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INTRODUCCIÓN
El virus de la leucosis bovina (VLB) afecta básicamente al bovino (Thompson y Goodrich, 2018), pero se han realizado infecciones experimentales en otras especies como el ovino, que ha llegado a desarrollar linfosarcomas en un tiempo menor que el bovino (Kettmann et al., 1984; Florins et al., 2007). El ovino es una especie que facilita el manejo y estudio de la enfermedad en comparación con el bovino; sin embargo, se buscan otras especies para modelos experimentales que proporcionen más facilidades de manejo y sean más ventajosas para estudiar la enfermedad. Diversas enfermedades han sido estudiadas a partir de modelos experimentales con animales de laboratorio, incluyendo la leucosis enzoótica bovina (LEB) y enfermedades que afectan a los humanos (Lairmore, 2014).
La infección experimental con el VLB se ha reportado en cabras, conejos, ratas y pollos (Kettmann et al., 1984; Dimitrov et al., 2013; Krasnikova et al., 2019; Mori et al., 2019). Se dispone, incluso, de una línea celular productora de virus a partir del bazo de ratas de cepa Wistar infectadas experimentalmente (Altanerová et al., 1989).
El VLB tiene un tamaño de 60 a 125 nm, posee una envoltura, una cápside icosaédrica yungenoma ARN diploide de sentido positivo (Martinez et al., 2018). Además, cuenta con dos proteínas de envoltura, la proteína SU (de superficie, glucoproteína gp51) y la TM (de transmembrana, glucoproteína gp30) codificadas por el gen viral env (Bai et al., 2019; ICTV, 2021).
El genoma del VLB consiste en 8714 nucleótidos incluyendo los genes de las proteínas estructurales esenciales (Polat et al., 2017; ICTV, 2021). Los genes de la proteína estructural y que codifican enzimas gag, pro, pol y env tienes roles esenciales e indispensables en el ciclo viral como la infectividad y la producción de viriones infecciosos. El receptor, transportador de aminoácidos catiónico 1 (CAT1) es una secuencia de proteína de 622 aminoácidos que ha sido identificado como un receptor de membrana en las células murinas para los virus de la leucemia murina, facilitando la entrada del virus en células de ratón y rata (Bai et al., 2019) y se correlaciona con la susceptibilidad individual a la infección por el VLB. La expresión de CAT1 de varias especies demostró que no hay especificidad de especie para la infección por el VLB, implicando a CAT1 como un receptor funcional del VLB responsable de su amplio rango de hospederos in vitro (Sato et al., 2020).
Por tanto, el objetivo de este trabajo fue demostrar la infección experimental con el VLB en ratas de la cepa Holtzman para obtener una especie alternativa que brinde más facilidades económicas, de manejo y tiempo, donde se puedan realizar diversos estudios sobre la leucosis enzoótica bovina, como la evaluación de vías de infección, tratamientos y vacunas, entre otros.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar de Estudio
La investigación se realizó en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú, durante los meses de enero a marzo de 2020.
Animales
Para la preparación el inóculo se empleó una vaca con linfocitosis persistente y seropositiva al virus de Leucosis Enzoótica Bovina (Sandoval-Monzón et al., 2021). Como unidades experimentales se utilizaron 28 ratas de la cepa Holtzman mayores de 2 meses y 8 ovinos criollos de 3 a 4 meses, todos con seronegatividad al VLB comprobada mediante el diagnóstico con la prueba comercial INgezim BLV Compac 2.0, kit de inmuno ensayo de competición basado en la utilización de anticuerpos monoclonales específicos de la gp51 del VLB (Sensibilidad 100%, Especificidad 100%), requerido por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OMSA). Las ratas fueron situadas en un ambiente controlado con temperatura de 24 °C y 70% de humedad relativa. Los ovinos del grupo control fueron criados en corrales en condiciones de ambiente.
Tamaño Muestral
Se trabajó con un tamaño mínimo de ocho animales por grupo para tener un poder de prueba del 80% y un error tipo I de 5%. Estos valores fueron calculados empleando la fórmula para la determinación de tamaño de muestra para la comparación de dos proporciones relacionadas, para lo que se empleó el software GRANMO v. 7.12. Los valores referenciales empleados se basan en que el 100% de los animales inoculados con el virus de la leucosis bovina desarrollan seropositividad y que, al inicio del estudio, todos los animales son seronegativos.
