Elaboración de la fracción clorofórmica de Piper aduncum

Las hojas de Piper aduncum fueron colectadas de la zona del bajo Kimiri, distrito de la Merced, provincia de Chanchamayo, departamento de Junín, en las coordenadas 11°02’16.5”S 75°18’54.0”W. Se colectaron hojas que se encontraron de manera silvestre, y de estas una muestra fue identificada taxonómicamente como Piper aduncum L. por el museo de historia natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Para la elaboración del extracto metanólico (PAMo) y la fracción clorofórmica (PAMoCl) de Piper aduncum, se usaron protocolos estandarizados en el laboratorio de Química y Bioquímica de los Productos Naturales de la Universidad Científica del Sur ¹¹.

Brevemente, las hojas fueron limpiadas y secadas a 40 °C durante dos días, posteriormente trituradas y tamizadas con una malla de 1 mm. Luego se pesaron 70 g de hojas en polvo, se adicionaron 300 mL de metanol y se filtró a través de un papel filtro Whatman n.^o 1. Este procedimiento se repitió 8 veces, de las cuales las 3 últimas se sonicaron durante 2 horas. Todo el PAMo fue filtrado usando una membrana de 0,44 µm. Para obtener la fracción clorofórmica de Piper aduncum (PAMoCl), el PAMo se concentró a 200 mL y se sometió a extracción con cloroformo agregando 300 mL de cloroformo en un tubo de decantación de 1 L. Esta operación se repitió 8 veces. La PAMoCl se concentró a presión reducida con un rotavapor. PAMo y PAMoCl fueron analizados por cromatografía en capa fina (TLC) usando gel de sílice 60 para la fase estacionaria y benceno-acetona 8:1 como fase móvil, se reveló con yodo y luz ultravioleta (UV) ¹². Se realizaron ensayos complementarios para identificar grupos químicos tanto para PAMo como para PAMoCl de acuerdo los protocolos descritos por Lock ¹³. Por último, la PAMoCl se llevó a una concentración de 32 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO) y se almacenó a -80 °C para su posterior uso. Los solventes usados son de grado analítico y se adquirieron de la empresa Merck.

Cultivo de líneas celulares

Las líneas celulares de cáncer gástrico humano AGS (primario) y KATO III (metastásico) se adquirieron de la Colección Eu ropea de Cultivos Celulares Autenticados (ECACC 89090402 y 86093004). La línea celular 293T (ATCC® CRL-3216TM) se obtuvo del laboratorio de Genética Molecular de la Universidad Científica del Sur.

Las células AGS y 293T fueron cultivadas con DMEM-F12 (Biowest) suplementado con suero fetal bovino al 10% y solución antibiótica-antimicótica al 1% (DMEM-F12 completo). Mientras que la línea celular KATO III se cultivó con medio RPMI (Biowest) suplementado con suero fetal bovino al 20% y solución antibiótica-antimicótica al 1% (Biowest). Todas las células fueron incubadas a 37 °C con 5% de CO₂ y subcultivadas cuando la confluencia fue del 70-80%.

Ensayo de viabilidad celular

El ensayo de viabilidad celular se realizó como se describió previamente ¹⁴. Las células AGS y 293T fueron contadas usando una cámara de Neubauer y se sembraron 5 × 10³ células/pocillo en placas de 96 pocillos. Mientras que las células KATO III se sembraron en una cantidad de 10⁴ células/pocillo. Todas las células se incubaron durante 12 horas, luego se trataron con 1,25 µg/mL, 2,5 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 20 µg/mL, 40 µg/mL, 80 µg/mL y 160 µg/mL de PAMoCl, y nuevamente se incu baron durante 24 y 48 horas. Además, se incluyó un grupo control que tiene el vehículo (DMSO al 0,5%) pero no el PAMoCl. Para el análisis de la viabilidad celular, se añadieron 20 µL de resazurina (0,15 mg/mL) a cada pocillo y se incubó durante 3 horas. Por último, las placas de 96 pocillos fueron leídas con un lector de placas multimodal Synergy LX (Biotek) por espectro fotometría a las longitudes de onda de 570 nm y 600 nm. Se realizó el cálculo de la concentración de PAMoCl que ocasiona la inhibición del crecimiento celular en un 50% (IC₅₀) con respecto al crecimiento del grupo control.

