Palabras clave: Lonchocarpus utilis, Anopheles benarrochi, actividad biocida, larvicida.

Keywords: Lonchocarpus utilis, Anopheles benarrochi, biocid activity, larvicide.

Los insecticidas químicos han sido las principales herramientas en la estrategia para controlar los vectores de la malaria en el mundo, pero han sido demostrados los efectos nocivos para la salud y el medio ambiente sumados a la aparición de insectos resistentes y el efecto letal sobre organismos benéficos (RAAA, 1993). En países como el nuestro, se presentan problemas adicionales como el alto costo de los insecticidas sintéticos, los suministros erráticos, la falta de materiales y de equipos de aplicación además de un conocimiento adecuado sobre su uso, agravando de esta manera la lucha antivectorial.

A la falta de recursos económicos, en nuestro país hay que agregar la dificultad de acceso por falta de medios de transporte, los que imposibilitan la aplicación el control de brotes epidémicos de manera oportuna.

Estos antecedentes motivan la búsqueda de métodos alternativos seguros y eficaces como las plantas con propiedades biocidas entre las que se encuentra Lonchocarpus utilis (Smith, 1930) o «barbasco» cuyo principio activo es la rotenona. Estas plantas constituyen fábricas naturales de plaguicidas botánicos con diversas propiedades biológicas.

En el Perú, la aparición de insecticidas sintéticos alejó a la rotenona de la actividad agrícola como insecticida, hasta ser casi olvidada por las nuevas generaciones de agricultores, a pesar de que la rotenona es un producto de exportación cuyo uso está regulado por organismos internacionales encargados de supervisar la toxicidad de los insecticidas (Lizárraga, 1993).

Se espera que el uso de productos alternativos autóctonos logrará reducir la importación de insecticidas y disponer de una herramienta que permita de manera oportuna actuar frente a la aparición de brotes epidémicos. Entonces es necesario retomar esta experiencia y tecnología para volver a utilizar este insecticida casi olvidado, por sus características de ser potente, de muy corto poder residual, baja toxicidad para el hombre y los animales de sangre caliente y sobre todo muy barato y compatible para el control de plagas en las diferentes zonas del Perú (CDPI-CIP, 1992).

El presente estudio evalúa en bioensayos de laboratorio la actividad biocida del extracto crudo de L. utilis sobre larvas de A. (Nys) benarrochi, vector de Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum en la llanura amazónica del Perú.

Material y métodos

Identificación de criaderos

Se obtuvieron larvas de Anopheles benarrochi de criaderos naturales de la localidad de Munichis, distante 30 km del distrito de Yurimaguas, provincia Alto Amazonas, departamento de Loreto. Se evaluaron los parámetros físico-químicos del agua de los criaderos utilizados en los bioensayos y para el mantenimiento de larvas en el laboratorio (Tabla 1).

Mantenimiento de la población blanco en condiciones de laboratorio

Se seleccionaron los individuos de 3er y 4to estadio de la misma especie y se colocaron para su observación por 2 días, en bandejas de plástico con agua de criadero a temperatura ambiente y alimentadas con pellet pulverizado para aves hasta el momento en que se realizaron los bioensayos (Nongrados, 1999). Para determinar la especie de mosquito existente en los criaderos muestreados, se utilizaron las claves entomológicas para adultos y estadíos larvarios de Consoli (1994); Calderón et al. (1995) y Gorham et al. (1973).

Obtención del extracto crudo

Las plantas de «barbasco» fueron obtenidas en las inmediaciones del distrito de Jeberos, ubicado aproximadamente a 15 minutos de Yurimaguas por vía aérea. En esta zona se cultivan los «barbascales» asociados a cultivos de yuca y piña. La identificación taxonómica de la planta como Lonchocarpus utilis, fue realizada en el Museo de Historia Natural de la Universidad nacional Mayor de San Marcos (Herbario USM).

L. utilis (Smith, 1930) «barbasco» ó «cube», es una planta arbustiva leguminosa de la Familia Papilionaceae, que se encuentra en toda la Amazonía, cuyo principio activo es la rotenona catalogado como insecticida tipo II (OMS, 1988).

Las raíces frescas en secciones de 2 cm de diámetro, se picaron y se sometieron a deshidratación a 50 °C por 48 horas. Luego las raíces secas fueron trituradas en un molino de mano y tamizadas por un colador de malla fina, obteniéndose como producto final un polvo fino que fue guardado en frascos herméticamente cerrados y mantenidos en lugar seco y sombreado (Vílchez, 1993). En los bioensayos se utilizó como formulación del biocida, el polvo de la raíz en agua destilada.

