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INTRODUCCIÓN
Los Columbidos son una familia que consta de más de 300 especies de palomas que se encuentran globalmente distribuidas (Gill, 2022). Si bien la cría de palomas para deportes, como mensajeras, para ornato o para el consumo de su carne es una práctica habitual en varios países del mundo, aún no se conoce a cabalidad la epidemiología y el curso de las enfermedades que afectan a estas aves (Zhao et al., 2011). Tanto las palomas silvestres como las domésticas podrían considerarse hospedadores virales, lo que posiblemente permita la evolución y la recombinación, conduciendo al desarrollo de nuevas variantes virales con diversos niveles de patogenicidad (Felippe et al., 2010).
Se estima que más del 60% de las enfermedades emergentes se originan en la vida silvestre (Bengis et al., 2004; Chomel et al., 2007; Cutler et al., 2010; Mackenzi y Jeggo, 2013). Se reconoce que las aves son reservorios frecuentes de virus que preocupan a los seres humanos; en particular la influenza A, lo que facilita el reordenamiento de los segmentos del genoma y los cambios en el tropismo y la eficiencia de transmisión (Alexander et al., 2000; Capua y Alexander, 2010; Amendola et al., 2011; Rumschlag et al., 2013). Las palomas son reservorios naturales de patógenos que han causado enfermedades emergentes y reemergentes en los seres humanos (Magnino et al., 2009).
Los Dicistrovirus son una familia de virus sin envoltura con un genoma de ssRNA lineal de aproximadamente 7-10 kb. Son virus dicistrónicos similares a los picornaviridae. El genoma contiene dos marcos abiertos de lectura (ORF1 y ORF2) que están separados por un sitio interno de entrada de ribosoma (IRES) de la Región Intergénica (IGR) (Jan, 2006). El ORF-1 codifica las proteínas no estructurales: helicasa, proteasa y polimerasa. La traducción del ORF-2 codifica las proteínas estructurales de la cápside. La replicación ocurre en el citoplasma de la célula infectada (Nakashima y Uchiumi, 2009; Valles et al., 2017).
Según el Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV), los Discistrovirus comprenden tres géneros: Triatovirus, Aparavirus y Cripavirus (Valles et al., 2017). Los Dicistrovirus infectan huéspedes artrópodos, algunos de ellos afectan a las abejas (virus de la parálisis aguda de las abejas - ABPV, virus de la parálisis aguda israelí - IAPV) y a los camarones (virus del síndrome de Taura) (Hasson et al., 1995; Cox- Foster et al., 2007; Bonning y Miller, 2010; Guo et al., 2013). Además, algunos son patógenos para insectos considerados plagas de importancia agrícola o médica, lo que los convierte en bioplaguicidas con un potencial uso en esas áreas (Bonning y Miller, 2010).
Los virus de abejas de mayor prevalencia a nivel mundial son el Virus de las Alas Deformadas (DWV) y el Virus de la Cría Ensacada (SBV) (Remnant et al., 2017), mientras que los más prevalentes en Argentina son el DWV, IAPV y SBV (Molineri et al., 2017), habiéndose registrado en abejas melíferas y en otros grupos de polinizadores y no polinizadores en el país (Susevich et al., 2019).
La transmisión de los Dicistrovirus puede ocurrir en forma horizontal, a través de partículas virales presentes en las heces de artrópodos infectados (Gomariz-Zilber y Thomas-Orillard, 1993) o vía transmisión mediada por plantas (Wamonje et al., 2017) y en forma vertical por transmisión transovárica o transovum (Reinganum et al., 1970; D’arcy et al., 1981; Hatfill et al., 1990). Además, también pueden transmitirse a través de vectores como el ácaro Varroa destructor (Rosenkranz et al., 2010).
En las últimas dos décadas, debido principalmente al advenimiento de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (HTS), se han caracterizado numerosos Dicistrovirus que aún no se han podido ubicar taxonómicamente. Algunos han sido identificados en insectos (Feng et al., 2017; Wamonje et al., 2017; Roberts et al., 2018; Nakasu et al., 2019; Runckel et al., 2019), otros en heces de mamíferos, aunque el problema parece estar relacionado con sus hábitos alimentarios (Li et al., 2010; Krumbholz et al., 2017; Zhang et al., 2017; Duraisamy et al., 2018). También se han descrito Dicistrovirus asociados a la sangre, tanto en murciélagos como en humanos (Phan et al., 2015; Bennett et al., 2019; Cordey et al., 2019). Con metagenómica se ha logrado caracterizar virus conocidos y nuevos del tracto entérico de pavos (Day et al., 2010), en el guano de murciélagos insectívoros (Reuter et al., 2014; Li et al., 2010), así como en roedores (Phan et al., 2011), palomas (Phan et al., 2013) y patos (Fawaz et al., 2016).
Según el conocimiento actual, no hay datos que indiquen una clara correlación entre la infección por Dicistrovirus de palomas y su estado de salud, así como determinar si estos virus son específicos de las palomas o son los que afectan a la comunidad de polinizadores. Es por ello que el objetivo de este estudio fue reportar por primera vez en Argentina sobre los Dicistrovirus que se encuentran en el tracto digestivo / excretor de palomas y, además, alertar sobre la posible transmisión de virus enteropatógenos de palomas a insectos de la comunidad.
