SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.23 issue3Programas de investigación: una alternativa integral e incluyente para enfrentar los problemas de salud PúblicaEvaluación del efecto residual del Temephos en larvas de Aedes aegypti en Lima, Perú author indexsubject indexarticles search
Home Pagealphabetic serial listing  

Services on Demand

Journal

Article

Indicators

  • Have no cited articlesCited by SciELO

Related links

  • Have no similar articlesSimilars in SciELO

Share


Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica

Print version ISSN 1726-4634

Rev. perú. med. exp. salud publica vol.23 no.3 Lima July-set. 2006

 

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Identificación molecular de mutaciones puntuales relacionadas con resistencia a drogas en VIH-1 de pacientes peruanos

 

Carlos Yabar V1; Pedro Chavez H2; Zoila Varas H3; Rafael Rodriguez B3

1 Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular, Centro Nacional de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú. 
2 Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
3 Programa Militar de Enfermedades de Transmisión Sexual y SIDA (PROMETSS), Hospital Militar Central. Lima, Perú.

 


 

RESUMEN

Objetivo: Identificar mutaciones puntuales relacionadas con resistencia a drogas en VIH-1 de pacientes peruanos. Materiales y metodos: Se seleccionaron 11 muestras de VIH provenientes de sangre total de sujetos con tratamiento antirretroviral (ARV). Posteriormente se realizo la optimizacion de la amplificacion de 337 pb del gen de la transcriptasa reversa (tr) y 377 pb de todo el gen de la proteasa (prt). Los productos de PCR fueron secuenciados directamente para el analisis de mutaciones de resistencia. Las secuencias finales fueron analizadas en programas de analisis de mutaciones de la HIV Drug Resistance Database de la Universidad de Stanford. mutaciones de la HIV Drug Resistance Database de la Universidad de Stanford. Resultados: La optimizacion de la concentracion de ADN (2,5 ng / µL) asi como la concentracion de magnesio (4 mM) fueron factores criticos para la amplificacion de la tr y la prt respectivamente. De otro lado, el analisis de secuencia revelo la presencia de las mutaciones T215Y y la M184V en tr, implicadas en conferir resistencia a zidovudina (AZT) y estavudina (D4T) asi como a lamivudina (3TC) y emtricitabina (FTC) respectivamente. En prt se observaron las mutaciones D30N y N88D implicadas en conferir resistencia a nelfinavir (NFV). Es importante senalar que solo tres muestras de VIH-1 presentaron mutaciones de resistencia, las demas mostraron mutaciones compensatorias. Conclusiones: Se demuestra la existencia de mutaciones de resistencia a ARV a nivel de tr y prt de VIH-1 en sujetos peruanos que reciben terapia TARGA. Se requieren de mayores estudios para establecer un perfil de resistencia a ARV en la poblacion peruana.

Palabras clave: VIH; Mutacion puntual; Transcriptasa reversa; Proteasa; Genotipificacion (fuente: DeCS BIREME).

 


 

ABSTRACT

Objective: Identify point mutations related to HIV-1 drug resistance in Peruvian patients. Materials and methods: A total of 11 HIV-1 positive samples were selected, all were obtained from the whole blood of subjects undergoing anti-retro viral (ARV) treatment. 337 gene base pairs (bp) from reverse transcriptase (rt) and 377 bp from the whole protease gene (prt) were optimized. PCR products were sequenced directly for the analysis of resistance mutations. Final sequences were analyzed in the University of Stanford HIV Drug Resistance Database programs. Results: Optimization of DNA concentration (2,5 ng / µL), as well as magnesium concentration (4mM) were critical factors for rt and prt amplification, respectively. On the other hand, the sequence analysis showed the presence of T215Y and M184V mutations in rt , implicated in zidovudine (AZT), stavudine (D4T), lamivudina (3TC) and emtricitabine (FTC) resistance, respectively. In prt, mutations D30N and N88D were observed. These mutations have been implicated in nelfinavir (NFV) resistance. It must be highlighted that only three HIV-1 positive samples showed resistance mutations. The remaining samples showed compensatory mutations. Conclusions: This study demonstrated the existence of ARV resistance mutations at the HIV-1 rt and prt levels in Peruvian patients undergoing HAART therapy. Further studies are required to establish an ARV resistance pattern in the Peruvian population. 

