SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.16 número1-2Oncogenes E6-E7 de los Papilomavirus Humanos de alto riesgo detectados por PCR en Biopsias de pene incluidas en parafinaPurificación y Control de Calidad de la Fracción Antigénica F1 de Yersinia pestis índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Articulo

Indicadores

  • No hay articulos citadosCitado por SciELO

Links relacionados

  • No hay articulos similaresSimilares en SciELO

Bookmark


Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica

versión impresa ISSN 1726-4634

Rev. perú. med. exp. salud publica v.16 n.1-2 Lima  1999

 

ARTÍCULOS ORIGINALES

 

Determinación de la Variedad de Cepas de Cryptococcus Neoformans aisladas de pacientes con SIDA

 

Canelo C1; Navarro A2; Guevara M2; Urcia F2; Zurita S2; Casquero J2

1 Facultad de Ciencias Biológicas - Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
2 División de Micología, Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.

 


RESUMEN

Cryptococcus neoformans tiene 2 variedades: neoformans y gattii. El primero afecta a pacientes inmunosuprimidos y la variedad gattii produce enfermedad en individuos aparentemente sanos originando compromiso neurológico. En nuestro país no se realizan pruebas bioquímicas diferenciales, por lo que este estudio permitió estandarizar un método de tipificación de las variedades en cepas de C. neoformans de origen clínico mantenidas en el Instituto Nacional de Salud del Perú (INS). Entre abril de 1997 y diciembre de 1998, el INS recibió 18 cepas de C. neoformans aisladas de pacientes con SIDA. La confirmación de las especies fue realizada según métodos convencionales: observación de levaduras encapsuladas, prueba de la urea, asimilación de carbohidratos y tolerancia a la temperatura. Adicionalmente se verificó la ausencia de la enzima nitrato reductasa y se realizó la prueba de la fenoloxidasa modificada. Las 18 cepas fueron tipificadas como variedad neoformans usando el agar CGB. No se encontró ninguna cepa de variedad gattii. 

Palabras clave: Serotipificación, Cryptococcus neoformans, Sindrome de inmunodeficiencia adquirida.


 

ABSTRACT

Cryptococcus neoformans has two varieties: neoformans and gattii. The first one affects mainly immunosuppressed patients and the latter causes neurological lesions. Differential biochemical tests are not performed in Peru, so this study was able to standardize a typification method among C. neoformans strain varieties from clinical origin that were maintained at the National Institute of Health (INS) of Peru. Between April 1997 and December 1998, INS received 18 C. neoformans strains isolated from AIDS patients. Confirmation of the species was performed according to conventional methods: encapsulated yeast observation, urease test, carbohydrate assimilation and temperature toleration. Additionally, the absence of the nitrate reductase enzyme was verified and the modified fenoloxidase test was performed, too. All 18 strains were typified as neoformans by means of CGB. No gattii strains were found. 

Key words: Serotyping, Cryptococcus neoformans, Acquired inmunodeficiency syndrome.


 

INTRODUCCIÓN

La criptococosis es la infección oportunista más común del SNC en pacientes con SIDA en los Estados Unidos1,2. El agente etiológico, Cryptococcus neoformans, presenta dos variedades C. neoformans var. neoformans (serotipos A y D), aislada principalmente de excretas de palomas, y C. neoformans var. gattii (serotipos B y C) a partir de diferentes especies de Eucalyptus3-9

Salkin y Hurd10 reportaron el uso del agar glicina cicloheximida rojo de fenol (GCP) para la diferenciación de los cultivos de cepas de C. neoformans en sus dos variedades. Kwon-Chung y col.11 desarrollaron el medio canavanina glicina azul de bromotimol sódico (CGB) y un total de 213 cepas de C. neoformans fueron probadas en los agares CGB, GCP y CDB (creatinina dextrosa azul de bromotimol). Ellos concluyeron que el medio CGB fue superior al GCP y CDB en el quinto día de incubación y el 100,0% de C. neoformans var. neoformans pudo diferenciarse de la variedad gattii. 

El medio CGB emplea Glicina como única fuente de carbono y nitrógeno; la droga que ayuda a la tipificación de ambas variedades es el Sulfato de L-Canavanina y el indicador es el Azul de Bromotimol Sódico. 

