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INTRODUCCIÓN
El éxito de las herramientas de biotecnología reproductiva como la transferencia de embriones depende en parte de la calidad de los ovocitos y de la reserva ovárica (RO) que puedan tener las hembras donantes (Burns et al., 2005; Ireland et al., 2007, 2011; Pontes et al., 2011). Durante la vida fetal, las células somáticas rodean a las células germinales del ovario y forman los folículos primordiales. Este grupo de folículos serán los que acompañen a la hembra durante toda su vida reproductiva (Erickson, 1969). Al nacer, la hembra bovina cuenta con un rango entre 10 000 a 350 000 folículos, pero esta RO va decreciendo progresivamente y al llegar a la pubertad (12 meses) contaría con 1920 a 40 960 folículos (Ireland et al., 2008). Estos folículos primor- diales serán los que darán lugar a la población de folículos en crecimiento (Scaramuzzi et al., 2011).
Se ha determinado que un buen predictor de la RO es el Conteo de Folículos Antrales (CFA) mediante ultrasonido en la fase folicular temprana (Alvarez et al., 2000). Sin embargo, hay marcadores fisiológicos que pueden predecir la RO en cualquier momento del ciclo estral, como es el caso de la hormona Anti-Mülleriana (AMH), la cual refleja el número de folículos que han hecho la transición de folículo primordial a folículo en crecimiento y que además es independiente del control gonadotrófico (Visser et al., 2006). En las hembras, la AMH se expresa en forma exclusiva en las gónadas y se produce a partir del nacimiento (Durlinger et al., 2002) dentro de las células de la granulosa de los folículos antrales en crecimiento y se reduce durante el crecimiento folicular terminal (Rico et al., 2011; Monniaux et al., 2012). Adicionalmente, la AMH ha demostrado ser un modulador del crecimiento folicular temprano, que actúa como un factor para prevenir el agotamiento prematuro de la RO (Durlinger et al., 2002). Esta última característica fisiológica es la que se ha propuesto como principal marcador biológico de la RO en comparación con otras hormonas (Monniaux et al., 2012). Asimismo, las concentraciones circulantes de AMH han sido asociadas positivamente con la RO en ganado taurino e índico (Batista et al., 2014).
Diversos estudios han estudiado marcadores fisiológicos que puedan predecir la RO en bovinos de varias razas (Batista et al., 2014; Ribeiro et al., 2014), pero no han incluido a hembras Brahman y Blanco Orejinegro criadas bajo las condiciones de Colombia. Ante esto, el objetivo del estudio fue comparar los niveles de la hormona anti- Mülleriana de hembras Brahman y Blanco Orejinegro donadoras de ovocitos y establecer su relación con la reserva ovárica y producción de embriones in vitro en condiciones del trópico bajo colombiano.
MATERIALES Y MÉTODOS
Localización y Animales
El presente estudio se desarrolló en la central de reproducción y genética EMBRIOVET SAS ubicada en la Hacienda «La Marina», en el municipio de San Martin, Meta, Colombia. La zona se encuentra a una altitud de 372 msnm, presenta una temperatura anual promedio de 26.9 ± 3.0 °C y una precipitación pluviométrica anual de 2832 mm. Se utilizaron 80 vacas, 38 Blanco Orejinegro (BON) (Bos taurus) y 42 Brahman (Bos indicus). Todas las vacas se encontraron en etapa reproductiva, en buen estado de salud y eran mantenidas en pastoreo rotacional con pasturas de Brachiaria dictyoneura y Brachiaria humidicola, sal mineralizada y agua a voluntad. Todas las hembras contaban con registro de Asocebú y Asocriollanos. Al momento de los procedimientos experimentales tenían más de 90 días de posparto, evaluación reproductiva normal, no gestantes, y sin patologías ováricas.
