ARTÍCULO ORIGINAL

 

Identificación y determinación estructural de un sesquiterpeno de las hojas de Tessaria integrifolia Ruiz & Pav. y evaluación de su actividad Leishmanicida

Identification and structural determination of a sesquiterpene of Tessaria integrifolia Ruiz & Pav. leaves and evaluation of its Leishmanicidal activity

 

Carmen R. Silva-Correa^1,a, José L. Cruzado-Razco^1,b, María V. González-Blas^1,a, Juan M. García-Armas^2,c, Segundo G. Ruiz-Reyes^1,d, Víctor E. Villarreal-La Torre^1,a, César D. Gamarra-Sánchez^1,e

¹ Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo, Perú.
² Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Privada Antenor Orrego. Trujillo, Perú.
^a Químico farmacéutico, magíster en Ciencias Químicas; ^b químico farmacéutico, magíster en Fisiología y Biofísica; ^c ingeniero químico, doctor en Ciencias Químicas; ^d químico farmacéutico, doctor en Farmacia y Bioquímica; ^e químico farmacéutico, magíster en Farmacología.

 

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RESUMEN

Objetivos. Identificar y determinar la estructura del fitoconstituyente de hojas de Tessaria integrifolia Ruiz & Pav con efecto leishmanicida. Materiales y métodos. Se preparó un extracto fluido de hojas de Tessaria integrifolia Ruiz & Pav. que fue concentrado a extracto blando y se utilizó para evaluar la actividad leishmanicida en Mesocricetus auratus con leishmaniasis experimental, administrando vía intramuscular la dosis de 250 mg/kg del extracto blando por 15 días. El extracto fue fraccionado en columna cromatográfica de 45 cm, con un diámetro de 2,5 cm que contiene silicagel G-60, de 70-230 mesh (Sigma-Aldrich®), las nueve fracciones obtenidas fueron evaluadas sobre macrófagos infectadoscon Leishmania sp  para determinar la fracción activa y aislar el compuesto activo, mediante separación, purificación y cristalización, siendo analizado por resonancia magnética nuclear (RMN) de ¹H, ¹³C, y cromatografía líquida acoplada a espectroscopía de masas (LC/MS). Resultados. El extracto fluido de las hojas de Tessaria integrifolia Ruiz & Pav. presenta actividad leishmanicida en Mesocricetus auratus y la fracción F8 es activa sobre macrófagos infectados a dosis de 14 µg/mL. Se elucidó en esa fracción un sesquiterpeno tipo eudesmano ((4aS, 5R,6R,8aR)-6-hidroxi-5,8a-dimetil-3(1-metiletiliden) octahidronaftalen-2(1H)-ona), según análisis de RMN ¹H, ¹³C, y LC/MS. Conclusiones. El extracto fluido de hojas de Tessaria integrifolia Ruiz & Pav. presenta actividad leishmanicida sobre Mesocricetus auratus. La fracción F8 presenta actividad leishmanicida sobre macrófagos infectados a dosis de 14 µg/mL. Se elucidó en la fracción activa un sesquiterpeno tipo eudesmano según los análisis de RMN ¹H, ¹³C, y LC/MS.

Palabras clave: Leishmania; Asteraceae;   Sesquiterpenos de eudesmano; Mesocricetus   (Fuente: DeCS BIREME).

 