Key words: HIV; Point mutation; Reverse transcriptase; Protease; Genotyping (source: DeCS BIREME).

 


 

INTRODUCCIÓN

El SIDA ha cobrado millones de víctima humanas en la última década. Los últimos informes afirman que sólo en el 2005, cerca de 3,1 millones de personas alrededor del mundo han muerto de SIDA, de los cuales aproximadamente 570 mil fueron menores de 15 años. Los casos nuevos hasta diciembre de 2005 llegaron casi a los cinco millones de personas entre adultos y niños1.

En nuestro país, se han notificado hasta la fecha más de 24 mil casos confirmados de VIH y 17 mil por SIDA, de los cuales cinco mil ya fallecieron. Hasta diciembre de 2005 se reportaron más de dos mil casos nuevos de VIH1-3.

Aunque no existe hasta el momento un tratamiento que elimine totalmente la presencia del VIH en sangre, la administración de terapia antirretroviral permite disminuir la carga viral incrementando la población de células CD4/CD8 y en consecuencia restablece el estado de salud del paciente. Sin embargo, también selecciona en sangre especies de VIH que son básicamente mutantes resistentes a una o varias drogas generando con el tiempo resistencia a la terapia4. Para resolver ese problema es necesario realizar un cambio de terapia con conocimiento del tipo de resistencia que presenta el VIH-1 del paciente a fin de administrarle el medicamento apropiado.

El análisis de cepas de VIH resistentes a los antirretrovirales (ARV) mediante cultivo viral en células (técnica conocida como fenotipificación) se presenta como una solución a dicho problema, pero se requiere de laboratorios de bioseguridad 3 y 4, un adecuado entrenamiento y alto presupuesto para el mantenimiento de la técnica. Además, involucra la conservación de cepas estándares de VIH resistentes y sensibles así como también líneas celulares y manejo de equipos sofisticados5.

Recientemente la detección de mutaciones puntuales de resistencia a los ARV en VIH mediante la técnica de genotipificación ha aparecido como una nueva alternativa para la detección rápida y específica de resistencia a los ARV, siendo su uso muy frecuente en la práctica clínica4,5.

La genotipificación presenta la capacidad de detectar la resistencia a múltiples drogas a través del análisis de mutaciones que en muchos casos los ensayos de fenotipificación quedan limitados. A ello añadimos las ventajas económicas de estas pruebas moleculares en comparación con la fenotipificación y el tiempo relativamente corto que se emplea6. 

Actualmente la técnica se viene usando en países desarrollados como rutina; sin embargo, en países de Sudamérica el uso de la genotipificación es limitado. Argentina fue el primer país en emprender un estudio para la detección molecular de resistencia a los ARV en VIH-1 mediante el uso del kit comercial ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System Version 2 con la aprobación del Ministerio de Salud de su país (Applied Biosystems, 2000)7,8. Brasil también implementó este sistema en el 2001 con aprobación del Ministerio de Salud estableciendo la Red Nacional de Genotipificación de VIH o RENAGENO9,10. En Chile se viene trabajando con un sistema de genotipificación “hecho en casa” con resultados muy similares a los obtenidos usando kits comerciales (comunicación personal del Dr. Jorge Fernández Ordenes, Instituto Nacional de Salud Pública de Chile, 2003).

En el Perú aún no se ha informado sobre estudios destinados a la identificación de mutaciones puntuales relacionados con resistencia a los ARV en VIH-1. Sin embargo, existen algunas entidades que vienen aplicando la genotipificación de VIH mediante kits comerciales, aunque de manera muy restringida, debido al alto costo de los reactivos. En la generalidad de los casos, muchos hospitales, instituciones y clínicas particulares realizan envíos de muestras al extranjero para ser analizadas mediante genotipificación.

Debido a la falta de un sistema que permita identificar a nivel molecular cepas de VIH-1 resistentes a los ARV en nuestro medio, planteamos el desarrollo de este estudio con el objetivo de identificar los cambios genéticos o mutaciones puntuales del VIH-1 asociados con la resistencia a los ARV. 

