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INTRODUCCIÓN
El uso inadecuado de antimicrobianos en el sector humano y animal vienen afectando seriamente el control de las infecciones bacterianas, considerándose actualmente como un problema de gran importancia para la salud pública (McEwen y Collignon, 2018; Pachay-Solórzano, 2018).
Una gran cantidad de antimicrobianos se ha empleado en dosis sub-terapéuticas como promotores de crecimiento, así como para la profilaxis o tratamiento de infecciones en animales de producción, lo cual ha incrementado la aparición de bacterias resistentes a dichos fármacos. Así mismo, en muchos casos no se observa el adecuado tiempo de retiro de los antimicrobianos aplicados a los animales, lo cual deriva en la generación de residuos en alimentos de origen animal (Camou et al., 2017).
Se requiere implementar acciones para disminuir el problema de la resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos, incluyendo la regulación y vigilancia del uso y administración de estos fármacos en el sector agropecuario, así como el desarrollo de tratamientos alternativos frente a este tipo de patógenos (McEwen y Collignon, 2018). En este sentido se han propuesto diversas alternativas, destacando de entre ellas el uso de plantas medicinales y sus extractos para tratar enfermedades metabólicas, neurodegenerativas e infecciosas (Lundstrom, 2016).
En México existe una gran diversidad de especies botánicas con potenciales actividades biológicas, ejemplo de ello se encuentra Dalea bicolor, tradicionalmente conocida como hierba de la víbora, cabeza de ratón o escobilla. Se le atribuye diversos usos medicinales, principalmente en problemas gastrointestinales cómo vómito y diarrea (CONABIO, s.f.; Atlas de las plantas de la medicina tradicional mexicana, 2009; Vásquez-Montes et al., 2020). Ante esto, el presente estudio tuvo como objetivo determinar la actividad antibacteriana in vitro de Dalea bicolor sobre bacterias de importancia en salud pública.
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta de Material Vegetal
Dalea bicolor fue colectada en el municipio Mineral del Chico, estado de Hidalgo, México (20°102 493 N 98°452 263 O). Se colectaron las partes aéreas de plantas en diversos estados fenológicos (1200 g). El material vegetal fue secado en ausencia de luz y a temperatura ambiente, y triturado en un molino semi-industrial (Pulvex MPP300).
Se corroboró la identificación de Dalea bicolor en el herbario de la Universidad Autónoma de México (UNAM), registrada como IBUNAM:MEXU:1414355.
Técnica de Extracción
El extracto hidroalcohólico de la planta se realizó según González-Alamilla et al. (2020). Para esto, se maceró el material vegetal (1000 g) en una solución de agua con metanol (70:30) durante 48 h a temperatura ambiente en ausencia de luz. Pasado ese tiempo, la solución fue pasada en dos oportunidades por papel filtro (Whatman® 42) y algodón para eliminar la mayor parte posible del material vegetal. Se utilizó un rotavapor (Büchi R-300) para concentrar a presión el líquido residual y el extracto resultante se conservó a 4 °C.
Material Biológico
Se utilizaron cepas de referencia (ATCC) de Staphylococcus aureus6538 , Listeria monocytogenes19113 , Bacillus subtilis6633 , Escherichia coli35218 , Pseudomonas aeruginosa9027 , Salmonella choleraesuis10708 y Salmonella tiphy14028 . Cada una de las cepas fue reactivada de la crioconservación en agar Müller-Hinton (BD Bioxon, Germany), por medio de la técnica de estría simple con la finalidad de obtener colonias aisladas. Se incubaron durante 24 h a 37 °C y luego se realizó la tinción Gram para corroborar su morfología y pureza. Posteriormente, las colonias en estudio fueron inoculadas en caldo nutritivo (BD Bioxon, Alemania) e incubadas en agitación constante (70 rpm) a 37 °C durante 24 h.
Actividad Antibacteriana
Se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) de acuerdo con lo establecido por el CLSI (2012) y por Morales-Ubaldo et al. (2020). Así mismo, para determinar el efecto bacteriostático o bactericida se calculó la relación CMB/CMI (RangelLópez et al., 2022).
Concentración Mínima inhibitoria (CMI)
Se trabajó con el método de microdilución en placa evaluando con concentraciones de 400 a 3.12 mg/ml. Se utilizaron placas de 96 pozos y las muestras se trabajaron por triplicado. En cada pozo se colocó 100 µl de cada concentración y 10 µl de la suspensión bacteriana (150 x 106 cel/ml), la cual había sido ajustada al 0.5 del patrón de turbidez de McFarland (Remel, R20421, Lenexa, USA). Las placas fueron incubadas a 37 °C durante 24 h en agitación constante (70 rpm). Se utilizó como control positivo a la kanamicina (AppliChem 4K10421, Germany) a concentraciones de 64 a 0.5 µg/ml y como control negativo al caldo nutritivo.