MATERIALES Y MÉTODOS
Declaración de Ética
El permiso para capturar palomas para el muestreo fue otorgado por la Dirección de Flora y Fauna de la provincia de Buenos Aires (Argentina); con el aval del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL).
Muestreo
Se capturaron 25 palomas (24 ejemplares de Columba livia y una de Zenaida auriculata) en La Plata (Terminal de Ómnibus La Plata), Buenos Aires entre mayo y junio de 2019. La captura se realizó con jaula trampa cebada con granos. Se realizó la contención manual para la toma de muestras y las aves fueron liberadas en forma inmediata a la toma de la muestra (Figura 1).
Las muestras de orofaringe/coana y cloaca se colectaron con un único hisopo, y colocadas en tubos secos para su transporte inmediato al laboratorio. Cada hisopo correspondía a un ejemplar adulto. En el laboratorio se añadió 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a cada tubo, y se homogenizaron para realizar la extracción de ARN. Después de la homogeneización, las muestras se centrifugaron durante 15 min a 500 ×g para aclarar. Una segunda centrifugación se llevó a cabo a 5000 ×g durante 30 min.
Extracción de ARN
Se agregó 500 µl de reactivo Trizol® (Invitrogen, USA) a 500 µl del material obtenido en el paso anterior. La mezcla se extrajo con 220 µl de cloroformo, se agitó y se centrifugó a 12 000 x g durante 10 min. El ARN contenido en la solución acuosa se precipitó mediante la adición de un volumen igual de isopropanol. El ARN precipitado se recogió por centrifugación a 12 000 x g durante 10 min, se lavó con etanol al 70% y el pellet fue resuspendido en 20 µl de agua libre de RNasas.
RT-PCR Multiplex
Se utilizaron 5 µl del ARN total para la síntesis de ADN complementario (ADNc). La reacción fue llevada a cabo utilizando la enzima Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV; Promega) en las condiciones especificadas por el proveedor. La reacción de PCR se hizo de acuerdo con la metodología descrita por Sguazza et al. (2013) utilizando una PCR múltiple (mPCR) como metodología de screening en un volumen final de 25 µl. Esta PCR múltiple amplifica seis virus: SBV, DWV (Iflaviridae), Virus de las Celdas Reales Negras - BQCV, ABPV e IAPV (Dicistroviridae) y CBPV (Virus de la Parálisis Crónica de las Abejas; aún sin clasificar). Como control positivo se utilizó una muestra previamente aislada y caracterizada en el Laboratorio de Virología como IAPV. La presencia de IAPV se confirmó luego del screening utilizando los cebadores específicos propuestos por Reynaldi et al. (2011) para una PCR simple, que amplifican 185 pb. Luego de la amplificación las muestras se corrieron en un gel de agarosa al 2.5% durante 40 min a 100 V que fue inmediatamente teñido con bromuro de etidio y observado bajo luz UV.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
De las muestras analizadas, 15 (60%) fueron positivas a IAPV tanto en la PCR múltiple como en la PCR específica, en la cual se evidenciaron amplicones de 185 pb específicos de acuerdo con Reynaldi et al. (2011).
Se han identificado Dicistrovirus en las heces de mamíferos, incluidos murciélagos insectívoros y humanos, pero el viroma fecal incluye virus asociados a alimentos que simplemente pueden haber pasado a través del intestino (Kapoor et al., 2010; Li et al., 2010; Reuter et al., 2014). Los virus de plantas o insectos detectados en las heces se deben mayormente a exposiciones dietéticas, pero puede no indicar una infección replicativa (Balique et al., 2015). Existe la posibilidad que algunos Dicistrovirus que circulan en la sangre de murciélagos frugívoros hayan pasado del sistema gastrointestinal al circulatorio a través de microabrasiones durante la masticación y la deglución de alimentos de materiales ásperos, de manera tal que la transmisión ocasional entre artrópodos y murciélagos en condiciones ecológicamente favorables podría explicar la esporádica aparición de tales virus «asociados a murciélagos» (Bennett et al., 2019), por lo que es posible que esto pueda estar ocurriendo con las palomas.
Las palomas pueden ser un reservorio de varios patógenos, a menudo con un curso subclínico o atípico de la enfermedad, lo que les permite propagarse entre individuos, brindando una oportunidad para pasajes y mutaciones (£ukaszuk y Stenzel, 2020). Se plantea la posibilidad de que la transmisión de virus de invertebrados entre especies de aves, murciélagos y otros mamíferos puede ocurrir con más regularidad de lo que se ha descrito, y que los artrópodos pueden albergar muchos virus «asociados a otros animales». Es así que para poder hablar de virus asociados a palomas, se deberían incluir muestras de invertebrados que estén ecológicamente asociados con estas aves (o incluso mamíferos) y que puedan albergar virus capaces de infectar a las palomas. Es por ello que se requieren estudios adicionales para determinar si son los mismos virus los que afectan a abejas y otros polinizadores y no polinizadores, los hallados en palomas.