MATERIALES Y MÉTODOS

Se desarrolló un estudio tipo serie de casos entre los pacientes atendidos en el Programa Militar de Enfermedades de Transmisión Sexual y SIDA (PROMETSS) del Hospital Militar Central (HMC) durante octubre de 2003 y marzo de 2004.

Se incluyeron pacientes de ambos sexos, mayores de 18 años que muestran carga viral con tendencia estable y superior a 400 copias/mL (valor que representa el límite mínimo de copias que detecta el Kit Amplicor HIV-1) con esquema de tratamiento ARV definido; se excluyeron a los sujetos inmunosuprimidos sin causa conocida y los que no aceptaron participar del estudio.

La población de estudio fue de 25 pacientes, sin embargo se seleccionó una muestra de once sujetos, por conveniencia. Estos pacientes después de aceptar suparticipacion en el estudio firmaron un consentimiento informado y llenaron una ficha asistida para recabar informacion respecto a sus datos personales (iniciales de sus nombres y codigos para su identificacion) y el tipo de tratamiento ARV.

Para la toma de muestra, se realizo la extraccion de 3 mL de sangre venosa en tubos al vacio con anticoagulante EDTA K3 mediante puncion en el pliegue del codo derecho. Las muestras fueron colectadas en cuatro tubos para: 1) analisis del hemograma, 2) recuento de linfocitos CD4, 3) carga viral para VIH y 4) PCR y secuenciamiento de ADN.

Para la extraccion de ADN total se utilizo el kit Qiamp DNA Mini (QIAGEN). El procedimiento fue llevado a cabo segun recomendaciones del fabricante mezclando 200µL de sangre con 20
µL de proteasa en un tubo de 1,5 mL. Posteriormente, la mezcla fue incubada a 56 °C por diez minutos en bano Maria y luego sometida a procesos de lavado y centrifugacion a 8000 rpm por un minuto, para remover las impurezas. Finalmente el ADN genomico fue purificado con 150 µL de agua desionizada en tubos de 1,5 mL, y almacenados a -20°C para su posterior utilizacion.

El material genetico resuspendido en agua fue cuantificado usando un espectrofotometro de luz ultravioleta Spectronic 21D. Para tal efecto se hizo una dilucion final de material genetico en NaCl 0,1 M (proporcion 1: 50) colocando la mezcla total en una cubeta de cuarzo (Shimadru). La lectura fue realizada a 260 nm en presencia de luz UV considerando que una densidad optica (DO) es equivalente a 50
µg / mL de ADN.

Todos los procedimientos de PCR fueron realizados usando el termociclador Perkin Elmer Applied Biosystems modelo 9600. Para la amplificacion de cada gen se realizo un Heminested-PCR el cual consistio en el uso de los iniciadores o primers especificos NE1 y pol A (primer round), y B y pol A (segundo round) para la amplificacion final de una region de 339 pb del gen tr segun las condiciones reportadas por Wilson et al.11 con algunas modificaciones. Asimismo se amplifico una region de 377 pb que incluyo todo el gen prt (297 pb) usando los primers PT-1 y PT-2 (primer round) y PT-3 y PT-2 (segundo round) de acuerdo con las condiciones reportadas por Boden et al.12 con algunas modificaciones.

Para optimizar la amplificacion de los genes de VIH- 1 de interes, se realizaron curvas de concentracion de cada componente de la reaccion. Estas curvas se llevaron a cabo considerando los componentes mas criticos del PCR, entre los cuales se mencionan: 

Curva de magnesio. Se utilizaron concentraciones de 0, 1, 2, 3 y 4 mM de magnesio para cada reaccion de PCR.

Curva de material genetico (ADN y ARN total). Para lo cual fue importante calcular la concentracion de material genetico de cada muestra y posteriormente realizar curvas de concentracion considerando valores de 0, 1, 2, 3, 4 y 5 ng.

Curva de volumen de ADN de PCR del primer round. Fue usado como molde en el segundo round (Heminested PCR) usando diluciones desde 1:10 hasta cantidades concentradas de producto de PCR de 5 µL.

