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Revista Peruana de Biología

On-line version ISSN 1727-9933

Rev. peru biol. vol.14 no.2 Lima Dec. 2007

 

ARTICULOS ORIGINALES
 
Actividad antifungica de extractos de plantas usadas en medicina popular en Argentina
 
Antifungal activity of plant extracts used in folk medicine in Argentina

 

Roberto Davicino1, María Aída Mattar1, Yolanda Angelina Casali2, Silvia Graciela Correa4, Elisa Margarita Pettenati3 y Blas Micalizzi1

1 Cátedra de Inmunología, Area Microbiología, Departamento de Bioquímica y Ciencias Biológicas
2 Cátedra Control de Calidad de Medicamentos, Area Bromatología y Ensayo y Valoración de Medicamentos, Departamento de Farmacia, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luís, San Luís, Argentina.
3 Herbario, Universidad Nacional de San Luís, San Luís, Argentina.
4Inmunología, CIBICI (CONICET) Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba. Argentina

 


Resumen

Los hongos pueden causar enfermedades en humanos, especialmente en pacientes inmunosuprimidos. En este estudio, extractos de 10 plantas utilizadas en medicina popular en Argentina fueron ensayadas para estudiar la actividad antifúngica in vitro contra 4 cepas de hongos. De todas las plantas testeadas, solo 4 mostraron actividad antifúngica: Larrea divaricata Cav, Gnaphalium gaudichaudianum D.C, Baccharis trimera Less y Schinus terebenthifolius.

Palabras Claves: Medicina popular, Extractos de plantas, Actividad antifúngica.

 


Abstract

Fungi may cause very serious diseases in humans specially in immunosuppressed patients. In this study, extracts of 10 plants used in popular medicine in Argentine were assayed for in vitro antifungal activity against 4 fungal strains. Out of all the plants tested, Larrea divaricata Cav, Gnaphalium gaudichaudianum D.C, Baccharis trimera Less and Schinus terebenthifolius proved to have antifungal activity.

Keywords: Popular medicine, Extracts of plants, Antifungal activity.

 


Introducción

La actividad antifúngica de extractos de plantas usadas en medicina popular contra diversos hongos, los cuales causan infecciones frecuentes en humanos, ha sido ampliamente estudiada (Quiroga et al., 2001; Navarro García et al., 2003; Carpinella et al., 1999; Zhu et al., 2005; Somchit et al., 2003; Dabur et al., 2004). Debido a los efectos adversos de algunas de las drogas antifúngicas utilizadas actualmente (Girois et al., 2005; Song and Deresinski, 2005; The Merck Manual of Medical Information, 2003), a que son poco efectivas e inducen frecuentemente resistencia (Escalante et al.,2002; Zhang et al., 2005), a los elevados costos de los tratamientos antimicóticos (Ibelise de González et al., 1998), numerosos investigadores han encaminado sus trabajos hacia la búsqueda y aplicación de nuevos compuestos biológicamente activos que exhiban efectos secundarios mínimos (Fenner et al.; 2005; Bisignano et al., 2000; Jones et al.,2000; Ali-Shtayeh ant Abu Ghdeib, 1999; Kandil et al., 1994).

Las plantas son una fuente invaluable de nuevas moléculas biológicamente activas. Ellas producen diversos metabolitos secundarios, muchos de los cuales presentan actividad antifúngica. Entre los compuestos más conocidos se encuentran: flavonoides, fenoles, glicósidos de fenoles, saponinas, etc. (Grayer and Harborne, 1994; Osbourn, 1996).

Los hongos están bien adaptados para utilizar una gran variedad de sustratos como fuente de carbono, nitrógeno y energía. De allí la dificultad que presenta su control. Estos organismos pueden causar enfermedades muy graves en humanos (Crameri and Blazer, 2002; Quiroga et al.,2001). Cándida albicans es un miembro de la flora oral y gastrointestinal en individuos inmunocompetentes (Rodríguez-Galán et al., 2003) pero produce infecciones muy frecuentes en pacientes inmunocomprometidos (Jarvis, 1995; Fridkin and Jarvis, 1996; Poikonen et al., 2003). En condiciones de immunosupresión severa, hospitalización prolongada, terapias antibióticas y/o prótesis, Saccharomyces cereviciae es un colonizador común de mucosas, produciendo infecciones tanto superficiales como vicerales invasivas (Jones et al, 2000, Aucott et al., 1990). Aspergillus níger produce infecciones cutáneas en estos pacientes inmunosuprimidos (Aksoy et al., 2003), mientras que Penicillium notatum es agente causal de infecciones y alergia en el hombre (Mari, 2003).

