ARTÍCULO ORIGINAL

 

Modelo experimental en el estudio de posibles principios activos antipalúdicos

 

Nelly Incio V¹; Pedro Álvarez F^2,3

¹ Laboratorio de Vacunas Bacterianas, Centro Nacional de Productos Biológicos. Instituto Nacional de Salud. Lima. Perú.
² Centro Nacional de Control de Calidad. Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.
³ Laboratorio de Investigación en Plantas Medicinales, Centro Nacional de Salud Intercultural. Instituto Nacional de Salud. Lima. Perú.

 

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RESUMEN

Objetivo: Contribuir a desarrollar un modelo experimental de bajo costo y con menor riesgo, evitando el empleo de suero humano, para el cultivo continuo de Plasmodium falciparum en eritrocitos humanos para estudios iniciales de plantas medicinales con probable acción antipalúdica. Materiales y métodos: Se siguió, en lo fundamental, la técnica descrita de Trager y Jensen, con pequeñas modificaciones como no emplear sangre heparinizada ni suero humano. En frascos de cultivo celular el paquete globular fue resuspendido en RPMI 1640 suplementado con Medium hepes y suero fetal bovino inactivado. La muestra de P. falciparum en un criotubo fue finalmente sembrada. El cultivo continuo fue enfrentado con el extracto acuoso de Bixa orellana (achiote). Resultados: Obtenidos los cultivos de eritrocitos sin contaminación, la propagación del P. falciparum demoró alrededor de 60 días. El extracto de B. Orellana produjo lisis de los eritrocitos parasitados, obteniendo similar resultado con el estándar sulfato de quinina. Conclusiones: Se logró desarrollar un modelo experimental simple, de poco riesgo por no emplear suero humano, para cultivo continuo de P. falciparum, con posibilidades en la exploración de plantas de empleo antipalúdico tradicional.

Palabras clave: Malaria; Plasmodium falciparum; Plantas medicinales; Fitoterapia; in vitro (fuente: DeCS BIREME).

 

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ABSTRACT

Objective: Contribute to the development of an experimental model, which is more economic and of lesser risk, avoiding the use of human sera for continuous culture of Plasmodium falciparum in human erythrocytes for initial studies of medicinal plants with alleged antimalarial possibilities. Materials and methods: The Trager and Jensen technique was followed with minor modifications, such as not using heparinized blood or human sera. The globular package was resuspended in RPMI 1640 in cell culture flasks, supplemented with hepes medium and inactivated bovine fetal serum. The P. falciparum samples in a cryotube was finally harvested. The continuous culture was challenged with watery extract of Bixa orellana (achiote in Spanish). Results: The erythrocyte cultures were achieved without contamination and the spread of P. falciparum was delayed for about 60 days. B. orellana extract caused lysis in the parasited erythrocytes, thus achieving a similar results with the standard Quinine Sulphate. Conclusions: A simple, experimental model was developed for continuous culture of Plasmodium falciparum, low risk in the fact that it does not use human sera, which shows some promise in the study of traditional antimalarial use. 

Key words: Malaria; Plasmodium falciparum; Medicinal plants; Phytotherapy; in vitro (fuente: DeCS BIREME).

 

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INTRODUCCIÓN

El proceso de ensayos clínicos de drogas nuevas se inicia en diversas etapas, siendo consideradas una de las primeras los estudios en cultivos celulares. Estas incluyen modelos experimentales in vitro, como son los cultivos de eritrocitos humanos.

La Organización Mundial de la Salud ha reiterado que un problema grave de salud pública lo constituye el paludismo, por afectar a miles de personas en países en desarrollo, conduciendo al gasto de enormes recursos de salud1. La búsqueda de principios activos antipalúdicos como drogas nuevas obtenidas de los recursos vegetales en esos países es necesaria y pertinente, considerando las posibilidades alcanzadas con dos principios activos en la terapia antipalúdica, la quinina extraída de la Cinchona officinalis y la artemisinina de la Artemisa annua2,3.

Este reporte preliminar intenta contribuir con un modelo experimental económico y de menor riesgo en manejode suero humano, para el cultivo continuo de Plasmodium falciparum en eritrocitos humanos a fin de motivar estudios iniciales de extractos de plantas medicinales con supuestas posibilidades antipaludicas, especialmente por su empleo tradicional por curanderos y sectores de la poblacion, para futuros ensayos clinicos o propositos afines. 