Curva de temperatura de alineamiento. Por la cual se probaron distintos valores de temperatura de alineamiento (TA) desde 50 °C hasta 60 °C.

Para realizar el secuenciamiento de los genes rt y prt de VIH se uso un volumen de 4
µL (aproximadamente 200 ng / µL) de producto de PCR purificado por columna (kit Wizard PCR Prep, Promega) el cual fue sometido a una reaccion de secuenciamiento por el metodo de Sanger et al.13 siguiendo el protocolo establecido por los fabricantes del kit de secuenciamiento termo sequenase Cy5 Dye Terminador Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences). La reaccion de secuenciamiento tanto para la tr como para la prt se llevo a cabo usando el termociclador PE Applied Biosystems. Las condiciones de secuenciamiento de la tr y prt fueron las mismas que durante el PCR con excepcion de la temperatura de alineamiento para la amplificacion de la prt donde se uso una temperatura de 55 °C por un minuto durante 35 ciclos. Una vez finalizada la reaccion, el producto de PCR fue resuspendido en 6 µL de formamida desionizada. La mezcla final fue sometida a electroforesis en un secuenciador automatico ALF Express usando 1500 voltios por 700 minutos. Los datos de secuenciamiento fueron almacenados directamente en la base de datos del programa ALFwinTM Sequense Analyser 2.10.

Para el analisis de secuencias de ADN, se realizo la alineacion de secuencias mediante el programa Alignment (http://www.ncbi.nih.gov/projects/genotyping/alignpage.cgi) el cual comparo las secuencias de nucleotidos de cada una de las muestras con genomas completos de cepas de referencia de VIH reportadas en el banco de genes. Cada una de las ambiguedades o nucleotidos indefinidos fueron corregidos de acuerdo con secuencias de referencia y a los valores de las curvas de cada nucleotido usando el programa ALFwinTM Sequense Analyser 2,10. Las secuencias de cada una de las muestras fueron posteriormente realineadas con las secuencias dereferencia de VIH previamente caracterizadas y reportadas en el banco de genes usando el programa ClustalW version 1,8 (www.ebi.ac.uk/clustalw/).

Para confirmar el correcto marco de lectura de las secuencias obtenidas se realizo la traduccion de nucleotidos a aminoacidos usando seis marcos de lectura diferentes mediante el programa Translate del servidor Expasy tool (www.expasy.org/tools/).

Previo al analisis de mutaciones se procedio a realizar la evaluacion de control de calidad de todas las secuencias con el fin de descartar alguna contaminacion durante la edicion, presencia de ambiguedades, codones de detencion o contaminacion cruzada entre las muestras. Para tal fin se recurrio a las especificaciones de control de calidad de secuencia recomendada por Los Alamos (www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/CONTAM/contam_main.html) para lo cual se realizo una alineacion de secuencias con el programa ClustalW version 1,8 y el analisis filogenetico mediante el programa Mega version 3,1 por el metodo Neighbor-Joining usando el modelo de substitucion de dos parametros de Kimura con un boostrap de 1000 replicas y una distribucion gamma de 0,5.

Para el analisis de las mutaciones de resistencia se utilizo el servidor HIV Drug Resistance Database de la Universidad de Stanford (http://hivdb.stanford.edu/), del cual se uso el programa HIV db Drug Resistance Algorithm beta test (http://hivdb6.stanford.edu/asi/deployed/hiv_central. pl?program=hivdb). Este programa permite encontrar mutaciones relacionadas a mas de 17 ARV diferentes.

Tambien se uso el programa HIV seq (http://hivdb6.stanford. edu/asi/deployed/hiv_central.pl?program=hivseq& action=showSequenceForm), el cual permite comparar nuevas secuencias con una base de datos de mutaciones de resistencia. El analisis de mutaciones fue completado y confirmado mediante el programa Geno2pheno (http://www.geno2pheno.org/cgi-bin/geno2pheno.pl) y el programa ADRA (Antiviral Drug Resistance Analysis tool) incluido en la base de datos de Los Alamos (www. hiv.lanl.gov/content/hiv-db/ADRA/adra.html).

