utilizadas en el presen- te estudio.
La caída temporal de la concentración de P4 plasmática ha sido observada el día 8 pos-ovulación con recuperación después del día 10 en hembras preñadas (Adams et al., 1991). En el presente estudio, la concentración plasmática de P4 periférica en llamas tratadas con 100 mg de P4LA fue diferente a las concentraciones determinadas en las llamas no tratadas y tratadas con 50 mg de P4LA en los días 3 y 7 después de la ovulación; sin embargo, no se observaron diferencias en las concentraciones de P4 en los días 10 y 14 entre llamas tratadas y no tratadas. En consecuencia, es posible que las concentraciones de P4 no fueron elevadas un tiempo suficiente después del apareamiento natural para tener un mayor efecto sobre la función uterina y la interacción maternaembrionaria. Las concentraciones de P4 de- terminadas en el presente estudio en los días 3, 7, 10 y 14 después de la ovulación en llamas no tratadas, son concordantes con aquellas concentraciones determinadas en estudios previos en llamas (Adams et al., 1991; Abalos et al., 2018).