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ABSTRACT

Objective. To identify and determine the phytoconstituent structure of Tessaria integrifolia Ruiz & Pav. leaves with leishmanicidal activity. Materials and Methods. Fluid extract of leaves was prepared, concentrated to soft extract, and used to evaluate leishmanicidal activity in Mesocricetus auratus with experimental leishmaniasis, at the dose of 250 mg/ kg of soft extract by intramuscular route for 15 days. Extract was fractionated in 45 cm column chromatography with a 2.5 cm diameter, containing  G-60 silica gel, and 70-230 mesh (Sigma-Aldrich®). Nine fractions were obtained and assessed on macrophages infected with Leishmania sp to determine the active fraction and isolate the active compound, by separation, purification, and crystallization, analyzed by nuclear magnetic resonance (NMR) of 1H, 13C, and liquid chromatography coupled to mass spectroscopy (LC/ MS). Results. Fluid extract from the leaves of T. integrifolia presents leishmanicidal activity in M. auratus. Fraction F8 is active on infected macrophages at a dose of 14 μg/mL. An eudesman type sesquiterpene ((4aS, 5R, 6R, 8aR) -6-hydroxy-5, 8a-dimethyl-3- (1-methylethylidene) octahydronaphthalen-2 (1H) – one) was identified, by RMN 1 H, 13C, and LC / MS analysis. Conclusions. Fluid extract of leaves of Tessaria integrifolia Ruiz & Pav. presents leishmanicidal activity on Mesocricetus auratus with experimental leishmaniasis. Fraction F8 presents leishmanicidal activity on infected macrophages at a dose of 14 μg/mL. An eudesman type sesquiterpene was identified, according to 1 H, 13C, and LC / MS NMR analysis.

Keywords: Leishmania; Asteraceae; Eudesmane sesquiterpene; Mesocricetu   (source: MeSH NLM).

 

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INTRODUCCIÓN

La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria que se encuentra en unos 89 países y afecta entre 12 y 15 millones de personas en el mundo. Se estima que cada año se producen hasta dos millones de nuevos casos y 70 000 muertes por la enfermedad ⁽¹⁾. Asimismo, como enfermedad tropical es la segunda endemia en el Perú, y la tercera causa de morbilidad luego de la malaria y la tuberculosis ⁽²⁾.

La leishmaniasis es causada por un protozoo del género Leishmania, que cuenta con más de 20 especies diferentes y se transmite a los humanos por la picadura de mosquitos hembras del género Lutzomyia. Clínicamente, la enfermedad se divide en tres formas principales, cutánea (CL) conocida como uta, mucocutánea (MCL) y visceral (VL) conocida como Kala-azar ⁽³⁾. Como primera línea de tratamiento se emplean los compuestos antimoniales pentavalentes que incluyen gluconato de antimonio sódico, antimoniato de meglumina y estibogluconato de sodio ⁽⁴⁾.

Recientemente, el número de investigaciones sobre agentes leishmanicidas aumentó significativamente por dos razones: en primer lugar, por los efectos tóxicos observados con la terapia convencional, y en segundo lugar, la resistencia farmacológica de varias especies de Leishmania ⁽⁵⁾. Además, los medicamentos más comúnmente utilizados no eliminan completamente los parásitos de todas las personas infectadas ⁽⁶⁾. Debido a las limitaciones de los actuales esquemas terapéuticos, junto con la ausencia de vacunas adecuadas ⁽⁷⁾, existe un interés creciente en nuevas sustancias con propiedades leishmanicidas obtenidas de extractos naturales que sean fácilmente accesibles para las personas afectadas ⁽⁸⁾.

La especie Tessaria integrifolia Ruiz & Pav. conocida como «pájaro bobo», «huapariu», «tseco», perteneciente a la familia de las Asteraceae, se encuentra ampliamente distribuida desde el sur de América Central hasta América del Sur, incluyendo Panamá, Colombia, Venezuela, Paraguay, Brasil, Bolivia y Perú ⁽⁹⁾. T. integrifolia es un arbusto de hasta diez metros de alto, que crece en la ribera de los ríos de la costa y selva del Perú. Dentro de uso tradicional, se menciona que es antiasmático, antipirético, antiinflamatorio, y diurético ⁽¹⁰⁾.