RESULTADOS

RECUENTO DE CD4 Y CARGA VIRAL

En los once sujetos seleccionados se evidencio una aparente resistencia al tratamiento ARV con mas de cuatro mil copias/mL durante un tratamiento prolongado entre dos meses hasta seis anos. De manera importante se observo una persistente carga viral (11 mil copias/ mL) en un paciente con antecedentes de hasta dos esquemas diferentes de tratamiento ARV (Tabla 1). 

 

AMPLIFICACION DE tr Y prt

De acuerdo con los resultados obtenidos, el tamano del producto de amplificacion de la tr fue de 339 pb, mientras que en el caso de la prt se logro visualizar una banda de 377 pb (Figuras 1 y 2). Durante el proceso de estandarizacion de PCR se observo que la concentracion de ADN (2,5 ng / µL) fue uno de los factores mas importantes para lograr la amplificacion de la tr.En el caso de la prt, se observo que la concentracion de magnesio (4mM) y la utilizacion de los primers alternativos vasRVP3 y sAV84 (1pmol / µL) fueron factores relevantes para lograr la amplificacion del fragmento esperado. Finalmente es importante senalar que la sensibilidad del PCR vario para cada uno de los genes, para el caso de la tr fue de 100% mientras que para la prt fue de 91%.

 

 

ANALISIS FILOGENETICO PARA LA DETERMINACION DE CONTAMINACION CRUZADA ENTRE CEPAS DE VIH 

Para descartar la presencia de contaminacion cruzada entre las cepas analizadas se realizo el analisis filogenetico usando 281 pb de tr y 306 pb de prt sin considerar secuencias de los primers. De acuerdo con los resultados, se observo que ninguna de las secuencias analizadas formo linajes filogeneticos estrechamente relacionados tal como ocurre entre secuencias de una misma especie (Figura 3). 

 

ANALISIS PARA LA DISCRIMINACION DE MUTACIONES ASOCIADAS CON DROGAS

Respecto a la tr los datos revelaron que las muestras CO2 y CO25 presentaron mutaciones importantes de resistencia a ARV. En el caso de CO2 se observaron las mutaciones T215Y y la M184V. La primera (T215Y) esta altamente implicada en conferir resistencia a zidovudina (AZT) y estavudina (D4T) y en un nivel bajo de resistencia a didanosina (DDI), tenofovir (TDF) y abacavir (ABC).

La segunda mutación M184V confiere un alto nivel de resistencia a lamivudina (3TC) y emtricitabina (FTC), y una probable resistencia en bajo nivel a DDI y ABC.

De otro lado, CO25 mostró la mutación M184I, la cual actúa de manera similar a M184V confiriendo resistencia a los mismos ARV. Todas las demás muestras mostraron cambios no directamente asociados con resistencia a ARV para la tr (Tabla 2).

Para el caso de la prt, la muestra CO2 presentó las mutaciones D30N y N88D las cuales están directamente relacionadas con resistencia a nelfinavir (NFV) un inhibidor de proteasa (IP). En el caso de CO7 se observó la mutación V32I la cual confiere resistencia en asociación con otras mutaciones a indinavir (IDV), ritonavir (RTV), amprenavir (APV) y lopinavir (LPV). Es de resaltar que la muestra CO7 proviene de un paciente que nunca recibió alguna droga frente a IP. Un caso similar también se observó en CO19 donde se observaron diferentes mutaciones menores relacionadas con resistencia frente a IP.

Es importante señalar que al igual que en tr, otras mutaciones inusuales también han sido observadas en esta región de la prt principalmente en CO2, CO5, CO7 y CO22.

Por último cabe resaltar que tanto para rt como para prt los datos de secuencia de las muestras CO18, CO19 y CO21 no mostraron mutaciones directamente implicadas en resistencia a ARV; sin embargo, los datos de carga viral de los pacientes fueron relativamente altos (entre 11000 a 750000 copias / mL) con aparente resistencia a su esquema de terapia ARV.

