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Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica

versión impresa ISSN 1726-4634

Rev. perú. med. exp. salud publica v.25 n.1 Lima ene./mar. 2008

 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Efecto Genotóxico del Dicromato de Potasio EnEritrocitos de sangre periférica de OreochromisNiloticus (Tilapia)

Genoto xic efect of potassium dicromate in Peripherals blod eryt hrocytes of Oreochromis niloticus (TILAPIA)

 

Zulita Prieto1,a, Julio León-Incio1,a, Carlos Quijano-Jara1,a, Radigud Fernández1,a, Edgardo Polo-Benites1,a, Roger Vallejo-Rodríguez1,b, Luis Villegas-Sanchez1,b

1 Laboratorio de Genética, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo, Perú.
  a Biólogo; b Estudiante de biología

 


RESUMEN

Existen múltiples reportes del efecto genotóxico y cancerígeno del cromo VI, los seres humanos tenemos una permanente exposición a este elemento. Objetivos. Evidencias la genotoxicidad del dicromato de potasio utilizando como sistema biológico a Oreochromis niloticus “tilapia”, mediante el test de micronúcleos y la cuantificación de nuclear buds, en eritrocitos de sangre periférica. Materiales y métodos. Los individuos fueron expuestos a concentraciones crecientes (0,0, 0,2, 0,4 y 0,8 ppm) de dicromato de potasio. Se obtuvieron muestras de sangre periférica, del arco branquial de cada individuo (cuatro por grupo), a los tres y siete días de tratamiento, las cuales fueron procesadas y coloreadas con Giemsa 5% y se cuantificaron eritrocitos con micronúcleos y nuclear buds en sangre periférica. Resultados. Se encontró un incremento significativo de las frecuencias de micronúcleos y nuclear buds directamente proporcional a la concentración del dicromato de potasio en los individuos expuestos (p<0,05). Conclusiones. El dicromato de potasio produce daño genético en los eritrocitos de O. niloticus.

Palabras clave: Genotoxicidad; Cromo; Dicromato de potasio; Modelos biológicos; Pruebas de micronúcleos (fuente: DeCS BIREME).


ABSTRACT

Due multiple reports of the genotoxic and carcinogenic effect of chromium VI and the permanent exposure of the human beings to this element. Objective. Contributing new evidence of the genotoxicity of potassium dichromate using the biological system Oreochromis niloticus “tilapia” through the micronucleus test and the nuclear quantification of buds in erythrocytes of peripheral blood. Material and methods. The individuals were exposed to increasing concentrations (0.0, 0.2, 0.4 and 0.8 ppm) of potassium dichromate. Peripheral blood samples of the branchial arc of each individual were taken at 3th and 7th day of treatment which were processed and colored with Giemsa 5%, erythrocytes in peripheral blood with micronuclei and nuclear buds were quantified. Results. A significant increase of frequencies of micronucleus and nuclear buds in the exposed individuals were registered which were directly proportional to the potassium dichromate concentration (p<0.05). Conclusions. Potassium dichromate caused genetic damage in the cells of O. niloticus.

Key words: Genotoxicity; Chromium; Potassium dichromate; Biological models; Micronucleus test (source: DeCS BIREME).


INTRODUCCIÓN

El incremento de riesgo al cáncer pulmonar está asociado a la exposición a compuestos que contienen cromo hexavalente (CrVI) (1). Estudios epidemiológicos presentan al cromo hexavalente insoluble (PbCrO4) y relativamente insoluble (ZnCrO4) con mayor actividad carcinogénica que la forma soluble, como el dicromato de potasio (K2Cr2O7) (2). No obstante a estas diferencias, la capacidad carcinogénica dependerá en gran medida del tiempo y dosis de exposición al cromato.