MATERIALES Y MÉETODOS

Se siguio en lo fundamental la tecnica descrita en el articulo historico de Trager y Jensen4, adaptando algunos pasos, como el no emplear sangre heparinizada, suero humano, bomba peristaltica ni procedimientos menores, que no afectaron las condiciones para mantener viables los eritrocitos, dandoles la calidad de nutrientes, atmosfera de relativamente alto CO2, temperatura apropiada y esterilidad de ambiente. Se usaron frascos desechables de cultivo celular (Falcon®) de 25 mL que se incubaron en un horno (Memmert®) calibrado en 37 °C. Tales frascos fueron colocados antes de introducirlos al horno dentro de un envase metalico hermeticamente cerrado y sellado con cinta adhesiva, en atmosfera de CO2 obtenido adrede agotando casi todo el O2 por combustion.

Los eritrocitos para el cultivo provinieron de un donante con grupo sanguineo O Rh +, sin antecedentes patologicos significativos, que no provenia de zonas tropicales y con su consentimiento informado. La muestra sanguinea de 1 mL extraida de la vena de la flexura del codo fue diluida en un tubo de fondo conico esteril (Falcon®) conteniendo solucion salina al 0,9% hasta completar 50 mL en total, fue agitada suavemente por unos segundos para homogeneizarla y luego centrifugada (Eba 21 Hettich®) por diez minutos a 1500 rpm.

El sobrenadante fue eliminado y el paquete globular obtenido se diluyo con una nueva solucion salina hasta 50 mL, se repitio este procedimiento por tres veces. En la ultima, el paquete globular fue resuspendido en medio de cultivo celular consistente en RPMI 1640 suplementado con Medium hepes en el mismo frasco (Sigma Aldrich), preparado previamente. La preparacion previa consistio en diluir 1,64 gramos del medio en agua destilada hasta alcanzar 90 mL incluyendo gentamicina (10µg/mL) 0,002 mL, luego se agrego 10 mL de suero fetal bovino inactivado (HyClone®), resultando en total 100 mL que finalmente se esterilizo por filtracion al vacio, con membrana de diametro de poro 0,22 µm. Una vez resuspendido el paquete globular, una parte del volumen se utilizo para el cultivo controlado y se llevo a estufa a 37 °C, en tanto la parte restante era refrigerada a 5 °C para su empleo cuando fuera necesario.

Del Laboratorio de Malaria del Centro Nacional de Salud Publica del Instituto Nacional de Salud de Peru (INS) se obtuvo una muestra, de un donante sin tratamiento alguno, de P. falciparum Q-024 29-04-00 en un criotubo (Criovial®) de 1 mL y a -70 °C, el cual fue llevado en pasos sucesivos a refrigeracion, hasta alcanzar 5 oC en 48 horas. Luego se controlo la identidad con la coloracion Giemsa y se inicio el control de esterilidad. En las siguientes 24 horas la cepa fue diluida en 10 mL de medio de cultivo celular RPMI 1640 con Medium hepes y sembrada en volumen aproximado de 0,5 mL en los frascos de cultivo que contenian los eritrocitos ya senalados.

Los cultivos continuos in vitro de las formas asexuales de P. falciparum fueron vigilados diariamente considerando la variacion del color del medio, cambiandoles el sobrenadante al inicio y cinco dias despues de la siembra; luego fueron renovados cada dos dias o de acuerdo al color del medio. Se observo la cantidad de eritrocitos parasitados por campo, usando la coloracion Giemsa, y se realizo la reposicion de los eritrocitos perdidos por la eclosion debida a la reproduccion asexual del P. falciparum, con nuevos eritrocitos del mismo donante.

Se colectaron hojas de Bixa orellana (« gachiote ») del Jardin Botanico del Centro Nacional de Salud Intercultural del INS, las cuales fueron limpiadas y colocadas entre pliegos de papel blanco tipo periodico y mantenidas a temperatura ambiente (estacion de verano) por dos semanas para el secado, finalmente fueron trituradas finamente por molienda. La obtencion del extracto acuoso se realizo por reflujo con 10 g de polvo de hojas en 1000 mL de agua destilada. La certificacion del genero y especie fue realizada por el especialista encargado del Jardin Botanico referido.

Para los enfrentamientos iniciales con los cultivos de eritrocitos parasitados, de entre los frascos de cultivo conteniendo un volumen aproximado de 4,5 mL se eligieron aquellos con un hematocrito de 2% y una densidad de trofozoitos o esquizontes de alrededor de 15 por campo, una muestra de 0,1 mL de extracto de B. Orellana se aplico en cada uno de dos frascos. El mismo volumen se aplico a cada uno de otros dos frascos de cultivo con las mismas caracteristicas aunque contenian solamente eritrocitos con el fin de observar algun efecto del extracto sobre ellos. Como droga de referencia se aplico el estandar sulfato de quinina (USP) 0,1 mL a cada uno de dos frascos de cultivo celular con hematies parasitados y en otros dos con hematies no parasitados. Se mantuvo un frasco de cultivo con eritrocitos parasitados y otro con eritrocitos no parasitados para comparar algun cambio en el tiempo. Todos estos frascos se observaron por cinco dias.

