ARTÍCULO ORIGINAL

 

Efecto neutralizador del extracto acuoso de Dracontium loretense (JERGÓN SACHA) sobre la actividad letal del veneno de Bothrops atrox

 

Amanda Lovera¹; César Bonilla²; Jack Hidalgo²

¹ Centro Nacional de Salud Intercultural. Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.
² Centro Nacional de Productos Biológicos. Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.

 

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RESUMEN

Objetivo: Determinar la capacidad del extracto acuoso D. loretense (jergon sacha) para neutralizar la actividad letal del veneno de la serpiente B. atrox. Materiales y metodos: Se realizo el screening fitoquimico del extracto acuoso del bulbo desecado de D. loretense, se calculo la dosis letal 50(DL50) para el extracto y el veneno de B. atrox. Luego se realizaron enfrentamientos de diferentes dosis de extracto y veneno inyectadas intraperitonealmente en ratones, previa incubacion, para calcular la dosis eficaz 50% (DE50) del extracto para neutralizar el efecto letal del veneno por el metodo de Probits. Resultados: El analisis fitoquimico del extracto permitio identificar compuestos fenolicos, taninos, saponinas, proteinas, terpenoides y esteroides. No sobrevivio ningun raton que recibio el veneno sin D. loretense, y no fallecio ninguno al que se le dio solo el extracto acuoso de D. loretense. Se determino la DE50 en 91,15 µg/raton del extracto para neutralizar 2DL50 del veneno. Se encontro que a mayor dosis del veneno de B.atrox se necesito menores dosis del extracto acuoso de D. loretense. Conclusiones: el extracto acuoso de D. loretense neutraliza la actividad letal de veneno de B. atrox. Es necesario realizar estudios que permitan identificar los metabolitos del extracto que tienen esta accion.

Palabras clave: Plantas medicinales; Fitoterapia; Venenos de serpiente; Antivenenos (fuente: DeCS BIREME).

 

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ABSTRACT

Objective: Determine the capability of D. loretense (jergon sacha) watery extract to neutralize the lethal activity from B. atrox snake venom. Materials and methods: Fitochemical screening was conducted on the watery extract of the D. loretense dried bulb. The lethal dose was calculated at 50 (DL50) for the extract and venom from B. atrox. After that, challenges with varying doses of the extract and the venom injected intraperitoneally in mice after incubation in order to calculate the efficacious dosis 50% (DE50) of the extract to neutralize the lethal effect of the venom through the Probits method. Result: Fitochemical testing of the extract allowed for the identification of fenolic compounds, taninos, saponinas, proteins, terpenoides and steroids. None of the mice which received the venom without D. loretense survived and none of the mice which received the D. loretense watery extract died. DE50 was determined in 91,15 µg/mouse from the extract to neutralize 2DL50 of the venom. It was noted that the larger the B. atrox venum, the smaller the dose of D. loretense watery extract. Conclusions: D. loretense watery extract neutralizes the lethal activity from the B. atrox venum. Further studies are needed to identify the extract metabolites which have this action.

Key words: Medicinal plants; Phytotherapy; Snake venoms; Antivenins (source: DeCS BIREME). 

 

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INTRODUCCIÓN

En los ultimos anos se ha notificado a nivel mundial alrededor de 30 000 a 40 000 muertes por la mordedura de serpientes venenosas; en el Peru, la mayor parte de accidentes ofidicos se produjo en las zonas silvestres de selva alta y baja, nicho ecologico de la serpiente Bothrops atrox1.

La serpiente B. Atrox, de la familia Viperidae, conocida como jergon, jergona, catari, achujergon2 es una de las que ocasiona la mayor cantidad de accidentes por ofidios del genero Bothrops (90 a 95%) registrados en el territorio peruano3.

El veneno de B. atrox contiene enzimas proteloliticas, fosfolipasas y miotoxinas4,5 que producen alteraciones fisiopatologicas locales en el sitio de la mordedura, asi como efectos sistemicos. Los efectos locales mas importantes son dolor intenso, edema eritematoso, equimosis, flictenas hemorragicos y necrosis con infeccion secundaria; las alteraciones sistemicas incluyen toxicidad vascular, renal y hemorragias1,6,7.

Los antivenenos producidos en caballos y ovejas son el único tratamiento científicamente validado que actualmente se aplica en los accidentes por ofidios8; sin embargo, la mayoría de accidentes suceden en zonas poco accesibles, y debido a la rapidez con que los efectos del veneno se desencadenan y al retardo en la aplicación del antiveneno1, se ha recurrido a alternativas antes ya usadas como son algunas plantas medicinales con propiedades antiofídicas9,10, en las que se están demostrando la presencia de sustancias inhibidoras de las toxinas de los venenos de serpientes11,12.

