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Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica

versão impressa ISSN 1726-4634

Rev. perú. med. exp. salud publica v.22 n.4 Lima out./dic 2005

 

TRABAJOS ORIGINALES

 

Actividad citotóxica in Vitro de la mezcla de Annona muricata y Krameria Lappacea sobre células cancerosas de glándula mamaria, pulmón y sistema nervioso central

 

Jorge Arroyo A 1; Mahabir Prashad G 2; Yelkaira Vásquez B 2; Elena Li P 3; Gloria Tomás C 4

1 Facultad de Medicina Humana, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
2 CIFLORPAN (Centro de Investigaciones Farmacognósticas de la Flora Panameña), Facultad de Farmacia, Universidad de
Panamá. Panamá, República de Panamá.
3 Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
4 Facultad de Química e Ingeniería Química, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.

 


 

RESUMEN

Objetivos: Determinar la actividad citotóxica de las fracciones procedentes de la combinación 1:1 del extracto etanólico de hojas de Annona muricata L (guanábana) y el extracto acuoso atomizado de la raíz de Krameria lappacea (ratania) en cultivos de líneas celulares cancerosas de glándula mamaria (MCF-7), pulmón (H-460) y Sistema nervioso central (SF-268. Materiales y métodos: Para el fraccionamiento de la mezcla 1:1 de Annona mas Krameria se preparó una columna cromatográfica de 50 cm de longitud empleando diclorometano, diclorometano: acetato de etilo y CHCl 3:MeOH como sistemas de elusión de polaridad creciente, obteniéndose 186 fracciones. Se evaluaron las fracciones 2 a 83 en cultivo de células cancerosas de glándula mamaria (MCF-7), de pulmón (H-460) y del sistema Nervioso central (SF-268. Todas las fracciones fueron ensayadas en duplicado. Aquellas fracciones que presenta-ron un porcentaje de crecimiento de células cancerosas (%G) <50% en alguna de las tres líneas celulares fueron ensayadas nuevamente a cinco concentraciones, para determinar finalmente la concentración a la cual se inhibe el 50% del crecimiento de las células cancerosas (GI 50. Se consideraron activas aquellas fracciones con una GI 50 <10 µg/mL. Resultados: Las fracciones 7 a 17 procedentes de la asociación de los dos productos naturales frente a los cultivos de las líneas celulares tumorales MCF-7, H-460 y SF-268 mostraron una GI 50 de 1,6, 1,4 y 1,4 µg/mL respectivamente. Conclusiones: Las fracciones 7 a 17 procedentes de la asociación de Annona más Krameria mostraron acción citotóxica in vitro frente al cultivo de células cancerosas de glándula mamaria, pulmón y del sistema nervioso central.

Palabras clave: Plantas medicinales; Fitoterapia; Citotoxicidad; Agentes Antineoplásicos; Cultivo Celular, Annona Muricata, Krameria lappacea (fuente: DeCS BIREME).

 


 

ABSTRACT

Objectives: To determine cytotoxic activity of fractions from a 1:1 combination of an ethanol extract of Annona muricata leaves (soursop) and atomized aqueous extract of Krameria lappacea root (Ratania) in breast (MCF-7), lung (H-460), and central nervous system (SF-268) cancer cell cultures. Material and methods: For fractionating the 1:1 mixture of Annona and Krameria a 50-cm long chromatographic column was prepared using dichloromethane, dichloromethane: ethyl acetate and ChCl 3:MeOH as increasing polarity eluting systems and 186 fractions were obtained. Fractions 2 to 83 were assessed in breast (MCF-7), lung (H-460), and central nervous system (SF-268) cancer cell cultures. All fractions were assessed two times. Those fractions that showed <50% growth of cancer cells (%G) in any of the three cell lines were assayed once again using five different concentrations, in order to determine the concentration where there was a 50% inhibition of cancer cell growth (GI 50 ). Those fractions with a <10 m g/mL GI 50 were considered to be active against cancer cell lines. Results: Fractions 7 to 17 of the association of the two aforementioned natural products has GI 50 values reported as 1,6, 1,4, and 1,4 m g/mL against MCF-7, H-460, and SF-268 cancer cell lines, respectively. Conclusions: Fractions 7 to 17 of the Annona and Krameria combination showed in vitro cytotoxic activity against breast, lung, and central nervous system cancer cultured cells.