La población humana está expuesta al Cr(VI) de manera masiva y permanente debido al aumento progresivo de la contaminación ambiental con cromo hexavalente a causa de emisiones industriales (3-6). Una fuente importante del Cr(VI) lo constituyen los dicromatos de potasio y de sodio, que son utilizados en la industria de cromados, manufactura de pigmentos, colorantes, curtido de pieles, en la preparación de antisépticos, en la limpieza de material de vidrio de laboratorio, como agente valorante, entre otros. En el Perú, no hay un monitoreo de las emisiones de Cr(VI), como se realiza en otros países (3,4), existen industrias que en muchos casos, trabajan de manera artesanal y no cuentan con medidas de bioseguridad suficientes.

El Cr (VI) existe en las formas aniónicas CrO4 2-, HCrO4 o Cr2O7 -, dependiendo del pH del medio (7) y tiene la capacidad de ingresar a la célula utilizando la vía general de los canales proteicos transportadores de aniones (8). Al ingresar al espacio intracelular, el cromo (VI) interacciona con agentes reductantes e inicia un proceso reductivo a los estados Cr(V), Cr (IV) y Cr(III), generando una fuerza oxidativa capaz de producir lesiones en el DNA, aductos Cr-DNA, uniones cruzadas DNA-DNA, DNA-proteínas, sitios apurícos, entre otros (9). Los mecanismos de transporte del cromo a nivel celular, la interacción con agentes reductantes como el glutation (10) y uniones con el DNA, no se encuentran totalmente esclarecidos.

Ensayos ecotoxicológicos en Artemia salina muestran la toxicidad aguda del K2Cr2O7 (11). Investigaciones sobre la genotoxicidad de éste compuesto se han realizado en Sacharomices (12), Procambarus clarkii (13), Pseudokirchneriella subcapitata (14), Mus domesticus (15); en esta última especie, existe conclusiones que difieren sobre la genotoxicidad del dicromato de potasio cuando se administra por vía oral (16-17).

Los peces, como Oreochromis niloticus, son considerados sistemas genéticos de especial interés para investigaciones in vivo en la evaluación de contaminantes acuáticos (18), y teniendo en cuenta la contaminación ambiental con cromo VI, el presente trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto genotóxico en Oreochromis niloticus “tilapia” expuestas a concentraciones crecientes de dicromato de potasio, mediante la cuantificación de eritrocitos con micronúcleos y nuclear buds en sangre periférica.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los peces Oreochromis niloticus procedentes del centro piscícola de Guadalupe, Perú, fueron aclimatados a condiciones de laboratorio, a una temperatura de 22 ± 2 ºC, en agua declorinada y aireación continua. Después de dos semanas de aclimatación, se seleccionó 16 individuos de tamaño uniforme, en un rango de 12 a 14 cm de longitud total y se incluyó cuatro individuos en cada grupo, los que fueron colocados en acuarios de 15x20x20 cm conteniendo 0,0, 0,2, 0,4 y 0,8 ppm de dicromato de potasio en 30 litros. Los ejemplares fueron mantenidos durante una semana bajo las mismas condiciones de aireación y alimento.

 

 

 

Se tomó muestras de sangre del arco branquial de los peces a los tres y siete días de tratamiento. Con las muestras de sangre de cada individuo se realizó extendidos celulares, se dejó secar a temperatura ambiente, se fijó en etanol absoluto por 20 minutos y se coloreó con Giemsa 5% durante 30 minutos (19).

Se realizó el conteo de 2000 eritrocitos por individuo utilizando un microscopio óptico a 1000X de magnificación. Los criterios de identificación de micronúcleos (MN) fueron: estructura redondeada de tamaño pequeño, diámetro significativamente inferior al núcleo principal, con coloración similar y clara separación del núcleo principal (20) y los eritrocitos con brotes o micronúcleos con una conexión cromatínica al núcleo celular (21) fueron clasificados como nuclear buds (brotes nucleares). Se estimaron las frecuencias (‰) de micronúcleos y nuclear buds y se realizaron las comparaciones estadísticas entre tratamientos mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la relación entre variables con el análisis de regresión, considerando un p<0,05 como significativo.