Los nativos peruanos usan como antiofídico el bulbo de una planta herbácea llamada Dracontium loretense Krause13 que pertenece a la familia Araceae; mide de 1,5 a 2m de altura, es conocida comúnmente con los nombres de hierba de jergón, sacha jergón, hurignpe (amarakaeri), mágoro (machiguenga), caña X (Ecuador), ronon rao y shanvi yorá (shipiboconibo), see (ese eja) y shandórao (amahuaca)14. Crece en bosques húmedos tropicales, con temperatura promedio anual de 18 a 24 ºC y precipitación pluvial de 1 200 a 3 300 mm/año. Puede sembrarse en cualquier época del año, excepto durante los meses de menor precipitación (menos de 150 mm/mes); en el Perú se encuentra distribuida en los departamentos de Loreto, Amazonas, Huánuco, Madre de Dios y San Martín14.

Siendo necesario validar el conocimiento tradicional en evidencia científica, por ello se planteó como objetivo evaluar el efecto neutralizador del extracto acuoso del Dracontium loretense Krause sobre la actividad letal del veneno del B. atrox en un modelo experimental. 

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIAL BIOLÓGICO

Extracto acuoso. Los especímenes de jergón sacha se recolectaron en la zona de Cueva de las Pavas y Cueva de las Lechuzas en Tingo María, Huánuco, luego fueron identificados como Dracontium loretense Krause en el Herbario Nacional del Centro Nacional de Salud Intercultural, Instituto Nacional de Salud en Lima. Los bulbos recolectados fueron desecados y molidos; 15,2 g del polvo producido se hirvió durante cinco minutos en 150 mL de agua destilada, luego se centrifugó la solución a 5000 rpm y en el filtrado se obtuvo tres capas. Para los ensayos sólo se usaron las capas superiores (110 mL aproximadamente). El extracto fue dispensado en varios tubos y congelado entre 2 a 8 ºC.

Veneno. Se usó el veneno de B. atrox (Lote: 9-2-1) producido por el Centro Nacional de Productos Biológicos, Instituto Nacional de Salud (Lima, Perú).

Animales de laboratorio. Se emplearon ratones cepa Balb-c de 17 a 19g de peso, proporcionados por el Bioterio del Instituto Nacional de Salud (Lima, Perú).

ENSAYOS FITOQUÍMICOS

Se realizó la identificación cualitativa de taninos, aminoácidos, saponinas, flavonoides y alcaloides según el método de Lock de Ugaz para determinar metabolitos secundarios15. Se usó la cromatografía en capa fina en fase móvil: cloroformo-metanol-agua con vainillina-ácido sulfúrico para detectar terpenoides y esteroides; en la fase móvil: cloroformo-acetato de etilo-agua con bencidina para compuestos fenólicos. Se determinó el contenido de proteínas por el método de Lowry y las cenizas totales según Pharmacopea Europea16.

ENSAYOS BIOLÓGICOS

Toxicidad aguda. Se determinó la dosis letal 50% (DL50) para el veneno de B. atrox y el extracto de D. loretense usando grupos de seis ratones, los cuales fueron inyectados vía intraperitoneal con dosis variables del veneno o extracto.

Neutralización del efecto letal del veneno. Se ensayaron cuatro tratamientos con diferentes dosis del extracto acuoso (169,67; 123,03; 79,80 y 51,76 uL/g) contra tres dosis distintas de veneno (2DL50, 3DL50 y 4DL50), además de grupos control (agua destilada por extracto) y blanco (agua destilada por veneno); teniendo en total 20 grupos de estudio con seis ratas cada uno (Tabla 1). Las diferentes combinaciones fueron preincubadas a 37 ºC durante 30 minutos para luego ser inyectadas vía intraperitoneal. La mortalidad se registró a las 24, 48 y 72 horas; posteriormente, se sacrificó a los ratones sobrevivientes y se realizó el estudio anatomopatológico a toda la población del estudio en el Laboratorio de Patología del Instituto Nacional de Salud.

 

Se determinó la dosis letales (DL50) y efectivas (DE50) al 50% por el método de Probits usando el programa “BASIC”17.