Key words: Medicinal Plants; Phytotherapy; Cytotoxicity; Antineoplastic Agents, Cell Culture; Annona muricata, Krameria lappacea (source: DeCS BIREME).

 


 

INTRODUCCIÓN

El cáncer de pulmón, tanto en países desarrollados Como en países en vías de desarrollo, se relaciona con mayor índice de morbilidad y mortalidad; La enfermedad se diagnostica en gran parte en una etapa avanzada sin las alternativas terapéuticas eficaces 1; el cáncer de mama es el más común en mujeres de la mayor parte del mundo, la incidencia va en promedio de 95 por 100 000 en los países desarrollados y en 20 por 100 000 en los países en desarrollo 2.

Por muchos años, las acciones citotóxicas de las drogas quimioterapéuticas fueron atribuidas solamente a su capacidad de inducir la muerte genotóxica 3; sin embargo, se han acumulado evidencias que estos agentes ejercen sus efectos citotóxicos principalmente induciendo apoptosis en células del tumor; la debilitación de la apoptosis está relacionada con la inmortalidad de la célula y la carcinogénesis 3.

Actualmente se dispone de una gama de drogas quimioterapéuticas como el etopósido, camptotecina VM26, vincristina, cisplatino, ciclofosfamida, paclitaxel, 5-fluorouracilo y doxorubicina que inducen la apoptosis. En las células neoplásicas 4-6; pero debido a la necesidad de seguir encontrando alternativas para el tratamiento del cáncer, se han buscado a través de los datos etnomédicos, plantas medicinales que puedan tener alguna actividad antitumoral, para identificar posteriormente sus sustancias activas 7-8.

Dentro de este grupo de plantas, en la medicina tradicional peruana, se reconoce a las hojas de Annona muricata y la raíz de Krameria lappacea como agentes antiinflamatorios, astringentes, hemostáticos y antidisentéricos 9-10.

La Annona muricata L (guanábana), de la familia Annonaceae, es un árbol pequeño y ramificado, con hojas gruesas y siempre verdes, brillantes en la parte inferior, de amplia distribución 10, en la cual se han encontrado más de 50 acetogeninas con diferentes actividades biológicas presentes en frutos, corteza y hojas; identificándose 21 acetogeninas citotóxicas en las hojas 11.

Se ha evaluado la actividad citotóxica in Vitro de los extractos de la Annona muricata contra diversas líneas celulares tumorales como el carcinoma pancreático línea PAKA-2 12 , cáncer prostático línea PC-3 13 , carcinoma pulmonar(A-549), adenocarcinoma de colon(HT-29), carcinoma de mama(MCF-7), carcinoma epidermoide(KB), células HepG2 o células de hepatoma humano 14. Su actividad citotóxica se podría explicar por la presencia de la uvaricina, que es una acetogenina que estaría inhibiendo la enzima NADH, ubiquinona oxidoreductasa o complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial 15.

La Krameria lappacea (ratania) clasificada en una pequeña familia monotípica emparentada con las Polygalaceae; es un subarbusto con flores rojas que crece en la altitud de Perú a Chile, se emplea por sus órganos subterráneos desecados (raíces), generalmente fragmentados y cocidos para uso antiinflamatorio 10.

Los metabolitos secundarios presentes en estas plantas entre ellos los compuestos fenólicos (flavonoides, ácidos fenólicos y taninos), son la categoría más grande de compuestos ampliamente distribuidos en el reino vegetal, son biológicamente activos y considerados como potenciales agentes quimiopreventivos del cáncer 16-17.

Los estudios fitoquímicos indican que al asociar Annona muricata más Krameria lappacea se incrementa el número de compuestos fenólicos y triterpenoides, ambos con diferente estructura química 18, por lo que se plantea que al asociarlas se dispondría de un extracto rico en estos compuestos, que estarían coadyuvando en la actividad citotóxica.