 

DISCUSIÓN

En el presente estudio hemos analizado dos regiones genéticas correspondientes a los genes rt y prt con el fin de identificar mutaciones de resistencia en muestras de VIH de sujetos con tratamiento previo. Aunque las condiciones de amplificación de ambos genes ya han sido reportadas11,12, fue necesario realizar la optimización del heminested PCR de acuerdo con las condiciones de nuestro laboratorio. La estandarización de la concentración de parámetros críticos como ADN y magnesio permitió la amplificación de todas las muestras excepto la porción de prt de CO14. Al respecto es importante señalar que una de las causas más probables que evitó la amplificación de prt fue la presencia de mutaciones en el sitio de alineación de los primers que alteraron la secuencia de reconocimiento. Aunque también es probable que la falla de amplificación haya ocurrido por la presencia de algún inhibidor del sistema de PCR, la amplificación de tr de CO14 demuestra que no existió ningún tipo de inhibidor. En ese sentido, el uso de primers alternativos con bases modificadas podría solucionar el problema de amplificación en esta muestra y de manera general para nuevas muestras de VIH en futuros ensayos.

De otro lado, hemos identificado mutaciones puntuales relacionadas con resistencia a los ARV en sujetos que reciben terapia ARV. Muchas de estas mutaciones tuvieron relación directa con el tratamiento ARV del paciente. Tal es el caso de las mutaciones T215Y y M184V las cuales fueron encontradas en la cepa CO2 proveniente de un paciente tratado con AZT y 3TC. De manera interesante, ambas mutaciones han sido relacionadas con una alta resistencia a AZT y 3TC14. Es importante señalar que este mismo paciente de acuerdo con su historial clínico recibió tratamiento con NFV, un potente IP. Al hacer el análisis de prt de CO2, se encontraron las mutaciones D30N y N88D las cuales están directamente relacionadas con alta resistencia a NFV15. Estos datos en conjunto indican que la cepa CO2 que infecta al paciente en mención presenta mutaciones de resistencia frente a todo el esquema de terapia ARV, lo cual concuerda con la alta carga viral (20638 copias / mL) que presenta pese a los dos años de tratamiento continuo. Estos datos sugieren la necesidad de un cambio de esquema de medicamento apropiado.

También se ha logrado identificar la mutación M184I en el paciente CO25, la cual también ha sido relacionada con una alta resistencia a 3TC. En este caso, el paciente también recibió terapia con 3TC durante tres meses. Sin embargo, al analizar otras substituciones en la tr del VIH-1 del paciente CO25, se detectaron mutaciones secundarias relacionadas con inhibidores no nucleósidos de transcriptasa reversa (INNTR) medicamentos que no figuran en la historia de tratamiento del paciente. De manera similar a este último caso, hubo dos pacientes que nunca recibieron tratamiento frente a IP, sin embargo, se observaron mutaciones de resistencia a nivel de prt como es el caso de CO7 y CO19.

La presencia de mutaciones no relacionadas con el tipo de tratamiento ARV que recibieron los pacientes sugieren dos posibilidades: 1) una probable contaminación cruzada entre las muestras durante los procedimientos de amplificación de los genes, ó 2) la presencia de resistencia primaria.

Para descartar la primera posibilidad se realizó un análisis de identidad genética y análisis filogenético, el cual demostró que ninguna de las muestras analizadas tenía más de 80% de identidad ni tampoco similar distancia genética (Figura 3). Estos datos demuestran desde el punto de vista filogenético, que ninguna de las cepas de VIH fue 100% idéntica, lo cual descarta cualquier probabilidad de contaminación cruzada.

Por tanto, las mutaciones de resistencia a un fármaco identificadas en los sujetos que nunca recibieron algún tratamiento relacionado sugiere la existencia de resistencia primaria. Es importante señalar que este tipo de casos ha sido recientemente reportado en sujetos que nunca recibieron terapia ARV16-18 señalando que la principal causa es la transmisión de cepas de VIH resistentes a los ARV proveniente de otro sujeto infectado. Aunque no se tienen datos relacionados con la conducta sexual de los pacientes, es probable que estos sujetos hayan sido reinfectados con cepas resistentes provenientes de sus parejas sexuales. 