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad antifúngica de extractos etanólicos y decocciones de 10 plantas utilizadas en medicina popular en la zona central de Argentina. En la Tabla 1 se muestran datos etnobotánicos de las mismas

 

Materiales y métodos

Material vegetal

Hojas, semillas y ramas tiernas de Larrea divaricata Cav, Gnaphalium gaudichaudianum D.C, Baccharis trimera Less., Schinus areira L., Schinus terebenthifolius R, Xanthium spinosum L., Lippia turbinata Griseb, Coryza bonariensis L., Thelesperma megapotamicum Spreng y Jodina rhombifolia Hook & Arm fueron recogidas en la provincia de San Luis, Argentina durante el mes de abril de 2005. Las mismas se identificaron en el Herbario de la Universidad Nacional de San Luis donde se encuentra depositado un voucher de cada una de ellas.

Preparación de los extractos

El material vegetal fue secado a 45 ºC en estufa con aire forzado durante un periodo de 5 días y luego fue reducido a polvo. Los extractos se prepararon al 5%.

Decocción: sobre 5 g de material vegetal seco y reducido a polvo se agregaron 100 ml de agua destilada hirviendo manteniéndose a ebullición suave durante 20 min. (Comisión Permanente de la Farmacopea Nacional Argentina, 1978). El extracto obtenido fue esterilizado por filtración (membranas Millipore 0,22 um), liofilizado y conservado en envase hermético a temperatura ambiente hasta el momento de su uso.

Extracto etanólico: a 5 g de material vegetal seco y reducido a polvo se le adicionaron 100 ml de etanol 96º dejando a temperatura ambiente durante 48 h. El extracto obtenido fue filtrado a través de papel de filtro (Whattman N.° 4) y secado a 40 ºC. Al momento de ensayar su actividad fueron retomados con etanol. Debido a la baja solubilidad de algunos extractos etanólicos, solo se ensayaron 3 de ellos, los más solubles.

Microorganismos

Se utilizarton los siguientes microorganismos: A. níger, P. notatum, S. cereviceae y C. albicans los que fueron provistos por el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de San Luis. Los mismos fueron conservados en medio Agar Sabouraud glucosado (ASG) (Britania) a 4 ºC y repicados periódicamente.

Obtención de esporas de los hongos filamentosos y cultivo de levaduras

Las esporas de A. níger y P. notatum fueron obtenidas a partir de cultivos en tubo de ensayo en ASG a 28 ºC durante 8 días. Sobre el cultivo se agregó 10 ml de solución fisiológica estéril y 3 nl de Tween 80. La suspensión se trasvasó a un erlenmeyer conteniendo perlas de vidrio de 6 mm de diámetro, se homogeneizó en un agitador rotatorio durante 30 minutos a 4 ºC y posteriormente se filtró con papel de filtro. Las conidias fueron obtenidas por centrifugación del filtrado a 3000 rpm durante 15 minutos a 4 ºC, luego se lavaron y conservaron en agua destilada estéril a 20 ºC hasta su uso.

Las levaduras, C. albicans y S. cereviceae se cultivaron en ASG a 28 ºC durante 24 h.

Inóculos

Los cultivos de levaduras se resuspendieron en solución fisiológica y las suspensiones se ajustaron a la concentración de 106 levaduras/ml. Para los hongos filamentosos el inóculo consistió en una suspensión de 106 conidias/ml.

Evaluación de la actividad antifúngica

La actividad antifúngica de los extractos se evaluó por el método de dilución en agar. (Navarro García et al., 2003) Las decocciones se ensayaron en el rango de concentración 12,5 - 250 mg/ml. La actividad del extracto etanólico se ensayó en concentraciones de 0,31 a 120 mg/ml, de modo tal que la concentración final de etanol, en el medio de cultivo, no superase el 2% (Tabla 2).

Un mililitro de las diluciones del extracto en estudio se agregó a placas de Petri conteniendo 9 ml ASG fundido a 48 ºC. Una vez gelificadas se inocularon con 1,5; 2 y 3 nl de la suspensión de cada microorganismo. El crecimiento de S. cereviceae y de C. albicans se observó a las 24 h de incubación y el de A. níger y P. notatum a las 96 h. Como control negativo se emplearon placas de Petri sin extractos.