RESULTADOS

ENSAYOS FITOQUIMICOS

Las muestras ensayadas de tuberculo desecado, resultaron positivas para taninos, frente a reactivos de gelatina, NaCl 5% y gelatina + FeCl₃, asi como a aminoacidos (ninhidrina) y saponinas (espuma). Presentaron reaccion positiva a fenoles (FeCl₃), flavonoides (FeCl₃, NaOH 50 % y Shinoda) y alcaloides (Draggendorf, Bouchard, Mayer, Duquenois). Por cromatografia liquida de capa fina se presento una mancha coloreada con un valor de Rf de 0,07 para terpenoides y esteroides, y para compuestos fenolicos se aprecio dos manchas con valores de Rf de 0,81 y 0,83. El contenido de proteinas encontrado en el tuberculo sin desecar fue de 1,2 mg/100 mg y el de cenizas totales 2,54%.

ENSAYOS BIOLOGICOS

Toxicidad aguda. Se calculo la DL50 para el veneno de B. atrox en 67,87 µg/raton, para el caso del extracto acuoso del D. loretense no se determino toxicidada las dosis ensayadas (se ensayaron hasta dosis de 500 µg/raton sin observar letalidad hasta 72 horas despues). 

Neutralizacion del efecto letal del veneno. No sobrevivio ningun raton que recibio el veneno sin D.loretense, y no fallecio ninguno al que se le dio solo el extracto acuoso de D.loretense. Se determino la dosis efectiva al 50% (Tabla 2), se encontro que a mayor dosis del veneno de B.atrox se necesito menores dosis del extracto acuoso de D.loretense (Figura 1). En el estudio histopatologico se hallo congestion y dilatacion vascular en todos los organos, en aquel grupo que fallecio ademas se encontro focos de necrosis tubular e hiperplasia de celulas de Kupffer; a diferencia del grupo sobreviviente en el que solo se encontro congestion glomerular y un leve engrosamiento de la membrana basal.

 

 

DISCUSIÓN

Se demostró que el extracto acuoso de D.loretense neutraliza la actividad letal del veneno de B.atrox en el modelo experimental usado, este procedimiento basado en la incubación del extracto junto al veneno previo a la inyección, facilita la interacción de las toxinas con potenciales sustancias neutralizadoras, y es mejor que los experimentos basados en la inyección independiente del veneno y los extractos18,19, ya que en este caso la rapidez con que se desencadena el efecto del veneno en los tejidos hace difícil su inhibición por agentes neutralizantes20.

En 1992, Martz12 informó sobre la capacidad de algunas plantas de inhibir algunas actividades del veneno de serpientes, observaciones similares a las reportadas por Otero et al. que dan a conocer el uso de plantas medicinales en la atención de cuadros clínicos de ofidismo por los curanderos del noroccidente colombiano9,21, que luego las evalúan experimentalmente para observar su capacidad para neutralizar el efecto letal, hemorrágico y enzimático del veneno de B.atrox22,23, como en Costa Rica donde se ha estudiado la capacidad de plantas tropicales para neutralizar el efecto hemorrágico del veneno de Bothrops asper24.

Al evaluar el extracto acuoso del D. loretense Krause frente al veneno de B.atrox, en base a la información etnobotánica13, se comprobó la capacidad neutralizante del extracto frente al veneno; el alto grado de efectividad de los extractos, abre las posibilidades de estudiar nuevos compuestos con propiedades antiofídicas en plantas medicinales peruanas. 

Si bien el screening fitoquímico detectó la presencia de terpenoides y esteroides, compuestos fenólicos, taninos, saponinas, aminoácidos y proteínas, es necesario mejorar los procesos de extracción, purificación e identificación de los metabolitos encontrados, y enfrentarlos en forma independiente para conocer cuales de sus compuestos son los que tienen la acción neutralizante.

Así mismo, es necesario trabajar con el extracto crudo de D.loretense ya que presenta un perfil diferente de metabolitos con mayor predominio de compuestos fenólicos que el extracto de tubérculo desecado usado para este estudio (Lovera A, datos no publicados). 

En conclusión, el extracto acuoso del D.loretense Krause neutraliza el veneno de B. atrox en experimentos donde el veneno y los extractos se incuban previo a su inyección. Es necesario profundizar en el estudio de los metabolitos encontrados, así como continuar con el ensayo de neutralización del extracto crudo del D. Loretense frente al veneno de B. atrox y veneno de otras serpientes.

AGRADECIMIENTOS

Nuestro sincero agradecimiento al Laboratorio de Rekmec del Centro Nacional de Productos Biológicos, al Centro Nacional de Alimentación y Nutrición y al Centro Nacional de Control de Calidad del INS por facilitar el uso de sus equipos para la realización de la investigación; a la Dra. María Luz Miraval por su apoyo en el estudio anatomopatológico, y al Dr. Percy Mayta en la redacción del artículo.

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Correspondencia: Q.F. Amanda Lovera Arellano. Centro Nacional de Salud Intercultural, Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú.
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