Preparación de los inóculos

Se tomó como dosis de referencia la utilizada por Gamarra (1940) de 25 y 10 g/L del polvo de raíz diluido de L. utilis en series de proporciones media y logarítmica, probadas previamente. Se prepararon 5 dosis pesándose 6,25; 3,1; 2,1; 1,0 y 0,15 g del polvo de la raíz de L. utilis y diluidas en un litro de agua destilada, se homogenizaron y se tamizaron obteniéndose las dosis finales de 6,25; 3,1; 2,1; 1,0 y 0,15 g/L. En los bioensayos se utilizó un inóculo de 1 mL de cada una de las dosis preparadas previamente.

Cada dosis del biocida fue probada por triplicado, contra 25 larvas de A. benarrochi, utilizándose en total 75 larvas por dosis y 25 larvas para los controles por cada dosis. En total se utilizaron 500 larvas con agua destilada y 500 con agua de criadero, sumando un total de 1000 larvas por réplica.

Eficacia y susceptibilidad de A. benarrochi frente a L. utilis

Se realizaron 7 réplicas para determinar la susceptibilidad y eficacia del polvo de la raíz de L. utilis sobre A. benarrochi. Los bioensayos se realizaron en vasos de plástico de 7,5 cm de ancho por 8,5 cm de alto. Cuatro vasos fueron usados por dosis, tres para la prueba de biocida y uno para el control de la prueba. A cada vaso se le agregó 30 mL de agua destilada o de criadero y con una pipeta se trasladaron lotes de 25 larvas de A. benarrochi por vaso. Seguidamente cada vaso se completó hasta un volumen total de 150 mL lo cual corresponde al volumen donde se encuentran contenidas las larvas en estudio. Se anotaron la temperatura media del agua y el pH, durante cada réplica siguiendo las recomendaciones de la OMS (1960, 1976). El vaso control se preparó solo con agua destilada o de criadero y 25 larvas.

El recuento de la mortalidad larvaria post tratamiento se hizo cada hora, durante las primeras 12 horas y a las 24 horas. Los porcentajes de mortalidad de cada concentración se calcularon con la cifra total de larvas muertas por vaso. La susceptibilidad se reportó como dosis letal media (DL50) y dosis letal noventa (DL90), utilizando el programa EPA probit 1.4 (Tabla 2).

Análisis estadístico

Para determinar la significancía de la mortalidad de larvas de A. benarrochi por efecto del polvo de raíz de L. utilis en ambos tipos de agua y entre las dosis utilizadas se aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Para medir si la calidad del agua interviene en las pruebas de susceptibilidad, se empleó el método de análisis multivariado (MANOVA) del paquete estadístico SPSS versión WIN 7,5. Las variables a usar para sustentar este análisis fueron las dosis en gr/L de polvo de raíz de L. utilis y el tipo de agua (agua destilada y agua de criadero).

Resultados

Bioensayos de laboratorio

Los resultados de la eficacia del polvo de raíz de L. utilis, como factor que determina la mortalidad de las larvas de A. benarrochi durante los bioensayos, son presentados en las Tablas 3 y 4; donde los valores máximos de mortalidad se obtuvieron entre las 12 horas y 24 horas post-tratamiento en ambos tipos de agua (agua destilada y agua de criadero). Antes de medir la los resultados del tratamiento se realizó la lectura en los vasos controles.

Los tratamientos con las dosis 6,25 y 3,1 g/L después de 12 horas de inoculación, presentaron mayores valores de mortalidad, en agua destilada (98 y 89%) con respecto a agua de criadero (86 y 82%). A las 24 horas los valores de mortalidad fueron 99 y 94% en agua destilada y 93 y 90% en agua de criadero.

Asimismo en agua destilada, con las dosis 6,25 y 3,1 g/L se observó mortalidades superiores al 60% a las 2 horas post-aplicación, mientras que con la dosis 2,1 g/L la mortalidad fue mayor al 50% a las 3 horas post-aplicación. Con las dosis de 1,0 y 0,1 g/L no se lograron de mortalidades superiores al 50% del total de larvas durante el tiempo de desarrollo de los bioensayos, presentando estabilización en los porcentajes de mortalidad posterior a las 7 horas con ambas dosis.