La diferenciación bioquímica de C. Neoformans por variedades mediante el uso del medio CGB se debe a que 28,0 a 33,0% del serotipo A es sensible a £5mg/L de canavanina y 100,0% del serotipo D es sensible a esta concentración de la droga. De los aislamientos del serotipo A resistentes a canavanina, 10,0 a 20,0% son capaces de asimilar la glicina; sin embargo, éstos no crecen cuando son cultivados sobre el medio que contiene ambos compuestos. Solamente 11,0% de los aislamientos serotipo D utilizan la glicina, pero todos son sensibles a la canavanina; en cambio, 100,0% de las cepas de C. neoformans var. gattii (serotipos B y C) resisten la canavanina hasta o excediendo los 960 mg/L y asimilan la glicina (Concentración de canavanina en el medio CGB: 30mg/L). Luego del metabolismo de este componente se forma amonio, el cual alcaliniza el medio haciendo virar el indicador hacia un color azul cobalto11-14.

El estudio de las diferencias epidemiológicas de ambas variedades en 725 cepas de origen clínico obtenidas de diferentes partes del mundo antes de la epidemia del SIDA, confirman la superioridad del medio CGB sobre otros medios para la diferenciación de las dos variedades15. La variedad neoformans fue encontrada en todos los años (entre 1972 y 1992) que se hicieron aislamientos, mientras que la variedad gattii fue observada solamente a partir de 198616. En un estudio de 68 cepas aisladas de pacientes peruanos inmunocompetentes, la determinación de la variedad fue realizada en el Instituto de Medicina Tropical “Prince Leopold” (Bélgica) identificándose en 66/68 la var. neoformans y en 2/68 la var. gattii fue identificada mediante su habilidad de asimilar la D-Prolina17

La determinación de las variedades de Cryptococcus neoformans usando el agar CGB no ha sido realizada ni estandarizada en nuestro país. Por lo tanto, este estudio permitirá utilizar una metodología sencilla para la tipificación de las cepas de C. Neoformans en sus dos variedades, siendo los objetivos del trabajo: 

- Determinar la variedad en cepas de C. Neoformans provenientes de pacientes inmunosuprimidos que se encuentran conservadas en la micoteca del INS. 
- Estandarizar las técnicas para determinar las actividades de las enzimas nitrato reductasa y fenoloxidasa en cepas de C. neoformans.
- Evaluar el comportamiento cultural de las cepas de Cryptococcus sobre el agar CGB para establecer la diferenciación entre la var. neoformans y gattii. 

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIAL BIOLÓGICO

Se evaluaron 18 cepas de Cryptococcus neoformans aisladas de muestras de LCR que fueron remitidas al Laboratorio de Micosis Oportunista del INS desde abril de 1997 hasta diciembre de 1998. Todas las cepas procedían de pacientes con SIDA. Sólo se señala la edad en 12 pacientes cuyo promedio fue de 35,4 años (18-72-72 años). En 16 pacientes se registró el sexo, hallándose 12 varones y 4 mujeres. Como controles se emplearon las cepas H–0058- 620 de Cryptococcus neoformans var. neoformans serotipo A y la H–0058-628 de Cryptococcus neoformans var. gattii serotipo B, procedentes del Grupo de Microbiología del Instituto Nacional de Salud de Colombia. Además, se utilizó un aislamiento autóctono de Candida albicans, identificado en el Instituto Nacional de Salud.

IDENTIFICACIÓN DE LA ESPECIE DE C. NEOFORMANS

Se realizaron las siguientes pruebas recomendadas: Tinción negativa con Tinta China, prueba del tubo germinal18, formación de hifas, pseudohifas, clamidosporas y blastoconidias19, formación de película en caldo sabouraud dextrosa20, tolerancia a la temperatura de 37ºC21, prueba de la ureasa, asimilación de carbohidratos: glucosa, lactosa, sacarosa, galactosa, maltosa y rafinosa18, reducción rápida del nitrato 22 y presencia de la enzima fenoloxidasa (Canelo C, Casquero J. Comunicación personal). 

DETERMINACIÓN DE LA VARIEDAD DE Cryptococcus neoformans 

Se tomó una asada de cada cepa y se inoculó en tubos que contenían el agar CGB, se incubaron a 28ºC por cinco días, realizando lecturas diarias. Una prueba positiva fue indicada por un cambio del color inicial amarillo oro (pH = 5,8 ± 0,1) hacia un color azul cobalto (pH≥7,0) del medio. Si éste permaneció con su color inicial, se trató de una prueba negativa11

RESULTADOS

En 100,0% de las cepas se observó levaduras redondas poco encapsuladas mediante la tinción negativa con tinta china; desarrollo a 37ºC, incapacidad para formar tubo germinativo en suero humano, no formaron hifas o seudohifas ni clamidosporas en agar Corn Meal- Tween 80 y tampoco formaron película en caldo sabouraud dextrosa. Todas las cepas fueron ureasa positivas y carecieron de la enzima nitrato reductasa. El 100% de los aislamientos asimiló la glucosa, galactosa, maltosa y sacarosa, pero no asimilaron la lactosa y sólo 38,8% (7/18) de los aislamientos asimiló la rafinosa. 