Preparación del Inóculo
Se colectaron 450 ml de sangre de la vaca seropositiva al VLB. La sangre fue centrifugada a 2800 x g durante 15 min. La capa flogística fue extraída y suspendida en buffer de fosfato salino (PBS) hasta obtener 10 ml. Se cuantificó la cantidad de leucocitos de la muestra, y se calculó el volumen a ser inoculado (inóculo) de modo que contenga 30 x 107 leucocitos. Para el conteo de los leucocitos se usó el diluyente Turk y la cámara de Neubauer. Para el caso del inóculo del calostro, se colectaron 2 L de calostro de una vaca recién parida, se cuantificó igualmente la cantidad de leucocitos y calculó el volumen a ser inoculado (inóculo) de modo que contenga 3 x 107 células. El conteo de los leucocitos en el calostro se realizó en 10 µl de la suspensión, la cual fue extendida en 1 cm2 de una lámina portaobjetos, que fue teñida con una solución alcohólica de azul de metileno al 0.3% y visualizada a 1000x.
Diseño Experimental
Se trabajó con cuatro grupos experimentales:
Grupo rata - sangre intraperitoneal: Aplicación del inóculo (30 x 107 leucocitos suspendidos en 0.5 ml) en ocho ratas vía IP.
Grupo rata - sangre oral: Aplicación del inóculo (30 x 107 leucocitos suspendidos en 0.5 ml) de sangre vía oral en 10 ratas.
Grupo rata - calostro oral: Aplicación del inóculo (3 x 107 leucocitos suspendidos en 1.0 ml) de sangre vía oral en 10 ratas.
Grupo ovino - sangre intraperitoneal: Aplicación del inóculo (30 x 107 leucocitos suspendidos en 0.5 ml) vía IP en ocho ovejas.
La inoculación del inóculo vía intraperitoneal se hizo en el abdomen posterior (Hem et al., 1998) y en los ovinos en el centro del triángulo correspondiente a la fosa paralumbar derecha. Para la administración vía oral del inóculo, se sujetaron a las ratas por el dorso y se colocó la jeringa en la boca del animal administrándole lentamente el inóculo, esperando que lo degluta voluntariamente.
Muestras de Sangre
Las tomas de sangre se realizaron a los 0, 21 y 42 días de la inoculación para determinar la seropositividad al VLB.
La toma de sangre de las ratas se hizo por la vena safena. Los animales fueron inmovilizados con una manga con forma de embudo. El operario inmovilizó el miembro pélvico de tal forma que quede extendido y a la vez realizó la hemostasia ejerciendo una ligera presión por encima de la articulación de la rodilla (Hem et al., 1998). Se desinfectó la zona con alcohol, se aplicó vaselina para evitar la expansión de la sangre para permitir que se formen gotas de sangre que pudieron ser colectadas directamente. Para la punción se utilizó una aguja 22 x 1". Se colectó entre 250 a 500 µl, considerando que cada cuatro semanas se puede extraer, como máximo, el 20% del total de volumen sanguíneo del animal (Diehl et al., 2001).
La toma de sangre en los ovinos se realizó mediante punción de la vena yugular. Se empleó una aguja 20 x 1' y tubos colectores sin anticoagulante (BD Vacutainer(r)). Luego de 30 min para permitir la formación del coágulo fueron centrifugadas a 2000 x g por 5 min. El suero resultante fue almacenado en viales.
Análisis de la Información
Para el análisis estadístico se empleó el software RStudio v. 4. Se calculó la frecuencia semanal de animales seropositivos a gp51.
Para comparar la frecuencia semanal de los animales seropositivos a gp51, se empleó la función Fisher multcomp, comparando los resultados obtenidos dentro de cada semana. Todos los análisis fueron realizados con un nivel de significancia del 5%.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados del presente trabajo se presentan en el Cuadro 1. Todos los animales (ratas y ovinos) se encontraron seronegativos en el día de la inoculación (día 0). El grupo ovino - sangre intraperitoneal, que participó como grupo control positivo, presentó seroconversión en el 75% (6/8) de los ovinos a los 21 días y de 100% a los 42 días de la inoculación, siendo estos resultados significativamente diferentes a los resultados de los demás grupos. Los resultados comprueban una vez más que el bioensayo ovino es un método efectivo para el estudio de infecciosidad del BLV (Kenyon et al., 1981; Gutierrez y Forletti, 2016).
