Resumen

En el presente trabajo evaluamos la actividad antibacteriana y antifúngica de actinomycetes marinos sobre patógenos de origen clínico. Asimismo, fueron evaluadas la capacidad de producir enzimas extracelulares como carbohidrasas, lipasas y proteasas. Los Actinomycetes fueron aislados de sedimentos colectados entre setiembre a diciembre del 2005 de las Bahías de Ancón (Lima) e Independencia (Ica) de 34 y 100 m de profundidad. El aislamiento se realizó en Agar Caseína - Almidón (ACA) y Agar Marino (AM) con adición de Cicloheximide (10 ng/mL). Las evaluaciones antimicrobianas fueron realizadas frente a bacterias patógenas antibiótico-multirresistentes y hongos de origen clínico; en tanto, para evaluar su actividad multienzimática se utilizaron sustratos poliméricos diversos. Se aislaron un total de 62 actinomycetes, de los cuales 31 (50%) mostraron actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus, 36 (59%) frente a Pseudomonas aeruginosa y 23 (37%) a ambos patógenos. Las cepas de actinomycetes I-400A y M10-77 identificadas en cada caso como Streptomyces y Thermoactinomyces fueron las que exhibieron mayor actividad inhibitoria frente a P. aeruginosa y S. aureus respectivamente. Asimismo, 13 actinomycetes (20,97%) mostraron actividad antifúngica frente a cultivos de Candida albicans cepa 1511 y 17 (27,42%) frente a Candida albicans cepa 1511MIC; sin embargo, ningún actinomycete presentó actividad inhibitoria frente a Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus y Trichophyton mentagrophytes. La mayoría de los actinomycetes mostraron tener actividad multienzimática capaz de hidrolizar compuestos poliméricos como el tween-80 (96%), la gelatina (95%), almidón (93%), lecitina (88%) y la caseína (74%). Extractos del compuesto activo obtenidos de la cepa M10-77 con etil acetato rindieron notable actividad inhibitoria contra S. aureus. Se concluye que el sedimento marino es fuente de Actinomycetes con gran capacidad de producir sustancias bioactivas de importancia médica-farmacológica e industrial.

Palabras clave: Sedimento marino, actinomycetes, patógenos multirresistentes, antibiosis.

Abstract

In the present research we evaluated the antibacterial and antifungical activity of marine actinomycetes over pathogen of clinical origin. Likewise, it was evaluated the capacity to produce extracellular enzymes like carbohidrases, lipases and proteases. The Actinomycetes were isolated from sediments collected between September to December 2005 of Ancón (Lima) and Independencia (Ica) Bays at depths of 34 and 100 m. The isolation was performed in Casein - Starch Agar (CSA) and Marine Agar (AM) with addition of Cicloheximide (10 ng/mL). The antimicrobial evaluations were done comparing them with pathogenic antibiotic-multiresistant bacteria and fungi from clinical origin; in as much, to evaluate their multienzimatic activity several polimeric substrates were used. A total of 62 actinomycetes were isolated, 31 of there (50%) showed antibacterial activity in opposite to Staphylococcus aureus, 36 (59%) in opposite to Pseudomonas aeruginosa and 23 (37%) to both pathogens. Strains of actinomycetes I-400A and M10-77 identified in each case like Streptomyces and Thermoactinomyces exhibited higher inhibitory activity against S. aureus and P. aeruginosa respectively. Also, 13 actinomycetes (20,97%) showed to antifungical activity against cultures of Candida albicans strain 1511 and 17 (27,42%) with Candida albicans strain 1511MIC; nevertheless, no actinomycete displayed inhibitory activity to the growth of Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus and Trichophyton mentagrophytes. Most Actinomycetes showed to have multienzymic activity able to hydrolysis polymerics compounds like the tween-80 (96%), gelatin (95%), starch (93%), lecitine (88%) and casein (74%). Extracts of the active compound obtained from the strain M10-77 with ethyl acetate produced a notable inhibitory activity against S. aureus. We conclude that the marine sediment is source of Actinomycetes with great capacity to produce bioactives substances of medical-pharmacological and industrial relevance.

Keywords: Marine sediment, actinomycetes, multiresistant pathogens, antibiosis.