Las 18 cepas de C. neoformans fueron tipificadas como var. neoformans sobre el medio CGB, después de 5 días de incubación a 28ºC. La tipificación de la variedad de las cepas control de C. neoformans se realizó satisfactoriamente y se comprobó que la cepa control serotipo A y todas las cepas de origen clínico de C. neoformans fueron incapaces de crecer y modificar el color inicial (amarillo oro) del agar CGB clasificándolas como var. neoformans; en cambio, la cepa control serotipo B creció e hizo virar levemente el color (1+) del medio en el segundo día de incubación, en el tercer día cambió el medio hacia un color azul verdoso (2+), y en el cuarto día el agar se tornó azul cobalto con un fondo azul verdoso (3+), y que se mantuvo sin ninguna variación hasta por lo menos 2 semanas de incubación a 28ºC comprobándose que esta cepa fue var. gattii (Figura 1). 

El valor del pH = 5,8 ± 0,1del medio es crítico, por lo que se debe ser preciso en su determinación. Un pH menor que lo indicado puede darnos resultados indeterminados (2+) para la variedad gattii. 

El tamaño del inóculo y la edad del cultivo no fueron factores críticos en la determinación de la variedad. No se halló ningún resultado indeterminado (2+) en los 18 aislamientos de C. neoformans var. neoformans. 

 

Figura 1. Diferenciación bioquímica de C. neoformans var. gattii (izquierda),
C. neoformans var. neoformans (derecha), mediante el uso de agar
canavanina glicina azul de bromotimol (CGB).

 

 

DISCUSIÓN

El 100,0% de las cepas de origen clínico provino de pacientes con SIDA, ya que este síndrome ha llegado a ser el principal factor predisponente para la criptococosis. Esta última, es la cuarta causa de infección en pacientes con SIDA y se manifiesta en cerca de un tercio de estos pacientes1,23. La incidencia de infección criptocócica en ellos ha sido estimada en 6,0 a 15,0% en los Estados Unidos, Europa Occidental y Australia; sin embargo en África meridional el cuadro meníngeo ocurre en 15,0 a 30,0%12.

Las edades de los pacientes de los cuales se aisló C. Neoformans, refleja que la mayoría de los casos ocurren entre los 20 a 39 años tal como lo observado en estudios realizados en Colombia y Argentina16,24. El predominio masculino sobre el femenino encontrado en 16 pacientes, estuvo en una proporción de 3:1, coincidiendo con lo observado en los Estados Unidos de América antes de la era del SIDA. En aquella década la criptococosis ocurrió 2 ó 3 veces más en varones que en mujeres. Actualmente en los Estados Unidos aproximadamente igual porcentaje de cada sexo es infectado con C. neoformans6

El tamaño de la cápsula está determinada por características genotípicas de cada cepa y por las condiciones de crecimiento. Las células encapsuladas de C. neoformans no son fagocitadas12. Los estudios sobre el rol de la cápsula en la virulencia de este hongo no han explicado aún porque C. neoformans es el único patógeno verdadero en el género Cryptococcus en el cual todos los miembros de su especie son normalmente encapsulados25

El 38,8% de las cepas asimiló la rafinosa. Esto verificó que la asimilación de este azúcar es variable en cada cepa. 

La ausencia de la enzima nitrato reductasa fue verificada mediante una prueba rápida de reducción del nitrato, en la que se optimiza el pH entre 5,8 a 6,5; se usa una mayor concentración del sustrato (nitrato de potasio) para evitar resultados falsos negativos; una temperatura de 45ºC y aumento de la permeabilidad celular producido por el cloruro de benzalkonio (22). 