Por lo tanto, el objetivo de la presente investigación fue determinar la actividad citotóxica de las fracciones procedentes de la combinación 1:1 del extracto etanólico de hojas Annona muricata L (guanábana) y el extracto acuoso atomizado de raíz Krameria lappacea (ratania) en cultivos de líneas celulares cancerosas MCF-7: células cancerosas de glándula mamaria; H-460: cé-lulas cancerosas de pulmón; y SF-268: células cancerosas del sistema nervioso central.

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIAL DE ESTUDIO

Las hojas de Annona muricata L (guanábana) fueron recolectadas del caserío de San José Bajo del distrito de Santiago de Cao, provincia de Ascope, departamento La Libertad; en tanto que la raíz de Kramería lappacea (Dombey) Burdet & B. Simpson (ratania) de la zona agrícola de Huacho, departamento de Lima; para la posición taxonómica de ambas plantas se tuvo en cuenta el sistema de clasificación de Cronquist (1988), y fue realizada en el Herbario San Marcos del Museo De Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Estudios Fitoquímicos 19,20 

Preparación del extracto alcohólico de hojas de Annona muricata. Se preparó según la técnica de maceración etanólica, se maceró en 10 L de etanol cinco kilos hojas secas y pulverizadas, durante ocho días al cabo del cual se filtró obteniéndose la solución etanólica que se concentró a sequedad en estufa con temperatura regulable (<40 ºC) y se obtuvo el extracto etanólico seco.

Preparación del extracto acuoso de la raíz de Krameria lappacea. Cinco kilos de raíz seca, pulverizadas se maceró con agua destilada fría por 24 horas al cabo del cual se filtró obteniéndose una solución acuosa que se concentró a sequedad a estufa con temperatura regulable ( <40 ºC) y se obtuvo el extracto acuoso seco.

Marcha Fitoquímica 19,20

Cada reacción de identificación de metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico seco se realizó con los reactivos específicos, los resultados se mostraron indicando presencia o ausencia del metabolito: 5 mg de extracto problema con 5 gts de reactivos.

Cromatografía en capa fina. Se usó como muestra problema el extracto etanólico seco F1; para la fase fija el silicagel G 60, para la fase móvil: cloroformo:metanol (3:1); y como reveladores: luz visible, luz UV, reactivo de Dragendorff, H 2 SO 4 al 50% y FeCl 3.

Cromatografía en columna rápida. Se usó solventes de polaridad creciente: n-hexano, cloroformo, metanol y agua destilada, para fraccionar el extracto etanólico total y separar metabolitos afines y poder relacionar estructura química con actividad farmacológica de cada subextracto. 

Cromatografía en capa fina preparativa. Se usó esta técnica fisicoquímica para purificar y aislar metabolitos secundarios de mayor concentración en los subextractos.

Fraccionamiento del extracto Metanólico de la asociación 1:1 del extracto Etanolico de las hojas de Annona muricata más el extracto acuoso de la raíz de Krameria lappacea

Se pesaron cinco gramos de muestra y se disolvieron en cantidad suficiente de metanol. Se preparó una columna con 150 g de silicagel en hexano CH2Cl2 (1:1). Se corrió la muestra en la columna cromatográfica de 50 cm de longitud empleando los siguientes sistemas de elusión de polaridad creciente, obteniéndose 186 fracciones:

1. Diclorometano CH2Cl2 de (1- 44)
2. Diclorometano: Acetato de Etilo CH2Cl2: EtOAc (1:1) de (45 - 153)
3. 3. CHCl3: MeOH (1:1) de (154 - 186)

Ensayo en cultivo celular

La actividad citotóxica fue determinada de acuerdo con el método de Monks et al.21,22 . El cual evalúa la citotoxidad de las muestras en tres líneas celulares: cáncer de glándula mamaria (MCF-7), cáncer de pulmón (H-460) y cáncer del sistema nervioso central (SF268), proporcionadas por el Instituto Nacional del Cáncer de Washington.

Cada línea celular fue inoculada en microplatos de 96 posillos e incubada por 24 horas a 37 o C con 5% CO 2. Al cabo de las 24 horas se adicionaron las muestras [el extracto etanólico de las hojas Annona muricata L (A), el extracto acuoso atomizado de la raíz de Krameria lappacea (K), las fracciones 2 a la 83 procedentes de la asociación de los extractos (1:1) de Annona más Krameria (M); y como patrón la adriamicina], luego se incubó por 48 horas.