En agua de criadero, con la dosis 6,5 g/L se observó mortalidad superior al 50% de larvas tratadas a las 2 horas post-tratamiento; con la dosis 3,1 g/L a partir de las 3 horas y con la dosis 2,1 g/L a partir de las 8 horas post-aplicación se registró la misma eficacia. Con las dosis de 1,0 y 0,1 g/L no se registraron valores de mortalidad superiores al 50% post-aplicación durante el desarrollo de los bioensayos.

Al observar el comportamiento de la mortalidad en el tiempo por dosis aplicada según el modelo de regresión lineal simple, se determinó que existían en algunos casos donde la tendencia era bastante similar pero con promedios diferentes con lo cual implicaría que las dosis probadas tienen el mismo comportamiento, tal es el caso del tratamiento en agua destilada con las dosis 1,0 y 0,1 g/L cuyas pendientes son 4,1 y 4,56 respectivamente; En agua de criadero con las dosis 6,25 y 3,1 g/L las pendientes son 7,9 y 8,0.

En otros casos, las tendencias son diferentes lo cual evidencia que tienen comportamientos desiguales donde aquellas dosis con mayor pendiente implican que a menor concentración mayor mortalidad; tales son los casos de las dosis 6,25; 3,1 y 2,1g/L en agua destilada, donde las pendientes son 8,45; 7,42 y 5,8 respectivamente; asimismo con las dosis 2,1; 1,0 y 0,1 g/L, las pendientes son 5,37; 4,2 y 2,1 respectivamente.

Si comparamos el comportamiento de las mortalidades en ambos tipos de aguas, observamos tendencias como 8,43 y 7,4 en agua destilada y 7,9 y 8.0 en agua de criadero, por lo que utilizando dosis mayores de 3,1 g/L se obtendrán mortalidades mayores del 80% a las 12 horas y mayor al 90% a las 24 horas post-tratamiento respectivamente (Tabla 5).

La susceptibilidad, (DL50 a las 6 horas) de las larvas de A. benarrochi a L. utilis en agua destilada fue 0,6307 g/L y la DL90 fue 12,4370 g/L (Tabla 6).

Cuando se usó agua de criadero, a las 6 horas los índices de susceptibilidad fueron la DL50= 1,3641 g/L y la DL90= 27,576 g/L del polvo de raíz (Tabla 8).

Se observó que la tolerancia de las larvas de A. benarrochi a las dosis de L. utilis, se va perdiendo conforme aumenta el tiempo de exposición y la toxicidad va aumentando. Entre las de 6 y 12 horas de exposición en agua destilada la DL50 disminuyó 1,3 veces y la DL90 1,7 veces, mientras en agua de criadero la DL50 disminuyó 1,6 veces y la DL90 2,8 veces.

Al comparar susceptibilidades entre ambos tipos de tratamientos, se observó que en agua de criadero a las 6 horas post-tratamiento la toxicidad es 2,16 veces menos tóxica para valores de la DL50 y 2,23 veces menos tóxicas para valores de la DL90. A las 12 horas es 1,7 veces y la DL90 es 1,36 veces menos tóxica.

Análisis estadístico

L. utilis, indujo mortalidad en larvas de A. benarrochi, obteniéndose diferencias significativas entre los grupos tratados y el control (p= 0,000 para agua destilada y p= 0,000 para agua de criadero). Para comprobar si la calidad del agua influye en la mortalidad, se realizó un MANOVA, obteniéndose un p= 0,000 como resultado de la prueba, por lo cual la hipótesis nula en la cual se planteaba que no existen diferencias significativas de mortalidad en ambos tipos de agua se rechazó. En consecuencia existe evidencia de al menos una dosis para afirmar que la calidad de agua influye en la mortalidad.

Al aplicarse las dosis polvo de raíz de L. utilis de forma individual se encontraron diferencias estadísticas significativas en ambos tipo de agua para la dosis de 0,15 g/L (p= 0,021), sin embargo cuando se usa cualquiera de las otras dosis, estadísticamente producen el mismo resultado, no difieren significativamente entre ellas (p= 0,610; p= 0,120; p= 0,368; p= 0,315).