RESULTADOS

Los cultivos de eritrocitos fueron obtenidos sin presentar contaminación. Después del sembrado, la propagación inicial del P. falciparum fue lenta, en alrededor de 60 días (luego de iniciada la siembra a partir de la muestra) se alcanzó la concentración deseada, mostrando en los eritrocitos los diferentes estadios del ciclo asexual. La concentración deseada en los subcultivos a partir de los eritrocitos parasitados, se alcanzó en períodos menores a treinta días. El experimento fue repetido varias veces obteniéndose el mismo resultado en todos los subcultivos, lo cual constituía una validación, alcanzando la reproducibilidad. Se encontró que el extracto de B. orellana no afectaba los cultivos de eritrocitos no parasitados, en cambio en los cultivos de eritrocitos parasitados produjo lisis de tales eritrocitos a partir de las 24 horas aproximadamente. Con sulfato de quinina se observó lisis de los eritrocitos parasitados alrededor de las 30 horas, sin afectar a los no parasitados.

DISCUSIÓN

El uso de la medicina tradicional para resolver problemas de salud como la malaria en países en vías de desarrollo ha sido considerado importante y urgente5. Se eligió el cultivo de P. falciparum por ser el parásito de malaria humana de mayor importancia6 como por ser la única especie de Plasmodium en la cual todos los estados en su ciclo de vida han sido establecidos en cultivos7.

El cultivo de P. falciparum in vitro en la fase esquizogónica, en su ciclo asexual, requiere simular las condiciones para el desarrollo del parásito en los eritrocitos. Desde el momento en que Trager y Jensen describieron el método en 1976, se encontró que el cultivo del P. falciparum en los eritrocitos era fundamental en la investigación en malaria. En base a dicho método se han reportado diversas técnicas para el cultivo de P.falciparum, incluyendo rotación en la incubación8, plasma humano en lugar de suero9, un medio libre de suero10, usando un bioreactor11, empleando adhesivos celulares12 o el empleo de albúmina sérica bovina enriquecida en lugar de suero humano13.

En el presente caso, usamos el suero fetal bovino como suplemento del medio en lugar del suero humano, por la posible presencia de factores inhibitorios, el costo, la reproducibilidad y riesgos por otros patógenos del suero humano que en nuestro medio es frecuente particularmente por hepatitis y VIH14, (cuya inactivación agregaría un paso adicional) pero se mantuvo el medio de cultivo tisular RPMI. Aunque se han efectuado pequeñas modificaciones en las técnica de cultivo celular in vitro, esencialmente es la misma técnica compleja desarrollada por Trager y Jensen, pretendimos simplifi- car algunos pasos a fin de conseguir un modelo experimental in vitro para empleo en la evaluación de recursos vegetales en un laboratorio común.

Los resultados del desarrollo del P. falciparum en los eritrocitos, corresponde a sus diferentes estados in vitro, descritos como anillos, trofozoítos y esquizontes15, con diferentes características morfológicas y metabólicas, exhibiendo una mezcla randomizada de todos los estados del desarrollo4, distinto a su evolución in vivo en el humano donde los parásitos muestran una sincronía en su patrón de desarrollo. Por ello, el enfrentamiento in vitro de posibles antipalúdicos puede resultar complejo en la interpretación. Respecto a la lenta propagación en el presente caso, no fue posible encontrar una causa exacta, pudiendo deberse a la escasez del inóculo entre otros factores no demostrados, aunque puede superar los 30 días, como ha ocurrido con otros autores que han utilizado incluso suero humano15.

Evaluando inicialmente las posibilidades de enfrentamientos de extractos de plantas, usando metodologías alternativas a las convencionales, el extracto de B. orellana recibió atención por su posible actividad contra P. falciparum hallada justamente en técnicas alternativas como es la inhibición de la polimerización del hem, en que demostró 70% de inhibición17, aunque no se le encontró efecto en cultivo celular. La hemólisis en los hematíes parasitados no deja de ser sorprendente aunque no sea una metodología convencional, lo que sería atribuido a los compuestos que podría contener el extracto o sus posibles altas concentraciones, lo cual requiere una mayor exploración. Una respuesta similar la encontramos con el sulfato de quinina, un esquizonticida eritrocitario, aunque en un período mayor, por lo cual siendo una respuesta básica similar al extracto, no puede descartarse totalmente un posible efecto antipalúdico del recurso vegetal, lo que debe ser dilucidado en estudios adicionales, así como la búsqueda de metodologías pertinentes.

El estudio fue financiado por el Instituto Nacional de Salud.

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Correspondencia: Q.F. Nelly Incio.
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