Hormona anti-Mülleriana (AMH)
Se tomaron muestras de sangre (4 ml) mediante venopunción coccígea en tubos con EDTA como anticoagulante. El suero se obtuvo mediante centrifugación y se mantuvo congelado a -80 °C, hasta su uso en el laboratorio. La muestra de sangre se colectó previo a la punción ovárica guiada por ultrasonido (OPU). La concentración de AMH se determinó utilizando un kit comercial de ELISA (Bovine AMH ELISA AL-114; Ansh Labs, USA), kit con sensibilidad de 0.1 ng/ml y límite de detección de <0.078 ng/ml. La lectura se hizo en un lector de microplacas (Bio- Tek EON; Biotek Instruments, USA). El análisis hormonal se realizó en el Laboratorio de Reproducción y Genética de la Universidad de los Llanos, Villavicencio, Colombia.
Ultrasonografía y OPU
La OPU se realizó sin previa sincronización de la onda folicular. Previo a la OPU se hizo el recuento de los folículos antrales mayores de 2 mm en ambos ovarios utilizando un el ecógrafo Mindray DP-50 Vet (Mindray Bio-Medical Electronics, China) con una sonda transrectal convexa de 5 MHz. Las vacas donantes se clasificaron de acuerdo con el valor de CFA y el nivel de AMH en tres grupos: alto, intermedio y bajo.
Las donantes fueron sujetadas en un brete y se les aplicó anestesia epidural (2% de lidocaína, 5 ml) para facilitar el manejo de los ovarios a través del recto. Se limpió y desinfectó la zona perianal con alcohol etílico al 70%. Se aspiraron todos los folículos visibles por medio de una aguja de aspiración (20 G; Terumo Europe, Bélgica) instalada dentro de la sonda transvaginal y conectada al sistema de vacío (85-90 mmHg de presión de vacío negativo (K-MAR 5000 Cook Medical, Australia). El líquido folicular fue conducido mediante un circuito de manguera con diámetro interno de 1.1 mm y 120 cm de largo (Watanabe Tecnología Aplicada, Brasil) conectado directamente a un tubo cónico de 50 ml que contenía 15 ml de solución salina fosfato tampón Dulbecco DPBS (Sigma) y 5000 IU/ml heparina sódica, mantenido a 37 °C.
Clasificación de Complejos Cumulus Ovocitos (COCs)
Los ovocitos fueron clasificados según la apariencia de las células del cumulus oophorus y del ovoplasma, observados bajo estereoscopio, según protocolo de Leibfried y First (1979): Categoría 1. Mínimo tres capas compactas y homogéneas del cumulus que lo rodean completamente, con ovoplasma granulado que llena la totalidad del ovocito bordeando la zona pelúcida; Categoría 2. Tres capas del cumulus rodean el ovocito parcialmente, con ovoplasma heterogéneo granulado dejando ver zonas claras y oscuras; Categoría 3. Las células de cumulus están expandidas, el ovoplasma no llena en su totalidad el ovocito, el cual se presenta fragmentado y con presencia de vacuolas; Categoría 4: ovocitos desnudos. Los ovocitos tipo 1 y 2 se seleccionaron para maduración in vitro y fecundación in vitro.
Maduración, Fertilización in vitro y Cultivo de Embriones
Los ovocitos y embriones se cultivaron en todos los procesos de manera individual para cada donante y se llevaron a los procesos de maduración in vitro, fertilización in vitro y cultivo de embriones in vitro de acuerdo con los protocolos del laboratorio comercial con medios de cultivo (Vitrogen, Brasil) para cada etapa del proceso. El semen para la fertilización se utilizó de acuerdo con los requerimientos de los clientes de la central genética EMBRIOVET.
Grupos de 10 COCs seleccionados fue- ron madurados en 100 µl en medio MIV, cubierto con aceite mineral a 39 ºC en una atmosfera humidificada con 5% de CO2 por 24 h. Luego de la maduración in vitro, los COCs fueron lavados y transferidos a 100 µl de medio FIV cubierto con aceite mineral. Se utilizó semen convencional congelado de toros con fertilidad probada, descongelados a 35 ºC por 30 s y seleccionados por centrifugación (2 min x 7000 rpm) sobre gradientes de Percoll discontinuos (45 y 90%).
