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Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica

versión impresa ISSN 1726-4634

Rev. perú. med. exp. salud publica v.14 n.2 Lima jul./dic 1997

 

COMUNICACIONES CORTAS

 

Aislamiento y mantenimiento in vitro de Plasmodium falciparum

 

Pardave L. Blanca 1; Arce B. Cecilia 1; Cabezas S. César 2.

 

1 Laboratorio de Malaria, División de Parasitología.
2 Director General del Centro Nacional de Laboratorios de Salud.

 


 

RESUMEN

Se aislaron 08 cepas de Plasmodium falciparum a partir de 10 pacientes. Luego fueron adaptadas y mantenidas en cultivo in vitro durante 60 días en eritrocitos humanos grupo O, en medio RPMI 1640 enriquecido con plasma humano grupo O, bajo una atmósfera de 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de Nitrógeno y luego preservados a -70ºC.

Palabras clave: Plasmodium falciparum, aislamiento, Perú.


 

ABSTRACT

Eight strains of Plasmodieum Flaciparum, were isolated from 10 patients. They were adapted and mantained in culture during 60 days using human red celis, group O, RPMI 16 40 medium and human plasma, group O, under 5% oxigen and 90% Nitrigen mixed gases. Finally, they were preserved at -70º C.

Key words: Plasmodium falciparum, isolation, Peru.


 

INTRODUCCIÓN

La malaria o paludismo, es una enfermedad infecciosa producida por protozoarios del género Plasmodium y transmitida por la picadura del mosquito del género Anopheles.

Esta enfermedad es endémica en nuestro país, donde circulan tres de las cuatro especies de Plasmodium: P. vivax, P. malariae y P falciparum, causando esta última la malaria maligna que puede producir la muerte del hospedero 3.

En la actualidad se desconocen aún las cepas circulantes de P. falciparum en el país, su conocimiento es importante para comprender las características clínicas y epidemiológicas de la malaria maligna, según se ha demostrado en otras partes del mundo 1.

Para establecer las características mencionadas, una primera etapa es el aislamiento de P. falciparum en medio de cultivo a partir de casos conocidos de la enfermedad 2.

El desarrollo del parásito en los medios de cultivo nos permitirá mediante el estudio de la biología molecular del parásito, determinar las diferentes cepas de P. falciparum.

El trabajo se ha realizado con la finalidad de aislar P. falciparum en cultivo procedentes de diferentes regiones del país, iniciándose el estudio en la zona de Loreto, por presentar las tasas más altas de infección por esta especie de Plasmodium 5.

 

MATERIAL Y MÉTODOS

OBTENCIÓN Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS:

Se colectó sangre venosa ascépticamente en tubos heparinizados de 10 pacientes con diagnóstico parasitológico positivo (gota gruesa) para Plasmodium falciparum procedentes de las localidades de Santa Clara y Padre Cocha (Iquitos) y fueron transportadas desde la ciudad de Iquitos al Laboratorio del INS en Lima dentro de las 24 horas siguientes, conservadas en un frasco termo a 4ºC.

LAVADO DE LAS MUESTRAS:

Los glóbulos rojos obtenidos fueron lavados tres veces en medio de cultivo RPMI 1640 incompleto (Sin plasma). El sedimento fue resuspendido en 5 mL de medio completo (RPMI 1640, suplementado con 25 mM de buffer HEPES, 25 mM bicarbonato de sodio, 25 uL de Sulfato de Gentamicina y 10% de plasma humano grupo O, y el pH fue ajustado a 7,4). La concentración de glóbulos tenía un hematocrito de 2% y se transfirió a frascos de 50 mL para cultivo 6.

 

CULTIVO

La metodología empleada para el cultivo fue la descrita por Trager y Jensen 4. Los parásitos fueron cultivados en medio RPMI 1640 completo; para lo cual se utilizó una estufa a 37ºC y una mezcla de gases de 5% CO2, 5% O2, y 90 % de Nitrógeno. El medio fue cambiado cada dos días hasta que la concentración de parásitos se hizo detectable, a partir del cual se cambió diariamente el medio.

Eritrocitos frescos grupo O previamente lavados fueron añadidos al cultivo una vez por semana para aumentar el hematocrito al 2%. Cuando el porcentaje de parásitos alcanzó al 1%, estos fueron subcultivados para mantener las condiciones óptimas de los parásitos6.

El conteo de células infectadas se hizo en base a 10,000 hematíes.

Los eritrocitos parasitados con formas anulares predominantes fueron criopreservados a -70ºC en congeladora REVCO para un posterior estudio de la sensibilidad a las drogas antimaláricas, del patrón genético parásito, así como para la preparación de antígenos para pruebas serológicas (IFI y ELISA).

 

RESULTADOS

De las 10 muestras procedentes de igual número de pacientes, en 02 se observaron gametocitos en la lámina del día 0 y en sus cultivos no se pudo recuperar la cepa.

De las 08 muestras restantes, la adaptación fue lenta en dos de ellas, una a los 23 días y otra a los 31 días. Las 06 restantes se adaptaron a los 7 días en promedio (Tabla 1).

 

Tabla N° 1
Cultivo de Cepas de P. falciparum.

 

 

DISCUSIÓN

Es la primera vez en el Instituto Nacional de Salud, se logra aislar y mantener in vitro cepas de P. falciparum, siguiendo la técnica estanderizada por Trager y Jensen4. El contar con cepas aisladas y mantenidas in vitro permitirá realizar estudios de sensibilidad para drogas antimaláricas, considerando que la resistencia del P. falciparum viene construyendo un serio problema para su control.

Asimismo, a partir de los aislamientos se podrán realizar estudios de variabilidad genética, que permitirá evaluar la virulencia del parásito como uno de los factores en la severidad o no de la infección por P. falciparum.

 

BIBLIOGRAFÍA

1. Liese, B.H. & Hammer, J. 1992 Malaria: New Patterns and Perspectives World Bank Technical Paper 183:7.         [ Links ]

2. Jesen, B. 1988. In Vitro cultivation of Malaria parasites. In: Malaria- Principies and Practices of Malariology, Wernsdorfer W.H. and Mc Gregor (Eds) Chuchill, Livingstone I: 307-329         [ Links ]

3. MINSA, 1997. Dirección Regional de Loreto. Supervisión y evaluación externa de las actividades de control de la Malaria realizadas durante el año 1996. Informe Técnico del Comité de Lucha Contra la Malaria, Lima 1997.         [ Links ]

4. Trager, W And Jensen J. 1997. Human Malaria Parasite in continuos culture. Sciencie 193: 673-675.         [ Links ]

5. Ministerio de Salud, Doctrina, Normas y Procedimientos para el Control de la Malaria en el Perú, Programa de Control de la Malaria Documento Técnico. Lima, 1993.         [ Links ]

6. Pardave B, Arce C, Gutierrez S. Manual de Procedimientos Técnicos para el Diagnóstico de Malaria. 1997. Zavaleta A, Cabezas C, Chang J. (Eds). Serie de Normas Técnicas Nº 14, Segunda Edición, Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud. Red Nacional de Laboratorios de Salud. Lima. Art Lautrec. 121 págs.         [ Links ]