Observación de la morfología celular

Los cambios en la morfología celular después de la incubación de las células AGS, KATO III y 293T con PAMoCl fueron obser vados y fotografiados en un microscopio invertido de contraste de fases (Nikon Eclipse TI) después de 24 y 48 horas.

Evaluación del ciclo celular por citometría de flujo

Para la evaluación del efecto de PAMoCl en el ciclo celular se siguió el protocolo de Darzynkiewicz et al.  ¹⁵ con ligeras modi ficaciones. Se sembraron 350 000 y 500 000 células en placas petri de 100 × 15 mm con medios DMEM-F12 y RPMI, ambos completos de las líneas celulares AGS y KATO III, respectivamente. Después de 24 horas, el medio de cultivo fue reemplazado con nuevo medio DMEM-F12 y RPMI completo que contenían el PAMoCl a las concentraciones de 19,62 y 39,23 µg/mL para las células AGS y 87,49 y 160 µg/mL para las células KATO III; estas concentraciones se obtuvieron del ensayo de viabilidad celular. Todas las placas fueron incubadas por 24 horas a 37 °C y 5% de CO₂. Después de transcurridas 24 horas, las placas fueron lavadas dos veces con Buffer Fosfato Salino (PBS) 1X y tripsinizadas durante 5 minutos. Las células resuspendidas fueron colectadas por centrifugación y fijadas con etanol frío al 70%. Luego se incubaron a 4 °C durante 30 minutos y una vez transcurrido este tiempo, las células fueron teñidas con una solución de Yoduro de Propidio (50 µg/mL) y RNasa (100 µg/mL) por 30 minutos adicionales e inmediatamente analizadas en el citómetro de flujo Guava EasyCyte (Merck).

Análisis de los datos

Los datos de absorbancia obtenidos del ensayo de viabilidad celular fueron exportados a un archivo de Microsoft Excel y ex presadas en porcentajes con respecto al grupo control. Para la relación dosis-respuesta y el cálculo de los valores de IC₅₀, se usó un modelo de regresión no lineal. Las diferencias significativas entre grupos fueron comparados usando la prueba de ANOVA de una vía con la prueba de Tukey, como prueba post hoc (p < 0,05), usando el programa GraphPad Prism. Los resultados de ciclo celular fueron analizados usando el programa FCS 7 Express (DeNovo solutions). Los datos analizados son el resultado de tres experimentos independientes.

Efecto de la fracción clorofórmica del extracto metanólico de Piper aduncum sobre la viabilidad celular

Del ensayo de viabilidad celular se observó actividad citotóxica de PAMoCl en todas las líneas celulares evaluadas, obtenién dose los siguientes resultados de IC₅₀ para las 24 horas: 39,23 µg/mL; 87,49 µg/mL y 74,10 µg/mL y a las 48 horas 49,47 µg/mL; 64,68 µg/mL y 101,8 µg/mL para las líneas celulares AGS, KATO III y 293T, respectivamente (Figura 2). A las 48 horas, se observó que los valores de IC₅₀ de PAMoCl son significativamente menores para las líneas AGS y KATO III comparados con el de la línea 293T (control de citotoxicidad) con valores de p<0,01 y p<0,05, respectivamente (Figura 3).