Investigaciones sobre la composición fitoquímica de T. integrifolia aislaron flavonoides como casticina y artemisina en las partes aéreas de la especie vegetal ⁽¹¹⁾. Asimismo, se reporta la presencia de flavonoides, lignanos, ácido cafeólico, eudesmanos sesquiterpénicos en el extracto metanólico de T. integrifolia aislando 23 compuestos diversos, entre ellos flavonoides como crisolfenol-D, quercetina, hiperina, y trifolina, incluye lignanos como pinoresinol y el 3,4-di(4-hidroxi-3metoxibencil) tetrahidrofurano, así como también derivados del ácido cafeólico ⁽¹²⁾, sesquiterpenos de tipo eudesmanos, integrifósido A, integrifósido B, integrifósido C, integrifósido D e integrifonol A del extracto metanólico de la parte aérea de esta planta ⁽¹³⁾. Otro estudio fitoquímico del extracto metanólico de las hojas y flores de T. integrifolia, informa la presencia de esteroides, flavonoides, compuestos fenólicos, además de saponinas en las hojas ⁽¹⁴⁾. Por otro lado, estudios experimentales previos, determinaron que el extracto metanólico de las flores de T. integrifolia genera lisis, inmovilidad o falta de desarrollo de las promastigotas de Lesihmania ^(15,16).

 

 

En base a los antecedentes y considerando que existen pocos estudios realizados sobre los usos medicinales de esta especie vegetal en nuestro medio, se hace necesario evaluar la utilidad farmacológica de sus fitoconstituyentes sobre la leishmaniasis, al ser una enfermedad que se presenta endémicamente en áreas costeras, valles interandinos y selva del Perú.

MATERIALES Y MÉTODOS

PREPARACIÓN DEL EXTRACTO

Se recolectaron las hojas de T. integrifolia «pájaro bobo» en la ribera del río Chamán, ciudad de Chepén, provincia de Chepén, departamento de La Libertad (Altitud: 135 msnm, Latitud: 07º 13’ 36", Longitud: 79º 25’ 45"). La planta medicinal se clasificó en el Herbarium Truxillense de la Universidad Nacional de Trujillo con el Código N° 54937-HUT.

Se utilizó un kilogramo de hojas secas y molidas, se humectó con etanol 70° GL, y se obtuvo por percolación un volumen equivalente a un litro de extracto fluido, el cual se concentró en evaporador rotativo Heidolph® a 37 ºC y 110 mbar de presión constante hasta obtención de extracto seco (235 g) con un rendimiento de 23,5%.

INFECCIÓN EXPERIMENTAL CON LEISHMANIASIS         

La muestra de Leishmania   sp. fue aislada de un paciente voluntario procedente del distrito de Salpo, provincia de Otuzco, departamento de La Libertad, e inoculada directamente en tubos con cultivo Schneider suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) (inactivado a 56 °C, durante 30 minutos). Como antimicrobiano se empleó gentamicina (80 mg/2 mL) y se incubó por diez días a 25 ºC. Se realizó recuento para determinar la concentración de promastigotas en el cultivo ⁽¹⁷⁾.

Se emplearon 20 ejemplares machos de M. auratus de tres meses de edad con un peso promedio de 50 g, adquiridos en el bioterio de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo. Los ejemplares fueron infectados con inóculo de 500 promastigotas/mL, aplicando la inyección intradérmica en el dorso de la nariz ⁽¹⁸⁾, previa desinfección del área de la piel utilizando alcohol yodado como antiséptico, y empleando material aséptico y jeringas descartables de forma individual. Se realizó un seguimiento que duró 60 días hasta la aparición de lesiones características de leishmaniasis y mediante frotis del aspirado de las lesiones utilizando coloración Wright y lectura microscópica a 100X, se procedió confirmar la enfermedad y distribuir los grupos experimentales.

El grupo control estuvo conformado por diez ejemplares infectados experimentalmente con Leishmania sp; a los que se les administró solución salina durante 15 días. Por otro lado, el grupo tratado incluyó diez ejemplares infectados experimentalmente con Leishmania sp.; a los que se les administró el extracto de T. integrifolia a la dosis de 250 mg/kg/ día vía intramuscular durante 15 días.