De otro lado, se han identificado algunas mutaciones que no están directamente implicadas en conferir resistencia a los ARV conocidas como mutaciones compensatorias. Al respecto, es importante resaltar que las mutaciones compensatorias han sido implicadas en restaurar la capacidad replicativa del virus, la cual es afectada por la presencia de mutaciones mayores que confieren resistencia a los ARV19. En nuestro estudio hemos observado mutaciones compensatorias en todas las muestras analizadas tanto en rt como en prt. Sin embargo, en la mayoría de muestras con la excepción de CO2, CO7, CO22 y CO25 no hemos encontrado mutaciones mayores.

Debido a que sólo hemos considerado el análisis de la región codificante del dominio catalítico de la transcriptasa reversa11 no fue posible identificar otras mutaciones mayores localizadas en otras regiones de tr relacionadas con las mutaciones compensatorias. Por tanto, se requiere el análisis de toda la región que codifica la transcriptasa reversa con el fin de caracterizar posibles mutaciones mayores relacionadas con resistencia a los ARV.

Los datos mostrados en el presente estudio demuestran la presencia de mutaciones relacionadas con resistencia a los ARV en VIH-1 de sujetos con tratamiento. Al respecto, es importante mencionar que este el primer estudio que se realiza en sujetos peruanos a través de un sistema de genotipificación “hecho en casa”, el cual puede ser validado para su implementación en la vigilancia de resistencia a inhibidores de transcriptasa reversa y proteasa en el Perú. De otro lado, este sistema también puede ser usado de manera alternativa para la detección de resistencia primaria en sujetos vírgenes de tratamiento. Si bien el sistema de genotipificación reportado en este trabajo permite identificar mutaciones mayores de resistencia en VIH de manera rápida y sencilla, sólo se ha considerado el análisis de aproximadamente 28% de la tr. En consecuencia, se requiere hacer el análisis del gen completo a fin de contar con toda la información de las diferentes mutaciones que afectan a la transcriptasa reversa. Finalmente, es importante señalar que la población seleccionada en el estudio es pequeño y no representa a la población en general; sin embargo, los datos informados servirán de base para posteriores estudios en los cuales se considere una población mayor que permita establecer el perfil de resistencia a los ARV en la población peruana.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la participación de los técnicos de laboratorio Juana Choque Portilla y David García Neyra en la realización de las pruebas moleculares. Agradecemos también el apoyo científico del Blgo. Omar Cáceres Rey durante la amplificación y caracterización del gen de la transcriptasa reversa del VIH-1. Finalmente agradecemos a las biólogas Rose Mary Sagastegui y Ada Vivanco del Laboratorio de Referencia del COPRECOS por su apoyo en la determinación de células CD4 y carga viral.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Joint United Nation Programme on HIV/AIdS (UnAidS). AIDS epidemic update: December 2005. Geneva: UNAIDS/WHO; 2005. UNAIDS/05.19E        [ Links ]

2. Oficina General de Epidemiología. Boletín Epidemiológico Mensual, Diciembre 2005: Situación del VIH-SIDA en el Perú [documento en internet]. Fecha de acceso: marzo 2006. Disponible en: http://www.oge.sld.pe/vigilancia/vih/Boletin_2005/diciembre.pdf.        [ Links ]

3. Cabello R. La situación del VIH / SIDA en el Perú al año 2005 [documento en internet]. Lima: VIA LIBRE; 2005. fecha de acceso: marzo 2006. Disponible en: http://www.vialibre.org.pe/noticias/diamudia/Situvihsidadic2005.pdf.        [ Links ]

4. García-Lerma JG, Heneine W. Resistance of human immunodeficiency virus type 1 to reverse transcriptase and protease inhibitors: genotypic and phenotypic testing. J Clin Virol 2001; 21(3): 197-212.        [ Links ]

5. Hirsch MS, Conway B, D’Aquila Rt, Johnson VA, Brun- Vezinet F, Clotet B, et al. Antirretroviral drug resistance testing in adults with HIV infection. Implications for clinical management. JAMA 1998; 279(24): 1984-91.        [ Links ]