Figura 2 Efecto de la fracción clorofórmica del extracto metanólico de Piper aduncum (PAMoCl) en la viabilidad celular. Las líneas celulares 293T, AGS y KATO III fueron tratadas a diferentes concentraciones de PAMoCl (1,25; 2,5; 5; 10; 20; 40; 80 y 160 μg/mL) durante 24 y 48 horas. Se muestran gráficas de IC₅₀ que son curvas de viabilidad celular (%) dependientes del log10 de la concentración de PAMoCl (μg/mL) para cada línea celular. En la parte superior derecha de cada gráfica se muestran los valores de IC₅₀ a las 24 y 48 horas. 

Figura 3 Comparación de los valores de inhibición del crecimiento celular en un 50% (IC₅₀) para cada línea celular a las (A) 24 horas y (B) 48 horas. 

Observación de la morfología celular

Se observaron cambios de una manera dependiente de la dosis de PAMoCl en la morfología de las células AGS, KATO III y 293T (Figura 4). En la línea celular AGS, después del tratamiento de 24 horas con PAMoCl, se observó que a partir de 20 µg/mL las células empezaban a contraerse y otras a resuspenderse. En concentraciones mayores, 80 µg/mL y 160 µg/mL, se observó mayor cantidad de fragmentos celulares, pocas células resuspendidas y ninguna adherida. A las 48 horas el efecto observado fue similar. En la línea celular KATO III, se empiezan a observar células muertas (Figura 4) a partir de 80 µg/mL tanto para las 24 y 48 horas. En la línea celular 293T, después del tratamiento de 24 horas con PAMoCl, se observó que a partir de 80 µg/mL las células empezaban a contraerse y a 160 µg/mL se observó mayor cantidad de células contraídas y resuspendidas, sin embargo, aún podían observarse células adheridas a la placa de cultivo. A las 48 horas el efecto observado fue similar.

Figura 4 Efecto de la fracción clorofórmica del extracto metanólico de Piper aduncum a concentraciones de 5 μg/mL, 20 μg/mL y 80 μg/mL en la morfología de las líneas celulares de cáncer gástrico AGS, KATO III y de riñón humano 293T. También se muestra un grupo control de células sin tratamiento, pero con el vehículo (DMSO 0,5%) para cada línea celular. A.T. 100X. Flecha roja: células resuspendidas; flecha azul: células adheridas, flecha blanca: célula contraídas; y flecha negra: células muertas 

Efecto en el ciclo celular

Los resultados mostraron efecto en el ciclo celular sobre las líneas de cáncer gástrico. En las células AGS, el porcentaje de cé lulas en fase G2/M fue 31,8%; 44,1% y 52,7% para las concentraciones de 0 µg/mL; 19,62 µg/mL y 39,23 µg/mL de PAMoCl, respectivamente (Figura 5 A-C). En las células KATO III, el porcentaje de células en fase G2/M fue: 30,9%; 29,3% y 49,0% para las concentraciones de 0 µg/mL; 87,49 µg/mL y 160 µg/mL de PAMoCl, respectivamente (Figura 5 D-F).

Figura 5 Análisis de citometría de flujo para el ciclo celular de las líneas celulares de cáncer gástrico AGS y KATO III tratadas con la fracción clorofórmica del extracto metanólico de Piper aduncum (PAMoCl). Se muestran histogramas que indican la cantidad de ADN marcado por yoduro de propidio. Considerándose tres grupos para cada línea celular: A) grupo control con células AGS sin PAMoCl pero con el vehículo; B) células AGS tratadas con 19,62 μg/mL de PAMoCl; C) células AGS tratadas con 39,23 μg/mL de PAMoCl; D) grupo control con células KATO III sin tratamiento, pero sí con el vehículo; E) células KATO III tratadas con 87,49 μg/mL de PAMoCl; F) células KATO III tratadas con 160 μg/mL de PAMoCl. Data cruda de citometría de flujo (curva negra), G1: Gap 1 (curva roja), S: síntesis (curva azul) y G2/M: Gap 2/mitosis (curva verde), fases del ciclo celular.