RESULTADOS

En sangre periférica de O. niloticus, los eritrocitos con núcleo en posición central de forma elíptica de contornos definidos corresponden a eritrocitos normales (Figura 1a). Por efecto del dicromato de potasio se observaron alteraciones en la morfología nuclear y sólo se cuantificaron eritrocitos con micronúcleos (Figura 1b) y eritrocitos con brotes nucleares “nuclear buds” (Figuras 1c y 1d).

Las frecuencias de las células con micronúcleos y nuclear buds estuvieron aumentadas con respecto al control, siendo significativa la diferencia entre el tratamiento con respecto al control, a los tres días de exposición al dicromato de potasio (p<0,05, Figura 2a). El valor promedio para micronúcleos en la concentración 0,8 ppm fue de 1,43 ‰ ± 0,45 y para nuclear buds”de 2,30 ‰ ± 0,80 y en el control, 0,0 y 0,12 ‰ ± 0,25. Después de siete días, las frecuencias disminuyeron tanto para micronúcleos como para los nuclear buds y no se encontró diferencias significativas entre los tratamientos (Figura 2b).

Se determinó el aumento de las frecuencias de micronúcleos y nuclear buds en función de la dosis de dicromato de potasio, el coeficiente de regresión para micronúcleos fue de 0,14 ‰ ± 0,13 y para nuclear buds de 0,58 ‰ ± 0,25 (p<0,01) a los tres días de exposición.

Además de las alteraciones nucleares, a los siete días de exposición se observó un incremento de células de forma redondeada de tamaño similar a la de los eritrocitos y con núcleos excéntricos, principalmente en uno de los individuos, que antes de la exposición al dicromato de potasio ya presentaba un gran número de eritrocitos de forma elíptica pero con núcleos de posición excéntrica (Figura. 3).

 

 

DISCUSIÓN

La morfología de los eritrocitos maduros en individuos de O. niloticus no expuestos al dicromato de potasio coinciden con la morfología de los eritrocitos normales en Galaxias maculatus (22), Cyprinus carpio “carpa” (23), Brycon amazonicus (24) y otras especies de peces. La presencia de eritrocitos de forma redondeada, coinciden con la morfología de eritrocitos inmaduros de Brycon amazonicus24. El incremento de eritrocitos inmaduros podría deberse a una respuesta frente al estado de estrés causado por el dicromato de potasio, investigaciones en trucha han registrado un incremento de eritrocitos inmaduros en una fase preadaptativa a condiciones de estrés por cambios ambientales (25).

El daño genético producido por el Cr(VI) de K2Cr2O7 se observó por un incremento de micronúcleos y nuclear buds en los eritrocitos de sangre periférica de O. niloticus. La regresión estimada entre las concentraciones utilizadas y los valores de MN y nuclear buds demuestran un efecto dosis dependiente durante la exposición a los tres días con K2Cr2O7. De acuerdo a los trabajos realizados en diferentes especies y con diferentes genotóxicos, se observa que durante los primeros días de exposición existen incrementos progresivos de micronúcleos y después de esos días los valores disminuyen.

Después de siete días de exposición al K2Cr2O7, encontramos una disminución de las frecuencias de MN y nuclear buds, Cavas et al. registraron un aumento a los tres días de tratamiento y disminución a los seis días en la misma especie expuesta a efluentes textiles (26), Palhares et al. también en la misma especie con aplicación intraabdominal de mitomicyn C reportaron disminución de MN después de cinco días (27), experimentos con ciclofosfamida, 5-flurouracilo, bleomicina y mitomicina encontraron incrementos entre los dos a siete días y a los 14 días disminuyó la frecuencia de MN, y a los 30 días disminuyeron aun más sus valores (28); por la exposición de Pimephales promelas a agua de río contaminada con residuos industriales, se evidenció un incremento a los 14 días y disminución a los 21 días (29). Estas variaciones en la disminución de MN después de una fase de incremento, dependen del tipo de genotóxico, la concentración utilizada, la forma de administración y la respuesta genética que tenga cada especie.

