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INTRODUCCIÓN
La leishmaniasis es una enfermedad desatendida de importancia en salud pública, debido a su alta incidencia y amplia distribución geográfica. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la leishmaniasis se encuentra en 98 países, con más de 12 millones de personas infectadas con 20 000 a 30 000 muertes al año. Se estima que, más de 350 millones de personas se encuentran en riesgo de padecer esta zoonosis, con casos nuevos que oscilan entre 700 000 y un millón, afectando principalmente a las poblaciones que viven en zonas de difícil acceso, con ausencia de los servicios básicos, nivel educativo e ingresos económicos bajos 1.
En Colombia, se estima que más de 11 millones de personas se encuentran en riesgo de padecer leishmaniasis, reportándose 12 000 casos nuevos anuales desde el año 2005 2. Para el año 2019, se presentaron 5082 casos, de los cuales el 98,9% correspondió a leishmaniasis cutánea (LC), 1,0% a leishmaniasis mucocutánea (LMC) y el 0,2% a leishmaniasis visceral (LV) 3.
Esta zoonosis es causada por flagelados del género Leishmania (Kinetoplastea: Trypanosomatidae), los cuales desarrollan su ciclo de vida entre insectos flebotomíneos (Diptera: Psychodidae, Phlebotominae) que actúan como vectores y mamíferos de hasta siete órdenes que ejercen como reservorios 4. Roedores y marsupiales, han sido reportados con elevada frecuencia de infección por Leishmania, siendo Didelphis marsupialis (Didelphimorphia: Didelphidae), el reservorio silvestre primario en varias regiones de Latinoamérica, incluyendo Colombia 4-7. La distribución de la leishmaniasis en humanos coincide con la distribución de los vectores y potenciales reservorios, enmarcados en los hábitats que ocupan, conformando sistemas ecológicos que favorecen los ciclos de transmisión 4.
En el Municipio de El Carmen de Bolívar, localizado en Los Montes de María, al norte de Colombia, uno de los focos más importantes de LV del país; se han registrado 325 casos de leishmaniasis en humanos. Entre 2008 y 2019, se registraron 75 casos de LV en esta región, lo cual se sumó a la presencia de Lutzomyia evansi, uno de los vectores primarios 3,8. Los Montes de María presenta muchos registros de esta zoonosis, sin embargo, son pocos los estudios sobre los reservorios silvestres en esta localidad, principalmente en las veredas, definidas como un núcleo rural cercano a un centro urbano con la presencia de 50 a 1200 habitantes. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar el papel de D. marsupialis como potencial reservorio de parásitos tripanosomátidos en esta área del norte de Colombia.
EL ESTUDIO
Área de estudio
La investigación fue realizada en la Vereda El Alférez, zona rural del Municipio de El Carmen de Bolívar (Departamento de Bolívar, 09º45’38.0” N - 075º10’19.1” O), ubicado a 200 metros sobre el nivel del mar (msnm) con temperatura entre 26-30 °C, pluviosidad bimodal y humedad relativa entre 75-85% 9. Los asentamientos humanos en esta vereda están sobre un bosque seco tropical, en el cual, los pobladores desarrollan cultivos de árboles frutales con predominio del cacao, aguacate y árboles maderables, ambas fuentes de la actividad económica de la región (Figura 1).
Recolecta y toma de muestras de sangre en mamíferos silvestres
Se realizaron cinco muestreos desde enero de 2018 hasta abril de 2019, usando 21 trampas Tomahawk® (66,04 cm × 22,86 cm × 22,86 cm) por tres noches consecutivas desde las 18:00 a 06:00 horas en el ecótopo peridoméstico (PD), que corresponde a los alrededores de la vivienda (hasta 50 m en diámetro), con presencia de animales domésticos (aves de corral, cerdos y vacas) y referencia de animales sinantrópicos (roedores, marsupiales y armadillos), y en el ecótopo silvestre (S) (área interna al bosque a 1 km del PD) 9. Para el muestreo de ambos ecótopos se tuvo un esfuerzo de captura de 3024 horas.