El pellet fue reconstituido en 1000 µl del medio FIV y nuevamente centrifugado (45 s x 3000 rpm). El pellet fue diluido con medio FIV a una concentración de 2 x 106 espermatozoides/ml y 5 µl de esta dilución fue adicionada a las gotas de fertilización. Los gametos se coincubaron durante 21 h a 39 ºC en atmosfera humidificada con 5% de CO2, los presuntos cigotos fueron lavados en medio CIV, desnudándolos por pipeteo suave y distribuyéndolos aleatoriamente (10 por gota de 100 µl de medio CIV). Los cigotos se incubaron a 39 ºC en atmosfera humidificada con 5% de CO2. Durante los días 3 y 6 de cultivo, el 50% del medio CIV fue cambiado por medio fresco. En el día 7 se registró la producción de blastocistos. Los embriones fueron clasificados por grados, bajo microscopio estereoscopio, de acuerdo con la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (IETS) (Wright, 1998).
Análisis Estadístico
Los datos fueron sometidos a estadística descriptiva y expresada como media ± error estándar de la media (SEM), a excepción de la correlación de Pearson. Se utilizó el análisis de varianza seguido de la prueba de Kruskall-Wallis (p<0.001) para determinar diferencias para las variables concentración de AMH, número de folículos y número de blastocistos. Todos los valores fueron probados para la distribución normal, utilizando la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Los datos fueron analizados con el software Epidat 4.1.
RESULTADOS
La media de las concentraciones séricas de AMH de las vacas Brahman fue de 0.78 ± 0.34 ng/ml (0.09-1.89 ng/ml), en tanto que en las vacas Blanco Orejinegro fue de 0.72 ± 0.32 ng/ml (0.13-1.19 ng/ml). Los valores según los niveles de AMH baja, intermedia y alta se presentan en el Cuadro 1. 1; asimismo, se presentan los rangos de valores para las tres categorías para cada una de las razas. Por otro lado, los resultados evidenciaron que el total de folículos en vacas con AMH alta fue significativamente superior (p<0.001) en ambas razas en comparación con los folículos detectados en vacas con AMH intermedia o baja. Asimismo, el número de folículos en las vacas Brahman fue significativamente mayor al detectado en hembras Blanco Orejinegro (Cuadro 2).
Cuadro 1. Niveles de concentración sérica de la hormona anti-Mülleriana (AMH) en vacas Brahman (n=42) y Blanco Orejinegro (n=38)
Cuadro 2 Número de folículos encontrados por ultrasonografía en vacas Brahman (n=42) y Blanco Orejinegro (n=38) con tres niveles de hormona anti-Mülleriana (AMH)
La correlación de Pearson demostró una correlación altamente significativa entre la concentración de AMH y el número de folículos en las vacas Brahman (r=0.76, p<0.001) y una correlación significativa, aunque menor con el número de blastocistos (r=0.55, p<0.001) (Figura 1).En el caso de las vacas Blanco Orejinegro, la correlación entre la concentración de AMH y el número de folículos fue similar a la observada en vacas Brahman (r=0.74, p<0.001), pero la correlación fue mayor con el número de blastocistos (r=0.66, p<0.001) (Figura 2).
DISCUSIÓN
El número de folículos antrales es una característica importante, ya que es un indicador del potencial de producción de embriones in vitro en una hembra donante. En este estudio se encontró una correlación alta entre el número de folículos y las concentraciones de AMH en ambas razas, así como un mayor número de folículos antrales ováricos en vacas Brahman que en Blanco Orejinegro, diferencia similar a reportes de otros estudios con diferentes grupos genéticos (Álvarez et al., 2000; Guerreiro y Batista, 2014).