Transcurridas las 48 horas se retiraron los microplatos de la incubadora, se dejaron reposar por cinco minutos y se realizó la fijación de las células con ácido tricloroacético. Subsecuentemente se tiñeron los microplatos con una solución de sulforodamina por 15 minutos, luego se enjuagaron con ácido acético 1% y se secaron al aire.

Finalmente se adicionó Tris base 10mM a cada posillo del microplato y se colocó en el lector de platos ELISA (Bio-Tek Instruments, Inc. Modelo ELX-800). Todas las fracciones fueron ensayadas en duplicado.

Aquellas fracciones que presentaron un porcentaje de crecimiento de células cancerosas (%G) <50% en alguna de las tres líneas celulares fueron ensayadas nuevamente a cinco concentraciones, para determinar finalmente la GI 50 (concentración a la cual se inhibe el 50% del crecimiento de las células cancerosas) de éstas. Se consideraron activas aquellas fracciones con una GI 50 <10 µg/mL.

ANÁLISIS DE DATOS

Los datos obtenidos fueron introducidos mediante el programa KC Junior a una hoja de Excel ® para así determinar los valores de porcentaje de crecimiento de las células cancerosas %G y la concentración a la cual se inhibió el 50% del crecimiento de las células cancerosas GI 50.

Resultados

Estudio fitoquímico

El estudio fitoquímico de Annona muricata y Krameria lappacea permitió la separación de 147 fracciones, siendo evaluadas solamente las 83 primeras por mayor cantidad disponible; las pruebas de caracterización e identificación revelaron que el extracto metanólico de la asociación de las hojas de Annona muricata L más la raíz de Krameria lappacea, contiene en gran cantidad: saponinas triterpenoides, flavonoides, taninos, alcaloides y quinonas, estando ausentes las cumarinas; en las fracciones 7 - 17 se detectaron presencia de terpenoides y saponinas triterpénicas; en las fracciones 34 a 83 se puede esperar la presencia de flavonoides, taninos, alcaloides (Tabla 1 y 2).

 

 

Estudio in vitro

Al analizar el extracto etanólico de las hojas Annona muricata L, el extracto acuoso atomizado de la raíz de Krameria lappacea, la combinación (mezcla 1:1) de ambos extractos (Annona más Krameria) y las fracciones 2 a la 83 a una concentración única de 10 µg/mL en las líneas celulares MCF-7 (cáncer de glándula mamaria), H-460 (cáncer de pulmón) y SF-268 (cáncer de sistema nervioso central), se observó que únicamente la fracción 7-17 mostró un porcentaje de crecimiento de las células cancerosas (%G) menor de 50% (Tabla 3).

 

Se determinó la GI 50 de las fracciones 7-17 de la mezcla de A + K para las tres líneas celulares cancerosas, resultando para MCF-7 en 1,6 µg/mL, H-460 en 1,4 µg/ mL y para SF-268 en 1,4 µg/mL.

Discusión

Se evidenció que sólo las fracciones 7 a 17 procedentes de la asociación del extracto etanólico de hojas de Annona muricata L (guanábana) y el extracto acuoso atomizado de la raíz de Krameria lappacea (ratania) tuvieron efecto citotóxico in vitro frente a las líneas celulares de cáncer de glándulas mamarias, pulmón y sistema nervioso (Tabla 3), posiblemente por la presencia de terpenoides y saponinas (Tabla 2).

La asociación de las dos plantas es importante porque ha permitido disponer de un extracto vegetal rico en compuestos fenólicos y triterpenoides 18 , y por fraccionamiento (Tabla 2) los terpenoides y saponinas están presentes en las fracciones 7-17, las cuales fueron activas frente a las líneas celulares de cáncer de mama, pulmón y sistema nervioso; asimismo se observa que al usar por separado el extracto de Annona muricata y Krameria lappacea eran inactivos, lo cual contrasta con estudios anteriores, en los que se demuestra que los extractos de hoja de guanábana son activos frente a líneas de células cancerígenas 11-14.