El seguimiento de la evolución del grupo tratado se realizó diariamente por control fotográfico, para comparar la evolución de las lesiones frente al grupo control. Se realizaron frotis con el exudado de las lesiones utilizando coloración Wright y lectura microscópica a 100X. El porcentaje de efectividad se obtuvo en base al número de animales con diagnóstico negativo y diagnóstico positivo postratamiento.

AISLAMIENTO Y SEPARACIÓN DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS

Se utilizó una columna cromatográfica de 45 cm, con un diámetro de 2,5 cm, que contiene Silicagel G-60, de 70-230 mesh (Sigma-Aldrich®), usando como fase móvil: hexano-acetato de etilo (2:3). Las fracciones cromatográficas se unieron de acuerdo a la similitud de sus cromatogramas y se realizó mediante cromatografía en capa fina (TLC) con placas de aluminio de Silicagel 60 F₂₅₄ (Merck) y fase móvil: hexano-acetato de etilo (1:1). Finalmente se obtuvieron nueve fracciones: F1 (4,1 g), F2 (2,1 g), F3 (1,9 g), F4 (0,8 g), F5 (3,6 g), F6 (4,2 g), F7 (3,4 g), F8 (2,3 g) y F9 (5,5 g).

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD LEISHMANICIDA IN VITRO DE LAS FRACCIONES CROMATOGRÁFICAS

Se obtuvieron macrófagos de los ejemplares, administrando vía intraperitoneal (v.i.p.) 3 mL de solución de Hank´s a las 24 horas y 48 horas; a las 72 horas se administró 5 mL de medio Waymouth v.i.p., diez minutos después se realizó el sacrificio de los animales de experimentación mediante asfixia con CO₂. Se abrió asépticamente el área abdominal realizando incisión con el escalpelo para obtener mediante jeringas estériles el exudado peritoneal, que fue llevado directamente a las placas de cultivo celular que contenían medio Waymouth con 1 ml de solución de gentamicina (40 mg) y se añadió la suspensión de cultivo de Leishmania sp. (200 promastigotas/mL). Seguidamente, las placas de cultivo fueron sometidas a un proceso de incubación a 25 °C con una atmósfera de 5% de CO₂ durante 24 horas ⁽¹⁹⁾, hasta la aparición de formas amastigotes dentro del macrófago. Luego los cultivos fueron expuestos a las fracciones cromatográficas a una concentración de 14 µg/mL diluida en dimetilsulfóxido y cultivados a 25 °C durante 24 horas. Los ensayos se realizaron por cuadriplicado para cada fracción cromatográfica y se compararon con un grupo control. Se realizó el conteo realizando frotis con coloración Wright y lectura microscópica a 100X, para evaluar la infección parasitaria en los macrófagos.

ELUCIDACIÓN DEL COMPUESTO CON ACTIVIDAD LEISHMANICIDA

Lo restante de la fracción cromatográfica activa F8 (0,1974 g) fue enviada a la Central Analítica del Instituto de Química de la Universidad de São Paulo (IQUSP) de Brasil para su purificación, cristalización y análisis mediante RMN ¹H y ¹³C en el equipo Bruker AIII 500 MHz, solvente: cloroformo deuterado (CDCl₃) y cromatografía líquida acoplada a espectroscopia de masa (MAxis 3G - Bruker Daltonics).

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

La evaluación de los resultados obtenidos se realizó mediante la prueba de análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey (HSD). Los análisis consideran un nivel de significancia del 95% y fueron realizados mediante el software Microsoft® Office Excel 2016 para Microsoft® Windows.

ASPECTOS ÉTICOS

El uso y manejo de los animales de experimentación se realizó de acuerdo a Guide for  the Care and Use of Laboratory Animals ⁽²⁰⁾. La investigación fue aprobada por el Comité de Ética de la Universidad Nacional de Trujillo.