Los individuos recolectados e identificados taxonómicamente fueron anestesiados para tomar sus medidas morfométricas, tales como longitud total, longitud de la cola y la longitud de la pata, así como para la estimación del peso y toma de muestras de sangre siguiendo el procedimiento descrito por Ardila et al.8. A cada animal le fue implantado por vía subdérmica un sistema por radiofrecuencia (Radio-frequency identification [RFID], por sus siglas en inglés), para su seguimiento y registro de eventual recaptura. Los animales fueron liberados, una vez recuperados de la anestesia, y las muestras de sangre fueron rotuladas y refrigeradas a -20 °C para su análisis molecular en el Laboratorio de Biomédicas del grupo Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Sucre. Todos los individuos fueron legalmente recolectados de acuerdo con el «Permiso Marco de Recolección de Especímenes de Especies Silvestres de la Diversidad Biológica con Fines de Investigación Científica No Comercial», Resolución 0391 del 11 de abril de 2016 expedido por la Autoridad Nacional de Licencias Ambientales (ANLA), otorgado a la Universidad de Sucre.
Detección molecular de parásitos tripanosomátidos
La extracción del ácido desoxirribonucleico (ADN) total de las muestras de sangre fue realizada con el kit de purificación de ADN de Wizard® Genomic (Promega Corporation: Madison, Wisconsin, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante.
La concentración de ADN total fue cuantificada usando un NanoDrop 1000TM (Thermo Scientific, Massachusetts, USA) y el diagnóstico molecular fue realizado mediante la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) de la secuencia altamente repetitiva del ADN de los minicírculos del kinetoplasto (ADNk), usando los cebadores 13A (5’-GGCCCACTATATTACACCAACCC-3’) y 13B (5’-GGGGTAGGGGCGTTCTGCGAA-3), los cuales delimitan un fragmento de 120 pb 10. Los cebadores XAHR 17 (5’-CGGAACCGCTCATTGCC-3’) y XAHR 20 (5’-ACCCACACTGTGCCCATCTA-3’) fueron usados para la detección del gen β-actina característicos de vertebrados como control interno, los cuales delimitan un fragmento de 289 pb 11. Como control positivo se tomó el ADN de Leishmania guyanensis y como control negativo el ADN de una zarigüeya libre de la infección.
La mezcla de PCR fue realizada con un volumen final de 23,0 µL de los cuales 3,0 µL correspondieron al ADN blanco y los 20 µL restantes a la mezcla de reacción, la cual contuvo 2,4 µL de búfer PCR (5X); 1,25 µL de Taq ADN polimerasa (Thermo SCIENTIFIC); 0,18 µL de los cebadores 13A y 13B; 0,12 µL de los cebadores XAHR 17 y XAHR 20 y 5,16 µL de agua miliQ estéril de alto grado molecular.
La PCR fue llevada a cabo en el termociclador Veriti 96 Well (Applied Biosystems, Carlsbad, USA®) en condiciones de desnaturalización a 95,0 °C por 20 seg (40 ciclos), alineamiento a 57,6 °C por 40 segundos (40 ciclos) y extensión a 72 °C por 5 min Los productos de PCR obtenidos (7 µL) fueron sometidos a electroforesis horizontal (80 v por 70 min) en gel de agarosa al 1,5% revelado con bromuro de etidio preparado en búfer TBE (Tris-Borato-EDTA) 5X, y visualizados en sistema de foto documentación Quantum-STA (Bio-Rad, California, USA®).
Las muestras positivas revelaron presencia de bandas de 120 pb, utilizando como referente los controles positivos y un marcador de tamaño molecular 1000 pb (Fermentas, Thermo Fisher Scientific®, Massachusetts, USA). Adicionalmente, se evaluaron cepas de especies del género Trypanosoma: Trypanosoma cruzi y T. rangeli, y con la herramienta Primer-Blast (disponible en línea en el Centro Nacional de Información Biotecnológica [NCBI, por sus siglas en Inglés]) se realizó una búsqueda de alineamiento local para evaluar la especificidad de los cebadores usados.
Análisis de los datos
La abundancia de mamíferos recolectados y la frecuencia de infección con parásitos tripanosomátidos fue analizada con estadística descriptiva. Se buscaron las asociaciones entre estadio, sexo y porte morfológico de los mamíferos recolectados con respecto a la frecuencia de infección mediante una regresión binomial, usando Statgraphics versión 17.