Figura 1 Relación entre las concentraciones de hormona anti-Mülleriana (AMH) de vacas hembras Brahman con el número de folículos antrales detectados (figura superior) y con el número de blastocistos desarrollados después la fertilización in vitro
Se tienen reportes de mediciones de las concentraciones de AMH circulante en varias razas bovinas y en algunas otras especies de interés zootécnico. Así, Maculan et al. (2018) reportan valores promedio de 1.60 ng/ml (0.014-4.516 ng/ml) en vacas Tabapua (Bos indicus) y una correlación positiva entre la concentración de AMH circulante y el número de folículos antrales observados. Las correlaciones encontradas en el presente estudio corroboran esta relación entre la RO y las concentraciones de AMH. Por otro lado, los mayores niveles de AMH en Bos indicus con relación al Bos taurus encontrados en el presente estudio es similar al estudio de Baldrighi et al. (2014) quienes compararon las concentraciones de AMH del Gyr (0.60 ± 0.09 ng/ml) con las del Holstein (0.24 ± 0.08 ng/ml.
Los resultados de este trabajo brindan evidencia de la existencia de una correlación positiva entre la concentración sérica de AMH y el número de folículos antrales en hembras bovinas donantes de ovocitos de la raza Brahman y Blanco Orejinegro. Los resulta- dos sugieren que la AMH podría ser un posible marcador fisiológico en estas razas para predecir el número relativo de folículos que contribuyan al momento de seleccionar hembras bovinas para su empleo en biotecnologías reproductivas como la aspiración folicular y la producción de embriones in vitro, tal como ha sido observado por Ireland et al. (2008). De manera general, los resultados de este estudio coinciden con los reportados en la literatura para otras razas de bovinos y bufalinos que han demostrado la relación di- recta de la hormona AMH con la FSH, de tal manera que la AMH afecta el desarrollo de la dinámica folicular, evidenciándose una correlación positiva entre el conteo de folículos antrales y la concentración en la sangre (Maculan et al., 2018; Ramírez, 2019).
hembras Blanco Orejinegro con el número de folículos antrales detectados (figura superior) y con el número de blastocistos desarrollados después la fertilización in vitro
La correlación positiva entre las concentraciones sanguíneas de AMH y el número de embriones (blastocistos) en las va- cas donantes de las dos razas en el presente estudio coincide con lo observado por Monniaux et al. (2010). La asignación de las vacas donantes a los tres grupos según la concentración de AMH puso en evidencia que las vacas con concentraciones séricas de AMH mayores a 0.10 ng/ml produjeron mayor cantidad de embriones transferibles que las vacas con valores menores a 0.01 ng/ml de AMH. Asimismo, Batista et al. (2014) encontraron una correlación positiva similar en terneras Nelore donantes con un coeficiente de correlación (r=0.62) muy semejan- te al que presentaron las donantes Blanco Orejinegro en este trabajo.
Los resultados del presente estudio y los hallados en la literatura científica sobre la concentración de AMH en sangre son consistentes en cuanto a su posible función como indicador de reserva ovárica. Adicionalmente, las concentraciones de AMH permanecen constantes a través de todas las fases del ciclo estral y no parece que sean afectadas por los protocolos de sincronización hormonal (Guerreiro et al., 2014; Pfeiffer y Jury, 2014). La determinación de los valores de AMH es una ventaja que podría aprovechar- se para el desarrollo y optimización de protocolos destinados a una mayor obtención de ovocitos por aspiración.
CONCLUSIONES
Se logró establecer la relación entre los niveles de la hormona anti-Muelleriana (AMH) y algunos parámetros de calidad en hembras donadoras de ovocitos de las razas Brahman y Blanco Orejinegro.
La AMH podría ser un marcador endocrino satisfactorio de reserva ovárica tanto en bovinos Brahman y Blanco Orejinegro.