RESULTADOS

El extracto fluido de T. integrifolia presentó actividad leishmanicida a la dosis de 250 mg/kg/día en M. auratus con infección experimental de leishmaniasis, evidenciando disminución de las lesiones en el dorso de la nariz (Figura 1). La efectividad del tratamiento fue obtenida en relación al número de animales con diagnóstico negativo y positivo, posterior a los 15 días de tratamiento, observando una efectividad del 95% en el grupo que recibió dosis del extracto en comparación al grupo control.

 

 

En la evaluación de la actividad leishmanicida de las nueve fracciones cromatográficas obtenidas del extracto fluido de las hojas de T. integrifolia, la fracción F8 demostró mayor actividad sobre macrófagos infectados a dosis de 14 μg/mL (Figura 2). El análisis estadístico ANOVA muestra diferencia significativa entre los grupos (p<0,05) y según la prueba HSD de Tukey, hay diferencia significativa para la fracción F8 en relación a las demás fracciones.

El espectro de RMN de ¹³C del compuesto aislado mostró señales para quince átomos de carbono y el espectro de RMN ¹H mostró señales para 24 protones (Tabla 1).

 

 

 

 

La elucidación estructural del compuesto aislado de la fracción F8 (10 mg) dio como resultado un sesquiterpeno tipo eudesmano ((4αS, 5R,6R,8αR)-6-hidroxi-5,8α-dimetil-3-(1-metiletiliden) octahidronaftalen-2(1H)-ona), cuya estructura se muestra en la Figura 3, según los análisis resultantes de RMN 1H, 13C y LC/MS.

DISCUSIÓN

La evaluación leishmanicida in vivo se realizó mediante la infección experimental en M. auratus, se observó que los especímenes del grupo control mostrando lesiones características de la infección en la zona del dorso de la nariz, donde se le inyectó promastigotas de Leishmania. Las lesiones fueron evidentes en los especímenes a los 60 días posteriores a la infección experimental. Los especímenes del grupo tratado que recibieron el tratamiento con el extracto de T. integrifolia a dosis de 250 mg/kg vía intramuscular durante 15 días, observándose una mejoría de las lesiones en el dorso de la nariz de los hámsters al término del tratamiento.

 

 

La efectividad del tratamiento fue obtenida en relación al número de animales con diagnóstico negativo y con diagnóstico positivo postratamientos de 15 días, observando una efectividad del 95 % en el grupo tratado que recibió dosis del extracto en comparación al grupo control. En la evaluación leishmanicida in vivo se utilizó al M. auratus por ser altamente susceptible a varias especies de Leishmania, además se ha reportado que la susceptibilidad de los hámsters, es principalmente en los machos ⁽²¹⁾, presentándose incremento de citoquinas a nivel intracelular como la IL-4, IL-10 y el TGF-β ⁽²²⁾ como respuesta inmune de tipo mixta, que se observa en los diferentes lugares de infección. Los lugares anatómicos para la inoculación en los hámsteres son la cara dorsal del tarso, la base de la cola (región lumbosacra), la nariz (vía intradérmica) y el cojinete plantar ⁽²³⁾.

La fracción F8 se purificó con solventes orgánicos hasta la obtención de cristales de color blanco en forma de agujas (10 mg), que fueron analizados mediante RMN de ¹H y ¹³C y cromatografía líquida acoplada a espectroscopia de masas (LC/ MS) obteniendo un solo compuesto puro de esta fracción. El espectro de masas presenta la especie [M⁺¹] de 237,19 m/z, el análisis del fraccionamiento de la molécula corrobora la propuesta de estructura que corresponde a la fórmula C₁₅H₂₄O₂.