Como el número de replicas es muy pequeño, solo 7 y no conociéndose la función de distribución de probabilidad de esta muestra se usó la pruebas no paramétrica de Kruskal - Wallis, para la comparación entre dosis con el objetivo de establecer si existen diferencias estadísticas significativas. Se pudo observar que con agua destilada existen diferencias entre la mortalidad de las dosis 6,25 g/L y las dosis 2,1; 1,0 y 0,15 g/L. Entre la dosis 3,1 y las dosis 2,1; 1,0 y 0,15 g/L. Entre las dosis 2,1 g/L y las dosis 1,0 y 0,15 g/L; pequeñas diferencias entre las dosis 6,25 y 3,1 g/L y ninguna diferencia entre las dosis 1,0 g/L y 0,15 g/L. Asimismo, existen diferencias en la mortalidad del tratamiento en agua de criadero entre las dosis 6,25 y las dosis 2,1; 1,0 y 0,15 g/L. Entre la dosis 3,1 y las dosis 2,1; 1,0 y 0,15 g/L. Entre las dosis 2,1 y las dosis 1,0 y 0,15 g/L, y entre las dosis 1,0 y 0,15 g/L; casi ninguna diferencia entre los tratamientos con las dosis 6,25 y 3,1 g/L.

Discusión y conclusiones

Los trabajos realizados en el Perú por Wille (1952), Cisneros y Fukuda (1965), Beingolea (1988), Vílchez y Sánchez (1993), Zúñiga (1993), Vílchez (1994) y Ruiz (1995), reportaron efectividad de L. utilis contra plagas de hortalizas, pulgas de algodonero, mosca blanca de los cítricos, cigarritas, Heliothis sp. plagas de col y plagas de cultivos de maíz.

Las primeras aplicaciones del Lonchocarpus sp «barbasco» o «cube» sobre larvas de mosquitos no reportaron efectividad en el control de éstas. Gibson (1928), solo encontró efectividad sobre peces a los 15 minutos de aplicación de extractos de cube, pero no demostró efectividad sobre larvas de Culex sp. y Anopheles sp. Similares resultados reporta Wille (1939) al utilizar extractos de «cube» con 5% de rotenona, contra larvas de A. pseudopunctipennis, después de 15 horas de tratamiento.

El presente estudio demuestra la eficacia de polvo de raíz de L. utilis para controlar larvas de A. benarrochi, con dosis de 3,1 g/L. Similar eficacia obtuvo Gamarra (1940), quien utilizó extractos de raíz de L. nicou contra larvas de Anopheles sp. y Culex sp, reportando 100% de mortalidad, con dosis hasta 8 veces mayor a la reportada en el presente trabajo. No se ha encontrado referencias recientes del uso de los extractos Lonchocarpus sp como insecticida en salud publica.

La eficacia del polvo de raíz de L. utilis como biocida, es similar a la de otros extractos de plantas contra larvas de Anopheles sp. Así Dharmashaktu et al. (1987) utilizaron extractos de hojas de Agave americana, Mwangi y Mukiama (1988) usaron fracciones de granos de fruto de Melia volkensii, Saxena et al (1993) emplearon alcaloides de Annona squamosa y Perich et al. (1994) usaron extractos de flores de Tagetes minuta sobre larvas de Culex sp., Jackson et al. (1990) utilizaron semillas de Sorghum bicolor; Sherif et al. (1985) emplearon extractos crudos y homogenizados de Elodea nuttalli. Los trabajos realizados indican que la variación de los resultados, se atribuyen a factores como la cepa, edad y vigor de las larvas; concentración del principio activo, tipo de extracto empleado, ya que no todos emplearon los mismos protocolos en el momento de evaluar la toxicidad de los extractos.

Estos primeros resultados muestran que el uso del polvo de raíz de L. utilis en el control de A. benarrochi, podría constituir una importante alternativa de uso en regiones económicamente pobres y de difícil acceso por ser eficaz, de fácil aplicación y de bajo costo para controlar la malaria mediante la eliminación del vector en los casos de brotes epidémicos y sólo en criaderos temporales, debido a que su efecto biocida no es selectivo con otros organismos de la fauna acuática.

Se ha observado mayor eficacia con la dosis 3,1 g/L del polvo de raíz de L. utilis sobre larvas de A. benarrochi, obteniéndose mortalidades mayores al 80% a las 12 horas y del 90% a las 24 horas de aplicación. Se evidenció que existe mayor eficacia con el tratamiento utilizando agua destilada que con el agua de criadero.

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