La bioactividad observada sobre el cultivo celular de células tumorales en la presente investigación se explicaría posiblemente por la presencia de terpenoides y saponinas, metabolitos secundarios que expresan actividad citotóxica como a continuación se detalla.

Los terpenoides constituyen el más amplio conjunto conocido como metabolitos secundarios de los vegetales, se clasifican en monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos, esteroides, carotenos, poliisoprenos 23. Así se han evaluado ha diversos compuestos procedentes de plantas demostrando su potencial anticancerígeno 24 , como el caso del ácido kaurenoic un diterpeno aislado de la oleoresina de Copaifera langsdorffii, que demostró inhibir in vitro el crecimiento de células leucémicas, cáncer de mama y cáncer de colon 25.

Las saponinas constituyen un amplio grupo de heterósidos muy frecuentes en los vegetales 23 con propiedad antimicótica, antibacteriana antiinflamatoria, antioxidante, anticancerígena 26 . Existe una familia de saponinas triterpenoides (avecina de Acacia victoriae) que disminuye la proliferación celular del tumor e in-duce apoptosis 27 ; también inhiben moléculas proinflamatorias tales como sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) y la expresión de la ciclooxigenasa 2 (COX2)28 ; otros derivados como los ginsenósidos de las hojas de Panax ginseng muestran propiedades antiinflamatorias 29 e inhiben la invasión y metástasis de células tumorales 30 y el desarrollo del tumor 31; las saponinas de la soya suprimen el crecimiento in Vitro de células de adenocarcinoma de colón 32 ; nuevas saponinas triterpenoides procedentes de Albizia julibrissin Durazz han mostrado una significante actividad in vitro 33 ; protoneodioscina (NSC-698789) es una saponina del rizoma de Dioscorea collettii var. hypoglauca (Dioscoreaceae), evidenció actividad citotóxica contra líneas celulares de leucemia, sistema nervioso central, y de próstata 34.

Se reporta actividad citotóxica in vitro para algunas especies de las Dioscoreaceae como Dioscorea birmanica Prain & Burkill y Dioscorea membranacea Pierre ex Prain & Burkill, siendo el extracto acuoso más efectivo contra líneas celulares del cáncer de mama, colon y pulmón, pero menos en células normales (IC 50 ) 5,5, 15,6, 16,3 y 78,4 mg/ml, respectivamente), según Itharat et al 35 ; posiblemente por la presencia de saponinas en el género dioscórea, metabolitos secundarios que han evidenciado actividad citotóxica 36-38.

Los modelos en investigación de la citotoxicidad in vitro proporcionan datos preliminares importantes a los extractos selectos de plantas, ayudan a proyectar para este caso en particular de la investigación, características antineoplásicas potenciales para el trabajo futuro 39,40 ; en una fase siguiente de investigación debería ser la verificación de la eficacia utilizando animales de experimentación, en donde además debería buscarse la seguridad de los productos, para seguidamente hacer estudios de investigación clínica en caso se encuentren resultados positivos.

Se recomienda realizar estudios fitoquímicos de mayor profundidad mediante técnicas modernas que permitan la separación de compuestos más puros, su identificación, y la evaluación de su actividad; así mismo, se debería continuar buscando mayores evidencias mediante el uso de animales de experimentación, que corroboren el efecto in vitro hallado.

En conclusión, las fracciones 7 - 24 se detectaron presencia de terpenoides y saponinas triterpénicas; y en las otras fracciones se observa la presencia de flavonoides, taninos. Las fracciones 7 a 17 procedentes de la asociación de Annona más Krameria mostraron ser efectivas frente a los cultivos de células cancerosas de glándula mamaria (MCF-7), pulmón (H-460) y sistema nervioso central (SF-268).

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Correspondencia: Jorge Luis Arroyo Acevedo. Facultad de Medicina Humana, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
Dirección: Calle Acuarios 104 Urbanización Naval. Ventanilla, Callao.
Teléfono: (511) 553-4736
Correo electrónico: jorgeluis_arroyoacevedo@yahoo.es

 

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