Se estableció la actividad antifúngica determinando la concentración inhibitoria mínima (MIC), definida como la concentración más baja de extracto capaz de inhibir el crecimiento visible en el agar (Navarro García et al.,2003).

Análisis estadístico

El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando las pruebas de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis (en los casos que no se especifica el valor de p, no existieron diferencias significativas

Resultados

La Tabla 3 muestra la actividad antifúngica de los 3 extractos etanólicos ensayados.

 

El extracto etanólico de L. divaricata mostró efecto inhibitorio sobre el crecimiento de S. cereviceae, C. albicans y A. niger con valores de MIC de 2,5; 20 y 120 mg/ml respectivamente. No inhibió el crecimiento de P. notatum. Los extractos etanólicos de G. gaudichaudianum y B. trimera inhibieron solamente el crecimiento de S. cereviceae, (MIC de 5 y 40 mg/ml respectivamente).

En la Tabla 4 se muestra la actividad antifúngica de las 11 decocciones de las diez plantas ensayadas. Las decocciones de L. divaricata, G. gaudichaudianum, B. trimera y S. terebenthifolius, presentaron actividad antifúngica sobre S. cereviceae con valores de MIC de 100, 250, 100 y 250 mg/ml respectivamente. Las decocciones de G. gaudichaudianum, B. trimera y S. terebenthifolius inhibieron el crecimiento de C. albicans con un valor de MIC de 250 mg/ml. Ninguna de las decocciones inhibió el crecimiento de A. níger y P. notatum, a las concentraciones ensayadas. Las decocciones de S. areira L. (semillas), X. spinosum L., L. turbinata Griseb, C. bonariensis L., T. megapotamicum Spreng y J. rhombifolia Hook & Arm no presentaron actividad antifúngica contra los hongos ensayados en las concentraciones probadas.

 

Discusión

Diferentes autores han informado sobre la actividad antifúngica de diversos extractos de plantas usadas en medicina popular contra C. albicans (Bisignano et al, 2000; Holetz et al., 2002; Velièkovic et al., 2003; Hernández Díaz y Rodríguez Jorge, 2001), S. cereviceae (Du et al., 2003) A. níger (Nadinic et al., 2002) y P. notatum (Quiroga et al., 2001).

De acuerdo a nuestros resultados podemos observar que S. cereviceae fue la especie fúngica más sensible frente a los extractos etanólicos ensayados ya que los extractos de G. gaudichaudianum D.C, de B. trimera Less y de L. divaricata Cav. inhibieron el crecimiento del microorganismo. De ellos, el de L. divaricata Cav. fue el más potente respecto a los otros dos (Pd» 0,035).

El extracto etanólico de L. divaricata Cav. fue más efectivo para inhibir el crecimiento de S. cereviceae que para C. albicans y A. niger (Pd» 0,04), si bien fue el único de los extractos ensayados que mostró efecto inhibitorio sobre C. albicans lo que concuerda con lo informado por Quiroga et al. (2001, 2004) y sobre A. Níger.

Ninguno de los extractos etanólicos en las concentraciones ensayadas mostró efectividad para inhibir el crecimiento de P. notatum.

Las decocciones de S. areira L., X. spinosum L., L. turbinata Griseb, C. bonariensis L., T. megapotamicum Spreng y J. rhombifolia Hook & Arm, en las concentraciones ensayadas, no mostraron actividad antifúngica.

La decocción de L. divaricata Cav. solo inhibió el crecimiento de S. cereviceae a la concentración de 100 mg/ml mientras que, la de G. gaudichaudianum D.C y de S. terebenthifolius R., a la concentración de 250 mg/ml, inhibieron el crecimiento de S. cereviceae y de C. albicans

La decocción de B. trimera Less. mostró una mayor actividad antifúngica contra S. cereviceae respecto a C. albicans (Pd» 0,0001).

Candida albicans fue inhibida solo por las decocciones de G. gaudichaudianum D.C, B. trimera Less. y Schinus terebenthifolius R. en la máxima concentración ensayada (250 mg/ml).

Las decocciones de L. divaricata Cav. y B. trimera Less mostraron mayor actividad antifúngica frente a S. cereviceae respecto a las decocciones de G. gaudichaudianum D.C y Schinus terebenthifolius R. (Pd» 0,032).