En América del Sur, se ha informado el aislamiento de la variedad gattii en pacientes no-SIDA16,17,23,24. En el mundo sólo se ha informado de cuatro casos de SIDA asociados a criptococcosis causada por la var. gattii: en Zaire27, Canadá28, Estados Unidos de América29 y Brasil30. Por lo que se plantea la posibilidad que los pacientes con SIDA no están expuestos a esta variedad porque no están en contacto con árboles del género Eucalyptus5

Estos antecedentes plantean la búsqueda de reservorios para la var. gattii en nuestro país, así como también estudios de tipo epidemiológico para conocer la distribución de ambas variedades. 

No obstante que los casos de criptococosis causados por la var. gattii son infrecuentes, debemos estar en capacidad para su correcta identificación, logrando aprovechar los datos clínico-epidemiológicos de cada caso esporádico. La tipificación inmediata de algún aislamiento de esta variedad, permitirá un cuidadoso seguimiento de la enfermedad producida por este hongo, ayudando a conocer más las diferencias de la expresión clínica entre ambas variedades. Se ha establecido que la var. gattii se encuentra en huéspedes aparentemente sanos y que 90,0% de lasinfecciones por C. neoformans var. neoformans ocurren en huéspedes inmunosuprimidos; además, la mortalidad entre los pacientes con la variedad neoformans fue alta, mientras ninguno con la variedad gattii falleció, pero frecuentemente tuvieron secuelas neurológicas que requirieron cirugía y terapia prolongada31

Las diferencias en la incidencia y expresión de la enfermedad clínica sugieren potenciales diferencias importantes en la patogénesis y en las interacciones huésped-hongo causadas por ambas variedades de C. neoformans26.

La incidencia de criptococosis en las Américas no es conocida, pero si tenemos en cuenta que en los Estados Unidos este valor fluctúa entre 5,0-10,0%, y en Argentina sería 4,6%24, el número de casos acumulados de criptococosis en nuestro país debe ser considerable y debe empezar a conocerse. 

CONCLUSIONES

* El 100,0% de las cepas conservadas (18) en la micoteca del INS fueron Cryptococcus neoformans var. neoformans. 

* La prueba de la reducción rápida del nitrato, en 10 minutos y a 45ºC, demostró la ausencia de la enzima nitrato reductasa en todas las cepas de C.neoformans, siendo recomendable su empleo. 

* Se comprobó la especificidad del agar CGB para la diferenciación bioquímica de las variedades de C.neoformans.

AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Nacional de Salud de Colombia por habernos proporcionado las cepas controles de C. neoformans var. neoformans y var. gattii. 

 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Dal Pan GJ, Mc Arthur JC. Neuroepidemiology of HIV Infection. Neurol Clin 1996; 14: 359-82.         [ Links ]

2. Powderly WG. Cryptococcal Meningitis and AIDS. Clin Infect Dis 1993; 17: 837-42.         [ Links ]

3. Arguero B, Garza D, Torres M. Aislamiento de Cryptococcus neoformans var. gattii de Eucalyptus treticornis. Rev Iberoam Micol 1996; 13: 27-8.         [ Links ]

4. Chakabarti A, Jatana M, Kumar P, Chatha L, Kaushal A, Padhye AA. Isolation of Cryptococcus neoformans var. gattii from Eucalyptus camaldulensis in India. J Clin Microbiol 1997; 35: 3340-2.         [ Links ]

5. Ellis DH, Pfeiffer TJ. Natural habitat of Cryptococcus neoformans var. gattii. J Clin Microbiol 1990; 28: 1642-4.          [ Links ]

6. Levitz SM. The ecology of Cryptococcus neoformans and the epidemiology of criptococcosis. Rev Infect Dis 1991; 13: 1163-9.         [ Links ]

7. Pfeiffer T, Ellis D. Enviromental isolation of Cryptococcus neoformans var. gattii from California. J Infect Dis 1991; 163: 929-30.         [ Links ]

8. Pfeiffer T, Ellis D. Additional Eucalyptus hosts for Cryptococcus neoformans var. Gattii. Abstracts of the 13th Congress of the International Society for Human and Animal Mycology (ISHAM). Australia, 1997.         [ Links ]

9. Sorell TC, Ellis DM. Ecology of Cryptococcus neoformans. Rev Iberoam Micol 1997; 14: 42-3.         [ Links ]

10. Salkin IF, Hurd NJ. New Medium for Differentiation of Cryptococcus neoformans Serotype Pairs. J Clin Microbiol 1982; 15:169-71.          [ Links ]

11. Kwon-Chung KJ, Polacheck I, Bennet JE. Improved diagnostic medium for separation of Cryptococcus neoformans var. neoformans (serotypes A and D) and Cryptococcus neoformans var. gattii. (serotypes B and C). J Clin Microbiol 1982; 15: 535-7.          [ Links ]