Los valores encontrados con el test de micronúcleos a las concentraciones de 0,4 ppm, están dentro del rango de los valores individuales reportados por Sienra et al.13 que registró valores entre 0,33 y 2,0 ‰ en células de hemolinfa del cangrejo P. clarkii expuestas a 400 μg/L de dicromato de potasio durante siete días. Estudios en eritrocitos de sangre periférica en Carassius auratus expuestos a cadmio (CdCl2) reportan valores promedios similares, de 0,33 a 1,75 ‰ en aumento progresivo de acuerdo a la concentración dentro de dos a cinco días de tratamiento (30), a pesar de ser especies acuáticas distintas.

Sin embargo, comparando los resultados obtenidos con los realizados en O. niloticus utilizando otros genotóxicos se encuentra alta variación en la formación de micronúcleos, así por ejemplo, en muestras de sangre periférica de O. niloticus a los dos días de exposición a ciclofosfamida muestra un valor de 14,68 ‰, con 5-fluorouracilo 1,25, con bleomicina 1,58, con mitomicina 1mg/kg 1,25 (28), con mitomicina 2mg/kg 2,1 y a los tres días 3,8‰ (27), con efluentes textiles 6,56 ‰ (26), con atrazine 25ug/L 1,19 ‰ (31), entre otros. Además, así como hay diferencias entre diferentes tipos de genotóxicos en cuanto a su capacidad de alterar al DNA, trabajos realizados en una misma especie ante un mismo genotóxico muestran diferencias en los valores de MN en diferentes tejidos (27,29).

En relación a los nuclear buds, las frecuencias registradas a los tres días de tratamiento fueron significativamente mayores que las frecuencias de MN. Este marcador es factible de ser cuantificado de manera objetiva al igual que las células con micronúcleos y ser utilizados en los ensayos de genotoxicidad en peces. Según estudios previos (19,26,31,32), las alteraciones en las formas nucleares fueron clasificados en: núcleos con hendidura (blebbed nuclei), núcleos lobulados (lobed nuclei), núcleos vacuolados (vacuolate nuclei), brokeneggs, nuclear buds, entre otras, son cuantificados de manera independiente y conjuntamente como una sola clasificación: anormalidades nucleares. En todos los casos, las comparaciones entre tratamientos presentan un alto grado de significancia contrastable con el control negativo y positivo. En este trabajo se cunatificó como nuclear buds a todos lo núcleos que tienen brotes nucleares claramente definidos.

La formación de los nuclear buds se relaciona con la amplificación del DNA en la fase S (33,34). El marcaje con sondas de ADN centromérico y telomérico en los buds, realizado en cultivo de linfocitos humanos, muestra la predominancia de secuencias de DNA que no corresponden al centrómero y telómero, contrariamente a lo observado en los micronúcleos (21). Los mecanismos del proceso de brotamiento nuclear o “budding” por efecto del cromo VI no se conoce, sin embargo la evidente presencia de buds por efecto del dicromato de potasio, podrían ser indicios de un proceso apoptósico (35,36). Existen estudios en otras especies, de la inducción de apoptosis después de la exposición al dicromato de potasio, relacionado con las alteraciones del potencial de membrana de las mitocondrias, el incremento de la actividad del citocromo c y de la proteína p53, cambios asociados al incremento de las especies de oxígeno reactivo (ROS) generado por el dicromato de potasio durante el proceso de reducción de cromo VI a cromo III (37,38).

En la figura 4, se propone probables mecanismos sobre el origen de nuclear buds y micronúcleos. En principio, la inducción del daño genético por el cromo VI debe haber ocurrido en el centro hematopoyético de los individuos, en los peces teleósteos, el riñón cefálico es el principal órgano hematopoyético (39). Una célula en fase S, es el blanco principal de cualquier agente genotóxico, por estar la cromatina descondensada para los procesos de replicación y transcripción.

 

 

Se ha descrito una explicación del brotamiento nuclear (budding) por efecto de una hiperamplificación del DNA en la fase S (33-35) o por efecto de una respuesta fisiológica celular como consecuencia de una poliploidización que tiende a eliminar el exceso de DNA con la formación de buds, seguido de micronúcleos o minicélulas (Figura 4a) (40).