HALLAZGOS
Se recolectaron 30 individuos de D. marsupialis (Figura 2), de los cuales el 66,7% (20/30) fueron adultos y el 33,3% (10/30) juveniles. El 40,0% (12/30) correspondió a machos y el 60,0% (18/30) a hembras, de las cuales el 33,3% (6/18) presentaron crías en el marsupio a razón de siete crías por hembra (Tabla 1).
Figura 2 Individuo de Didelphis marsupialis en trampa Tomahawk® recolectado en la vereda El Alférez, Municipio de El Carmen de Bolívar, Colombia.
Tabla 1 Datos morfológicos de individuos de Didelphis marsupialis recolectados en la Vereda El Alférez, El Carmen de Bolívar, Colombia.
| Individuo | Estadio (edad) | Sexo | Peso (g) | Medidas corporales (mm) | No. de crías | Análisis PCR | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| LT | LC | LP | LO | ||||||
| 1 (Dm001) | Adulto | ♂ | 1700 | 710 | 400 | 46 | 45 | N/A | + |
| 2 (Dm002) | Juvenil | ♂ | 1384 | 825 | 375 | 41 | 48 | N/A | + |
| 3 (Dm003) | Juvenil | ♂ | 1612 | 830 | 430 | 47 | 48 | N/A | + |
| 4 (Dm004) | Adulto | ♀ | 1400 | 850 | 450 | 47 | 46 | 7 | + |
| 5 (Dm005) | Adulto | ♀ | 1269 | 840 | 360 | 120 | 48 | 7 | + |
| 6 (Dm006) | Adulto | ♀ | 1270 | 860 | 390 | 50 | 41,9 | 6 | - |
| 7 (Dm007) | Adulto | ♀ | 1042 | 790 | 340 | 35 | 40 | 6 | + |
| 8 (Dm008) | Juvenil | ♂ | 996 | 840 | 310 | 40 | 50 | N/A | + |
| 9 (Dm009) | Adulto | ♀ | 1719 | 910 | 430 | 50 | 60 | 7 | - |
| 10 (Dm010) | Adulto | ♂ | 2169 | 1010 | 450 | 160 | 70 | N/A | + |
| 11 (Dm011) | Adulto | ♂ | 2409 | 1000 | 410 | 36 | 46 | N/A | + |
| 12 (Dm012) | Adulto | ♂ | 2909 | 1020 | 380 | 128 | 41 | N/A | + |
| 13 (Dm015) | Juvenil | ♂ | 1241 | 780 | 380 | 150 | 60 | N/A | - |
| 14 (Dm016) | Juvenil | ♀ | 411 | 860 | 270 | 120 | 40 | N/A | + |
| 15 (Dm018) | Juvenil | ♀ | 547 | 690 | 340 | 150 | 50 | N/A | + |
| 16 (Dm023) | Adulto | ♀ | 2020 | 910 | 440 | 180 | 50 | 7 | + |
| 17 (Dm024) | Juvenil | ♀ | 353 | 610 | 310 | 120 | 30 | N/A | - |
| 18 (Dm025) | Juvenil | ♀ | 157 | 650 | 300 | 130 | 40 | N/A | - |
| 19 (Dm026) | Adulto | ♂ | 1675 | 850 | 400 | 160 | 46 | N/A | - |
| 20 (Dm027) | Juvenil | ♀ | 895 | 1080 | 360 | 120 | 35,3 | N/A | + |
| 21 (Dm028) | Adulto | ♀ | 781 | 1050 | 380 | 120 | 43,18 | N/A | - |
| 22 (Dm029) | Adulto | ♀ | 1172 | 1180 | 380 | 140 | 37,99 | N/A | - |
| 23 (Dm030) | Adulto | ♀ | 1052 | 1120 | 350 | 130 | 44,2 | N/A | - |
| 24 (Dm031) | Adulto | ♀ | 1256 | 1220 | 400 | 150 | 49,34 | N/A | - |
| 25 (Dm032) | Adulto | ♀ | 1055 | 1070 | 350 | 150 | 25,4 | N/A | - |
| 26 (Dm033) | Adulto | ♂ | 1790 | 1240 | 400 | 150 | 26,9 | N/A | - |
| 27 (Dm034) | Adulto | ♂ | 1975 | 840 | 340 | 115 | 35 | N/A | - |
| 28 (Dm035) | Adulto | ♀ | 2471 | 790 | 340 | 130 | 50 | N/A | - |
| 29 (Dm036) | Juvenil | ♂ | 340 | 420 | 180 | 70 | 30 | N/A | - |
| 30 (Dm038) | Adulto | ♀ | 1600 | 1170 | 340 | 150 | 50 | N/A | - |
♀: hembra; ♂: macho; g: gramos; LT: longitud total; LC: longitud de la cola; LP: longitud de las patas; LO: longitud de las orejas, mm: milímetros; +: muestra positiva; -: muestra negativa; N/A: no aplica.