De todo lo anterior, se infiere la presencia de al menos un componente biológicamente activo en T. integrifolia, que no ha sido reportado en trabajos anteriores con la misma especie, como el de Ono et al. que reporta el aislamiento y elucidación estructural de cinco compuestos eudesmanos, denominados integrifósidos A, B, C, D e integrifonol A ⁽¹³⁾, así también, Wu et al. realizaron una revisión de las estructuras y actividades biológicas de 972 sesquiterpenoides de tipo eudesmano de 247 especies (de 110 géneros) de la familia Asteraceae, en el cual no se reportó el compuesto aislado ⁽²⁴⁾. Al respecto, los sesquiterpenos de tipo eudesmano han mostrado actividad leishmanicida, como lo reporta la investigación realizada por García et al. donde evalúa el extracto etanólico y hexánico de hojas de la especie Pluchea carolinensis, atribuyendo a este tipo de estructuras eudesmanos como posibles responsables de la actividad leishmanicida ⁽²⁵⁾.

Hussain et al. realizaron una revisión de múltiples compuestos con actividad leishmanicida, de los cuales destacan los terpenos, algunos de ellos extraídos de Cistus monspeliensis y Cistus creticus que han mostrado muy buena actividad ⁽²⁶⁾. De estas sustancias extraídas, la de mayor interés con esta investigación, por su similitud estructural, es el óxido ent-3βacetoxi-13-epi-manoil (ribenol), estructura también reconocida por Chan et al. ⁽²⁷⁾ junto con Loukaci et al. ⁽²⁸⁾ que mencionan que tanto ribenol como sus derivados óxido ent-manoil presentan actividad contra promastigotes y amastigotes de Leishmania donovani. Además, cabe resaltar que Chan et al. adicionan que los derivados modificados de ribenol presentan mayor actividad que la misma. Ribenol muestra gran similitud estructural con la estructura aislada, tal y como se puede observar en la Figura 4, es por ello que planteamos que el mecanismo de actividad de esta última sea muy similar o igual al de ribenol.

Entre las principales limitaciones del estudio, tenemos que el compuesto aislado no pudo ser ensayado posteriormente en los modelos leishmanicidas in vitro e in vivo, debido a la concentración insuficiente que quedó luego de realizados los análisis de RMN de ¹H y ¹³C en Brasil. Además, en este trabajo se utilizó cultivos de Leishmania sp aislados de pacientes, por lo que también hubiera sido importante, evaluar la actividad leishmanicida en cultivos estándar de diversas especies de Leishmania, esto último no afecta la validez de los resultados, pero deja una base para continuar con esta investigación y complementarla.

 

 

Se concluye que el extracto fluido de hojas de T. integrifolia presenta actividad leishmanicida en M. auratus infectados experimentalmente a la dosis de 250 mg/kg/día vía intramuscular durante 15 días. Se determinó que la fracción F8 del extracto fluido de las hojas de T. integrifolia presenta actividad leishmanicida sobre macrófagos infectados a dosis de 14 µg/ mL. Se elucidó de esta fracción F8 un compuesto sesquiterpeno de tipo eudesmano, según los resultados del análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) de ¹H, ¹³C, y cromatografía líquida acoplada a espectroscopia de masa (LC/MS).

 

Agradecimientos: A la Dra. María S. Aurora Prado, docente de la Facultad de Farmacia de la Universidad de São Paulo por su apoyo con los análisis de RMN ¹H y ¹³C.

Contribuciones de los autores: CS, JL, MG, JG, SG, VV y CG participaron en la concepción y diseño del artículo. MG, SG, CG obtuvieron financiamiento. CS y JC escribieron la primera versión del manuscrito. CS, JG y VV participaron en el análisis e interpretación de los datos. Todos los autores revisaron en forma crítica las versiones del manuscrito y aprobaron su versión final.

Fuentes de financiamiento: autofinanciado.

Conflicto de intereses: los autores declaran no tener conflictos de interés.

 

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Correspondencia: Carmen Rosa Silva Correa
Dirección: Calle Moscú N° 331, Urbanización San Nicolás, Trujillo, Perú
Teléfono: (+51) 964112623
Correo electrónico: csilva@unitru.edu.pe

 

Recibido: 26/09/2017
Aprobado: 28/03/2018
En línea: 25/06/2018