Una hipótesis contraria se representa en la figura 4b, con la formación de buds o micronúcleos como consecuencia de un proceso apoptósico ante el daño provocado por agentes genotóxicos. Existe evidencias de la hipodiploidización celular o disminución del contenido de DNA por efecto del cromo VI, cuyo mecanismo no está esclarecido, estudios en ratas muestran el contenido hipodiploide del DNA en las células después de la exposición al cromo VI y explican su origen debido a la fragmentación del DNA asociado con eventos de apoptosis (38) y en otras investigaciones se le atribuye a un mecanismo aneugénico (41). En numerosas publicaciones se notifica el efecto apoptósico del cromo hexavalente (42-44).

Otros mecanismos, consideran que la formación de nuclear buds es resultado de roturas de puentes anáfasicos, o de cromosomas con migración retrasada que no son incluidos totalmente en el núcleo principal, propuestas representadas en la Fig.4c y que estarían sustentadas por la presencia de centrómero o teloméro positivo en los buds (27).

En relación con el proceso de micronucleación, el origen de micronúcleos en eritrocitos de sangre periférica, se debería a la ocurrencia de lesiones en el DNA principalmente en las células en interfase-S, por ejemplo (1) roturas en los brazos cromosómicos que conducirían a delecciones en el proceso anafásico, quedando rezagados fragmentos cromosómicos acéntricos con la consecuente formación de micronúcleos telómeros positivos (Figura 4c), (2) roturas cromosómicas en los telómeros conducirían a la formación de puentes cromosómicos durante la anafase-telofase que al producirse roturas generarían micronúcleos (Figura 4d), (3) cambios en las secuencias nucleótidicas de DNA centromérico o en las secuencias génicas de proteínas centroméricas y durante la migración cromosómica originarían cromosomas rezagados y micronúcleos de cromosomas enteros con una o dos cromátidas (Figuras 4e y f), (4) alteraciones en las secuencias génicas de enzimas comprometidas con la condensación cromosómica produciendo cromosomas pegajosos que no facilitan una segregación cromosómica equitativa que podrían formar micronúcleos o minicélulas.

Por otro lado, las lesiones que conducen a la micronucleación pueden ocurrir también durante la división celular, como resultado de la interacción de los metales con proteínas motor del citoesqueleto, como la tubulina y kinesina que conllevan a la formación de micronúcleos aneugénicos (45).

Los esquemas presentados se fundamentan en los estudios realizados por investigadores que explican los mecanismos de micronúcleación. Además de los citados anteriormente, los micronúcleos surgirían por amplificación génica y eliminados vía nuclear budding durante la fase S del ciclo celular (46), así mismo, se sostiene que otra causa de micronucleación se debería a la hipometilación de la heterocromatina y el silenciamiento de genes comprometidos con la condenzación de la cromatina (47). Otras contribuciones proponen que la mayoría de micronúcleos parecen ser derivadas de cromátidas rezagadas (48). Cuando utilizaron el inductor 1-4 dioxane se registró aproximadamente el 90% de los micronúcleos CRESTnegativo indicando que los micronúcleos fueron formados a partir de roturas cromosómicas, en contraste a estos resultados, cuando el inductor fue vinblastine, la mayoría (80%) de eritrocitos micronucleados fueron CREST-positivo, los micronúcleos estarían formados por cromosomas completos (eventos aneugénicos) (49). Resultados opuestos que indican efecto dependiente del tipo de genotóxico utilizado.

 

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Correspondencia:
Blga. Zulita Prieto. Laboratorio de Genética,
Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo, Perú.
Dirección: Calle San Mateo 300, Dpto. 202, San Andrés, Trujillo.
Teléfono: (51-44) 289075
Correo electrónico: zapl99@yahoo.com

 

Fecha de recepción: 20-11-07
Fecha de aceptación: 13-02-08

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