6. Simsock M, Sendi P, Ledergerber B, Keller T, Schupbach J, Battegay M, et al. A longitudinal analysis of healthcare costs after treatment optimization following genotypic antiretroviral resistance testing: does resistance testing pay off? Antivir Ther 2006; 11(3): 305-14.        [ Links ]

7. Applied Biosystems. Argentina approves applied Biosystems ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System Version 2 for diagnostic procedures. First country to approve ViroSeq kit for clinical use [página de internet]. California: Applied Biosystems; 2000. Fecha de acceso: marzo 2006. Disponible en www.appliedbiosystems.com/press_releases/argentina/.        [ Links ]

8. Avila MM, Pando MA, Carrion G, Peralta LM, Salomón H, Carrillo MG, et al. Two HIV-1 epidemics in Argentina: different genetic subtypes associated with different risk groups. J Acquir Immune Defic Syndr 2002; 29(4): 422-26.        [ Links ]

9. Dantas MC, Lima JN, Vitoria MA, teixeira PR, Costa- Filho RB, Grangeiro AL. Building up a national network for HIV genotyping test in Brazil. Int Conf AIDS 2002; 14: abstract Nº. B10188.        [ Links ]

10. Couto-Fernandez JC, Silva-de-Jesus C, Veloso-dos- Santos WG, Rachid M, Morgado MG. HIV-1 genotyping in Rio de Janeiro, Brazil: accessing HIV-1 subtyping and drug resistance mutations. Int Conf AIDS 2004; 15: abstract Nº. WePeB5749.        [ Links ]

11. Wilson JW, Bean P, Robins T, Graziano F, Persing DH. Comparative evaluation of three human immunodeficiency virus genotyping systems: the HIV-GenotypR Method, the HIV PRT GeneChip assay, and the HIV-1 RT line probe assay. J Clin Microbiol 2000; 38(8):3022-28.         [ Links ]

12. Boden D, Hurley A, Zhang L, Cao Y, Guo Y, Jones E, et al. HIV-1 drug resistance in newly infected individuals. JAMA 1999; 282(12):1135-41.        [ Links ]

13. Sanger F, nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977; 74(12): 5463-67.        [ Links ]

14. Nijhuis M, Schuurman R, De Jong D, van Leeuwen R, Lange J, Danner S, et al. Lamivudine-resistant human immunodeficiency virus type 1 variants (184V) require multiple amino acid changes to become co-resistant to zidovudine in vivo. J Infect Dis1997; 176(2): 398-405.        [ Links ]

15. Rhee SY, Fessel WJ, Zolopa AR, Hurley L, Liu T, Taylor J, et al. HIV-1 protease and reverse-transcriptase mutations: correlations with antiretroviral therapy in subtype B isolates and implications for drug-resistance surveillance. J Infect Dis 2005; 192(3): 456-65.        [ Links ]

16. Tozzi V, Corpolongo A, Bellagamba R, Narciso P. Managing patients with sexual transmission of drug-resistant HIV. Sex Health 2005; 2(3): 135-42.        [ Links ]

17. Cane PA. Stability of transmitted drug-resistant HIV-1 species. Curr Opin Infect Dis. 2005; 18(6): 537-42.        [ Links ]

18. Hicks C. Impact of HIV protease inhibitor resistance in treatment-naive populations in the United States. AIDS Read. 2005; 15(12):683-6, 689-90.        [ Links ]

19. Chen Z, LI Y, Schock HB, Hall D, Chen E, Kuo LC. Three-dimensional structure of a mutant HIV-1 protease displaying cross-resistance to all protease inhibitors in clinical trials. J Biol Chem 1995; 270(37): 21433-36.        [ Links ]

Correspondencia: Carlos Yábar Varas. Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular, Centro Nacional de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.
Dirección: Av. Defensores del Morro (ex Avenida Huaylas) 2268, Chorrillos. Lima 9.
Teléfono: (511) 251-6151 anexos 424 y 546.
Correo electrónico: cyabar@ins.gob.pe, bioyabar@yahoo.es

Creative Commons License All the contents of this journal, except where otherwise noted, is licensed under a Creative Commons Attribution License