El peso promedio de los individuos fue relativamente mayor en machos con respecto al de las hembras (1683 g vs.1138 g), mientras que la longitud total fue relativamente mayor en hembras en relación con los machos (362 mm vs. 244 mm).
El diagnóstico molecular de los parásitos tripanosomátidos sobre los didélfidos recolectados, reveló, una frecuencia de infección del 46,7% (14/30), de los cuales el 57,0% (8/14) fueron adultos y el 43,0% (6/14) juveniles (Figura 3). Teniendo en cuenta el sexo, se encontró una proporción 1:1 para las muestras positivas.
Figura 3 Electroforesis en gel de agarosa (1,5%-70 min/80 V) de los productos de reacción de ADN de minicírculos de kinetoplasto (ADNk) de 120 pb, a partir de la sangre total de individuos de Didelphis marsupialis, recolectados en zona rural del Municipio de El Carmen de Bolívar (Bolívar-Colombia). La banda de 120 pb corresponde al gen amplificado para la búsqueda de parásitos tripanosomátidos y la banda de 289 pb corresponde al control interno de ADN de vertebrados.
En el análisis de regresión binomial, se encontró que la única variable asociada (p=0,024) a la infección en individuos de D. marsupialis fue el estadio (8 adultos y 6 juveniles), mientras que las otras variables tales como el sexo (p=0,522), peso (p=0,131), longitud total (p=0,922), longitud de la cola (p=0,164) y longitud de la pata (p=0,074); presentaron valores de p>0,05.
DISCUSIÓN
La presente investigación responde a la búsqueda de tripanosomátidos en D. marsupialis, mamífero sinantrópico, propio de corredores biológicos entre ecótopos silvestres y urbanos, en la Vereda del Alférez (El Carmen de Bolívar, Norte de Colombia) donde se registraron 30 individuos, de los cuales el 46,7% (14/30) presentó infección por estos hemoflagelados. Los hallazgos fortalecen el estudio de los escenarios epidemiológicos en uno de los focos más importantes para la leishmaniasis y zona hipoendémica para la tripanosomiasis americana 9.
La Vereda de El Alférez se localiza en una zona boscosa, con viviendas pequeñas y con deficiencias estructurales, lo cual facilita la creación de un ambiente húmedo y cálido que favorece la entrada de los vectores de enfermedades tropicales 9,12,13. Estas condiciones se suman al manejo del PD para la cría de animales domésticos, lo que favorecería el contacto entre insectos hematófagos, mamíferos reservorios potenciales y parásitos 13.
Didelphis marsupialis es un animal muy ecléctico en cuanto a los hábitats y se le considera dentro de la mastofauna sinantrópica indicadora de afectación ambiental humana 4,14,15. Esta especie, en Latinoamérica, tiene una elevada frecuencia de infección con agentes causantes de leishmaniasis 4. Específicamente, en el norte de Colombia se han encontrado infectados con T. cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, con T. rangeli, que es infectivo para el humano, pero no patógeno 9 y también con Leishmania6. En algunos casos, como en Venezuela, D. marsupialis mantiene una coinfección Leishmania/T. cruzi7,16.
La proporción de tres hembras por cada dos machos de individuos de D. marsupialis hallados en el área de estudio podría ser indicativo de un tamaño poblacional bajo, ante una posible existencia de competencia a nivel intra e interespecífica por los recursos y depredación 15.