Si bien en la bibliografía consultada no se han encontrado informes que muestren datos sobre la actividad antifúngica de las decocciones de las plantas ensayadas, nuestros resultados mostraron que ninguna de ellas fue efectiva para inhibir el crecimiento de A. níger y P. notatum a las concentraciones que hemos testeado.

El extracto etanólico de L. divaricata Cav. mostró actividad antifúngica (20 mg/ml) frente a C. albicans mientras que la decocción no inhibió el crecimiento de microorganismo. Los extractos etanólicos de L. divaricata Cav. y de G. gaudichaudianum D.C fueron más eficaces para inhibir el crecimiento de S. cereviceae que la decocción (Pd» 0,04), al igual que el extracto etanólico de B. trimera Less (Pd» 0,0001)

Los datos obtenidos mostraron que la decocción de L. divaricata fue menos efectiva que el extracto etanólico como antifúngico, debido a que los compuestos obtenidos en los extractos etanólicos son diferentes y/o se encuentran en distintas concentraciones (Obermeyer et al., 1995). Esto pone de manifiesto la importancia de utilizar la metodología más conveniente en la obtención de los extractos, por ejemplo, para L. divaricata, aparentemente sería más conveniente utilizar el extracto etanólico (2,5 mg/ml) que decocción (100 mg/ml) para inhibir C. albicans y S. cereviceae pero, se debería sopesar la mayor toxicidad del extracto alcohólico por su contenido alto en ácido nordihidroguayarético (Obermeyer et al., 1995) respecto al bajo contenido de los extractos acuosos de L. divaricata (Davicino et al.,2006).

Teniendo en cuenta que de las 10 plantas ensayadas sólo L. divaricata Cav, G. gaudichaudianum D.C, B. trimera Less y S. terebenthifolius R. mostraron poseer actividad antifúngica, es posible que la actividad sobre los microorganismos no se deba a la acción de un único principio activo sino al efecto sinérgico de varios de ellos que en la planta se encuentren en proporción minoritaria.

Si bien hay referencias sobre concentraciones empleadas, según la bibliografía consultada no existen datos disponibles para plantas semejantes a las usadas en este trabajo. De los datos disponibles se han usado extractos de Larrea cuneifolia Cav. (0,1 mg/ml) y extractos crudos o diclorometánicos de Larrea tridentata (0,5 y 500 mg/ml respectivamente), para estudiar su actividad antifúngica (Quiroga et al., 2001; Rivera-Castañeda et al., 2001; Vargas-Arispuro et al., 2005). También hay datos con extractos alcohólicos de Schinus molle L. (0,8 mg/ml) con los cuales se inhibió el crecimiento de A. niger y P. notatum (Quiroga et al., 2001), con un extracto metanólico de S. terebinthifolius R. que inhibió el crecimiento de C. albicans (1,25 mg/ml) (Braga et al., 2007). Se ha mostrado que un aceite esencial de Lippia alba (Mill.) N.E. Br. ex Britton and P. Wilson presentó una MIC de 0,6 mg/ml contra C albicans (Teixeira Duarte et al., 2005). Schmourlo et al., 2005, mostraron que un extracto acuoso de S. terebenthifolius posee actividad contra C. albicans, resultados que concuerdan con los obtenidos en nuestras experiencias. De todos estos datos se desprende que la concentración adecuada para mostrar un determinado efecto, depende de la planta empleada y del tipo de extracto.

La comprensión de los mecanismos de inhibición podrían encaminar las investigaciones hacia la obtención de productos biofungicidas provenientes de vegetales. Se están realizando estudios que nos permitirán identificar los principios activos responsables de estos efectos.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer la colaboración desinteresada de la Dra. Ana María Stefanini de Guzmán. Este trabajo ha sido realizado con fondos del proyecto 9601 de la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de San Luis.


Literatura citada

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Correspondencia

Email Roberto Davicino: rcdavici@unsl.edu.ar
Email María Aída Mattar: mmattar@Yunsl.edu-ar
Email Blas Micalizzi: blasmi@unsl.edu.ar
Email Yolanda Angelina Casali: ycasali@unsl.edu.ar
Email Elisa Margarita Pettenati: elipete@unsl.edu.ar
Email Silvia Graciela Correa: scorrea@mail.fcq.unc.edu.ar

Presentado: 02/03/2007
Aceptado: 25/10/2007