Cuadro 1 Animales seropositivos a la prueba de ELISA (INgezim BLV Compac 2.0) para determinar anticuerpos monoclonales específicos de la gp51 del virus de leucemia bovina (VLB)
| Día | Ovino | Rata | Rata | Rata |
|---|---|---|---|---|
| Sangre-intraperitoneal (n=8) | Sangre-intraperitoneal (n=8) | Sangre-oral (n=10) | Calostro-oral (n=10) | |
| 0 | 0a | 0a | 0a | 0a |
| 21 | 6b | 0a | 0a | 0a |
| 42 | 8b | 1a | 0a | 0a |
a,b Letras diferentes dentro de filas indican diferencia significativa (p<0.05)
Los grupos de ratas que emplearon la vía oral (sangre y calostro orales) no presentaron animales seropositivo en las tres muestras. Los resultados indican que la vía de administración resulta inviable para lograr la infección con VLB; sin embargo, Krasnikova et al. (2019) pudo demostrar que es posible infectar a las ratas con VLB por medio de la vía oral utilizando como inóculo leche de vaca infectada. La cepa de ratas empleada en ese experimento fue Wistar y en el presente estudio fue Holtzman; además, en dicho estudio las ratas recibieron el inóculo a base de leche fresca en forma diaria y por 3-6 meses.
En el grupo rata -sangre intraperitoneal se encontró que un individuo presentó seroconversión (1/8, 12.5%) a los 42 días post inoculación, aunque sin diferencias significativas con los otros dos grupos de ratas. En un estudio similar, Dimitrov et al. (2013) tuvieron seropositividad en el 34% de 32 ratas Wistar inoculadas; sin embargo, usando doble inoculación con 10 días de intervalo.
Los resultados del presente estudio tampoco fueron concordantes con el trabajo de Altanerová et al. (1989), donde no solo logró la seropositividad en las ratas inoculadas, sino que llegó a establecer una línea celular productora de virus a partir del bazo de las ratas infectadas. En ese estudio se utilizaron ratas Wistar adultos de ambos sexos, con una única dosis de inoculación vía IP o subcutánea; y con un inóculo de un clon celular derivado de células renales de feto de cordero infectado (20 x 106células).
Además de las diferencias con las metodologías empleadas entre los trabajos de investigación de referencia y este estudio, se encuentra la cepa animal utilizada como factor probable por no haber logrado la infectividad, donde en este estudio se trabajó con ratas Holtzman y los estudios de referencia trabajaron con Wistar (Alteranová et al., 1989; Dimitrov et al., 2013). A pesar de que la rata es el animal de laboratorio más utilizado en distintos campos de investigación, existen cepas de ratas que son utilizadas para fines específicos, tales como bioensayos o modelos experimentales, debido a que estas cepas tienen características fisiológicas, inmunológicas y bioquímicas que ayudan al correcto desarrollo de esas investigaciones (Johnson, 2012).
En el presente estudio se utilizó la cepa Holtzman, a diferencia de la cepa Wistar utilizada por otros investigadores, debido principalmente por su disponibilidad. No obstante, se tenía además el fundamento teórico para sustentar su uso en el experimento, ya que los receptores para el VLB no son de especie específica; sin embargo, no se logró la infectividad. La cepa Wistar es la más utilizada como biomodelo en distintos campos de investigación, tales como oncología, inmunología, toxicología, entre otros, principalmente debido a características propias de la cepa, tales como como la prolificidad y la resistencia a ciertos patógenos (Mourelle et al., 2013).
También se podría considerar que la calidad del inóculo podría ser inadecuada; sin embargo, en el grupo control positivo (ovinos) se utilizó el mismo inóculo obteniendo una seroconversión del 100%, lo cual demuestra que, tanto la carga viral empleada como el inóculo, debieron ser suficientes para generar una respuesta de seroconversión en los grupos experimentales.
CONCLUSIONES
La especie rata, cepa Holtzman, no resultó ser adecuada para la infección experimental o bioensayo con el virus de leucosis bovina (VLB) con los distintos métodos de inoculación.
Se confirma la susceptibilidad de la especie ovina para la infección experimental con VLB mediante la vía intraperitoneal con sangre de una vaca con LEB.