Los pesos hallados en los individuos, resultaron ser similares a los reportados por Lozada et al.17. El peso mayor en machos con respecto a las hembras podría deberse al periodo de reproducción de éstas con mayor gasto energético, coincidente con menor disponibilidad de agua y mayor irradiación solar en el período de muestreo (baja precipitación) 16,17.
La única variable asociada a la frecuencia de infección por parásitos tripanosomátidos en la población de D. marsupialis evaluada, fue el estadio del desarrollo (57,0% adultos positivos y 43,0% juveniles positivos); revelando que los adultos tienen mayor probabilidad de estar infectados en relación a los juveniles, probablemente porque los machos adultos de hábitos nocturnos y nómadas se exponen mucho más tiempo a los vectores que los juveniles, al igual que las hembras con crías que permanecen en las madrigueras en simpatría con los insectos hematófagos 5,8.
En Colombia, los estudios relacionados con la identificación de parásitos tripanosomátidos en reservorios están mayormente referidos a animales domésticos (principalmente el perro) en constante relación directa con el hombre e involucrados en el ciclo de mantenimiento de Leishmania chagasi18) y T. cruzi19. En Sincelejo, Sampués y Oveja; municipios del Departamento de Sucre, al norte de Colombia, se han reportado tazas de infección de 34,9%, 35,7% y 11,1%; respectivamente 18. Para la vereda objeto de estudio no se han realizado trabajos encaminados a la búsqueda de parásitos del género Leishmania y Trypanosoma en caninos.
El hecho de que el 46,7% de los individuos estudiados estuvieron positivos a parásitos tripanosomátidos por PCR de sangre obtenida del corazón, es poco común en la leishmaniasis, en la cual el parásito tiene un macrofagotropismo en tejidos «reclutadores». Esta presencia en sangre podría corresponder a la presencia de otras especies de parásitos tripanosomátidos, como T. cruzi y T. rangeli que han sido informadas en el área 9.
Los resultados de PCR aplicada mostraron la amplificación de la región conservada del minicírculo de las especies del género Leishmania en la muestras procesadas, sin embargo, una banda del mismo tamaño también amplificó en las cepas de T. cruzi y T. rangeli evaluadas posteriormente, así mismo, los resultados de la búsqueda de alineamiento local realizada con Primer-Blast, mostró que estos cebadores también se unen a tales parásitos, lo que contrasta con lo descrito en la literatura para la especificidad de este marcador, de este modo se amplía la base de organismos detectables a otros parásitos tripanosomátidos, pero se reduce la especificidad de la prueba. Los hallazgos representan un factor de riesgo para las poblaciones humanas puesto que todos estos parásitos están involucrados en la etiología de enfermedades tropicales desatendidas transmitidas por insectos hematófagos, por lo tanto, se deben tener en cuenta para el diseño y la evaluación de estrategias de control 10.
La infección de D. marsupialis con tripanosomátidos alcanza un equilibrio dinámico en la zona lo cual asegura el mantenimiento de los parásitos, no solo en tiempo, si no también en la geografía, debido a su alta tasa de crecimiento poblacional, el eclecticismo ecológico 15 y sus antecedentes como reservorio en Colombia 6 y Venezuela 7,16.
El estudio necesitaría profundizar en la caracterización de la especie de parásito tripanosomátido circulante en esta zona, utilizando marcadores genéticos más específicos o alternativamente ir a la secuenciación, lo cual fue una limitante, en las condiciones de financiamiento de las que se disponía.
En conclusión, el comportamiento sinantrópico de estos vertebrados, la frecuencia de infección con parásitos tripanosomátidos y el equilibro dinámico observado entre el parásito y los vertebrados, indican la presencia de ciclos rurales de transmisión zoonótica lo cual eventualmente podrían afectar a los humanos de la Vereda El Alférez. Así mismo, evidencian la necesidad de mayor vigilancia de enfermedades transmitidas por vectores, ya que estos animales tienden a ser amplificadores de los parásitos o puentes de transmisión entre los ciclos rurales y urbano, constituyendo un elemento de riesgo adicional.