12. Mitchell TG, Perfect JR. Cryptococcosis in the era of AIDS 100 years after the discovery of Cryptococcus neoformans. Clin Microbiol Rev 1995; 8: 515-48.         [ Links ]

13. Min KH, Kwon-Chung KJ. The biochemical bases for the distinction between the two Cryptococcus neoformans varieties with CGB medium. Zbl Bakt Hyg A 1986; 261: 471-6.         [ Links ]

14. Polacheck I, Kwon-Chung KJ. Canavanine resistance in Cryptococcus neoformans. Antimicrob Agents Chemother 1986; 29: 468-73.          [ Links ]

15. Kwon-Chung KJ, Bennet JE. Epidemiologic differences between the two varieties of Cryptococcus neoformans. Am J Epidemiol 1984; 120: 123-30.         [ Links ]

16. Ordóñez N, Castañeda E. Serotipificación de aislamientos clínicos y del medio ambiente de Cryptococcus neoformans en Colombia. Biomed 1994; 14: 131-9.          [ Links ]

17. Bustamante B, Swinne D. Aislamiento de Cryptococcus neoformans var. gattii en Dos Pacientes Peruanos. Datos no publicados.         [ Links ]

18. Casquero C, Zurita S. Manual de Procedimientos de Laboratorio para el Diagnóstico de Micosis Oportunistas y Profundas. Serie de normas técnicas N.º 23. Instituto Nacional de Salud. Ministerio de Salud. Perú, 1997.          [ Links ]

19. Koneman EW, Roberts ED. En: Micología. Práctica de Laboratorio. Editorial Médica Panamericana, Bs. As. 3ª. Ed, 1992: 176-95. Buenos Aires-Argentina, 1992.          [ Links ]

20. Hunter MS, Cooper BH. Yeast of medical importance. In: E. H. Lenette, A. Balows, W. J. Hausler, and J. P. Truant (ed), Manual of Clinical Microbiology, 3th ed. American Society for Microbiology, Washington, 1980: 562-76.          [ Links ]

21. Rippon JW, Micología Médica. Hongos y actinomicetos patógenos. Nueva Editorial Interamericana, México, 3ª ed, 1990: 629-59. México, 1990.         [ Links ]

22. Hopkins, J. M and G. A. Land. Rapid method for determining nitrate utilization by yeasts. J Clin Microbiol 1997; 5: 497 - 500.          [ Links ]

23. Kwon- Chung KJ, Bennet JE. Medical Mycology. Ed. Lea and Lebiger. 1st. Ed, Philadelphia, 1977: 497-500.          [ Links ]

24. Bava AJ y col. Estudio de algunos aspectos epidemiológicos de 253 casos de criptococcosis. Rev Iberoam Micol 1997; 14: 111-4.          [ Links ]

25. Kwon-Chung KJ, Rhodes JC. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun 1986; 51: 218-23.          [ Links ]

26. Saag MS. Editorial response: clinical and host differences between infections with the two varieties of Cryptococcus neoformans. Clin Infect Dis 1995; 21: 35-6.         [ Links ]

27. Kapenda K. Meningitis due to Cryptococcus neoformans var. gattii in a Zairean AIDS Patient. Eur J Clin Microbiol 1987; 6: 320-1.          [ Links ]

28. St Germain G, Noel G, Kwon–Chung KJ. Disseminated Cryptococcosis due to Cryptococcus neoformans var. gattii in a Canadian patient with AIDS. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1988; 7: 587-8.          [ Links ]

29. Clancy MN, Fleishmann J, Howard DH, Kwon-Chung KJ, Shimiku RY. Isolation of Cryptococcus neoformans var. gattii from a patient with AIDS in southern California. J Infect Dis 1990; 161: 809.         [ Links ]

30. Rozenbaum R. Cryptococcus neoformans var. gattii in a Brazil ian AIDS Patient. Mycopathol 1990; 112: 33-4.          [ Links ]

31. Speed B, Dunt D. Clinical and hosts differences between infections with the two varieties of Cryptococcus neoformans. Clin Infect Dis 1995; 21: 28-34.         [ Links ]

 

Correspondencia: Carlos Canelo. Instituto Nacional de Salud.
Calle Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú. Apartado Postal 471.
Telf.: (0511) 4719920 - Fax: (0511) 4710179.
Email: micolog@ins.sld.pe