El punto final de la CMI fue determinado mediante un método colorimétrico con sales de tetrazolio (Sigma-Aldrich I8377, USA). Para esto, se colocó 20 µl de una solución de p-iodonitrotetrazolium (0.04% v/v) en cada pozo, considerándose como CMI la concentración que se tornó de color rosa.
Análisis Estadístico
Los resultados de la actividad antibacteriana fueron normalizados (log10) y analizados mediante un diseño completamente al azar a través de un análisis de varianza. Las diferencias entre las medias se evaluaron mediante una comparación de medias por Tukey con un nivel de significancia del 95% (p<0.05), usando el programa SAS v. 9.0.
RESULTADOS
El extracto hidroalcohólico (EHA) de Dalea bicolor presentó actividad sobre todas las cepas evaluadas, determinándose una mejor actividad inhibitoria sobre bacterias Gram negativas como S. choleraesuis10708 y S. typhi14028, al obtenerse una concentración de 3.12 mg/ml para ambas bacterias. Los mejores resultados en el caso de bacterias Gram positivas se obtuvieron para S. aureus6538 y B. subtilis6633 al determinarse una CMI de 6.25 mg/ml, en tanto que L. monocytogenes19113 , E. coli35218 y P. aeruginosa9027 fueron las cepas menos sensibles al tratamiento (12.5 mg/ml). De igual forma, se determinó una CMB de 50 mg/ml frente a L. monocytogenes19113 y S. aureus6538 y de 100 mg/ml para B. subtilis6633 (Cuadro 1).
DISCUSIÓN
No se dispone de reportes sobre la actividad antibacteriana de D. bicolor; sin embargo, Nanayakkara et al. (2002) reportaron actividad antibacteriana de tres compuestos aislados a partir del extracto de acetato de etilo de las raíces de Dalea scandens var. paucifolia sobre Staphylococcus aureus mediante la técnica de microdilución en caldo, determinando actividad inhibitoria en un rango de concentraciones de entre 1.56 y 3.13 µg/ml, concluyendo que la actividad antibacteriana estuvo asociada a los compuestos de carácter fenólico (flavonoides).
De manera similar, Belofsky et al. (2004) determinaron la actividad antibacteriana de extractos orgánicos de Dalea versicolor var. sessilis sobre S. aureus y B. cereus, por el método de microdilución en placa, utilizando concentraciones de entre 7.8 y 500 µg/ml, indicando que la actividad antibacteriana fue conferida por la presencia de chalconas y estilbenos. En un estudio posterior, Belofsky et al. (2014) determinaron que el extracto metanólico de partes aéreas y raíces tuvo actividad inhibitoria a concentraciones de 2.0 y 8.0 µg/ml de Dalea searlsiae sobre S. mutans, S. aureus y B. subtilis, y actividad bactericida a la concentración de 2.7-15.0 ìg/ml. Por su parte, Villa-Ruano et al. (2017) determinaron la actividad antibacteriana de los aceites esenciales de Dalea foliolosa frente a P. syringae pv tabaci y P. syringae pv tomato por el método de microdilución en caldo, determinando concentraciones de entre 35.6 y 155.3 µg/ml.
Estos estudios permiten confirmar la actividad antibacteriana asociada a Dalea bicolor; sin embargo, en concentraciones inferiores a las del presente estudio. Al respecto, Rangel-López et al. (2020) explican que la concentración de metabolitos secundarios puede verse afectada por el empleo de diferentes solventes para la obtención de los extractos.
De acuerdo con los resultados obtenidos, se determinó una mejor actividad sobre bacterias Gram positivas. En este sentido, Martins et al. (2013) señalan que las bacterias Gram negativas son menos susceptibles a los agentes antimicrobianos en comparación con las bacterias Gram positivas, debido a la presencia de una barrera de permeabilidad en la membrana externa, la cual limita el paso de los agentes antimicrobianos al sitio de acción sobre la bacteria.
La mayoría de los estudios asocia la actividad antibacteriana a la presencia de compuestos de tipo fenólico, por lo cual se sugiere que en D. bicolor se encuentran contenidos compuestos químicos de este tipo que presentan actividad antibacteriana frente a cepas Gram positivas y Gram negativas; sin embargo, se requiere realizar la caracterización fitoquímica del extracto hidroalcohólico de D. bicolor para determinar el o los compuestos bioactivos.