Introducción

Las enfermedades infecciosas causadas por las bacterias y los hongos patógenos representan un desafío serio para la farmacología actual, pues así lo evidencian los millones de muertes prematuras que causan en el mundo (World Health Organization, 2002). Por otro lado, el rápido desarrollo de la resistencia antibiótica por muchos patógeno, y la toxicidad de algunos de los antibióticos actualmente usados propicia la búsqueda y el desarrollo constante de nuevos agentes antimicrobianos (Leiva et al., 2004). Los microorganismos, especialmente bacterias que pertenecen al orden Actinomycetal, son los productores más comunes de agentes antimicrobianos. Tradicionalmente, estos organismos fueron aislados de fuentes terrestres, y solo en las dos últimas décadas llegó a ser evidente el potencial de microorganismos marinos como productores de antibióticos, aislándose a muchas bacterias productoras de nuevos antibióticos con estructuras únicas y características muy propias del ambiente marino (Maldonado et al., 2005). El orden Actinomycetal está compuesto por aproximadamente 80 géneros, en su mayoría aislados de fuentes terrestres donde cumplen un rol muy importante como organismos saprofíticos (Williams et al., 1984). Los actinomycetes está formado por grupos de microorganismos filamentosos Gram positivos, con alto contenido de G+C en su DNA, de amplia distribución en la naturaleza y muy conocidos por producir antibióticos naturales y otros importantes compuestos bioactivos de interés comercial e industrial (Magarvey et al., 2004). En la actualidad, los actinomycetes se procuran de aislar a partir de nuevas fuentes y continúan siendo objeto de estudio en la búsqueda de nuevas substancias con diversas propiedades biológicas tales como metabolitos antimicrobianos, antivirales, anticancerígenos, anticoagulantes, inmunomoduladores entre otros (Bull et al., 2000; Mincer et al., 2002; Kokare et al., 2004). En las últimas décadas, la búsqueda de actinomycetes se ha reorientado hacia otros ambientes como: sedimentos de ríos, lagos y océanos que ofrecen la posibilidad de encontrar cepas silvestres no descritas que produzcan nuevos metabolitos secundarios farmacológicamente activos (Jian y Xu, 1996; Bull et al., 2005; Ward y Bora, 2006)). Asimismo, en los últimos años, el número de nuevos compuestos de interés médico—farmacológico obtenidos de géneros de actinomycetes de origen terrestre ya conocidos ha decrecido; en cambio a partir de actinomycetes marinos principalmente de las familias Streptomycetaceae y Micromonosporaceae han ido en aumento en cantidades cada vez mayores, considerándose por ello como virtuales productores prolíficos de importantes metabolitos secundarios (Kelecom, 2002; Jensen et al., 2005; Fiedler et al., 2005). Por otro lado, el incremento vertiginoso de patógenos drogo-resistentes que pone en riesgo el futuro de las terapias antimicrobianas, ha motivado la búsqueda de nuevas cepas a partir de nuevas fuentes y el desarrollo de nuevas estrategias combinatorias en la síntesis química y su aplicación antimicrobiana (Saadoun et al., 1999; Projan y Youngman, 2002; Sujatha et al., 2005). A la fecha, numerosos estudios sobre actinomycetes marinos resaltan la importancia de estos microorganismos en la obtención de nuevos productos naturales, muchos de los cuales tienen potencial aplicación biomédica en la terapia antimicrobiana (Magarvey et al., 2004; Augustine et al., 2005). Debido a que los ecosistemas marinos difieren notablemente de los terrestres, las capacidades metabólicas y fisiológicas de los actinomycetes marinos son también diferentes, lo que ofrece un enorme potencial de descubrimiento de nuevas drogas, las cuales se espera que actúen contra diversas bacterias, hongos y levaduras. Si bien la síntesis química de drogas es una opción válida, la búsqueda de compuestos a partir de microorganismos continúa siendo la principal fuente de nuevos antimicrobianos. Algunos estudios reportan que las cepas de actinomycetes pueden exhibir un amplio espectro de inhibición tanto sobre bacterias Gram negativas, Gram positivas y hongos; esto puede significar que el agente activo no es muy específico en cuanto a su diana ya que actúa igualmente sobre procariotas y eucariotas, o bien el actinomycete pueda elaborar más de un metabolito y que cada uno de ellos tenga un sitio blanco específico distinto (Leiva et al., 2004). El objetivo del presente trabajo fue evaluar las características culturales de actinomycetes aislados de sedimento marino de la costa central del Perú y determinar su actividad antibacteriana y antifúngica frente a patógenos de origen clínico. Complementariamente, se evalúa la capacidad de producir diversas enzimas extracelulares de interés biotecnológico.

Material y Métodos

Muestreo

Mediante campañas mensuales se tomaron un total de 24 muestras de sedimento marino de 34 y 100 m de profundidad, las que fueron recolectadas mediante el método del dragado en la Bahía de Ancón (Lima) y Bahía de Independencia (Paracas -Ica) (Tabla 1). Las muestras fueron colocadas en tubos estériles y transportadas en cajas térmicas en refrigeración (4 ºC), las que fueron procesadas posteriormente para el análisis microbiológico en el Laboratorio de Microbiología Ambiental y Biotecnología del Instituto de Ciencias Biológicas Antonio Raimondi de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Procesamiento de muestras y aislamiento de actinomycetes marinos

Previo al aislamiento de los actinomycetes y con la finalidad de eliminar la microbiota vegetativa que acompaña la muestra, éstas fueron procesadas por dos métodos: el método I (húmedo), que consiste en pesar 20 g de muestra y colocar en placas estériles para someter a un tratamiento térmico en baño maría; el método II (seco), un procedimiento similar al anterior pero colocando las muestras en una estufa en calor seco. En ambos casos la temperatura de tratamiento fue de 50 ºC por 60 minutos (Pisano et al., 1986; Takizawa et al., 1993). Después de estos tratamientos se hicieron diluciones consecutivas al décimo en agua de mar estéril hasta 10^-5. De cada muestra diluida se sembró 0,1 mL en placas de Agar Marino (AM) y Agar Caseína—Almidón (ACA) preparados con agua de mar natural y con adición de Cycloheximide (10 ng/mL) como agente antifúngico. Los cultivos fueron incubados a 28 ºC durante 15 a 20 días (Kokare et al., 2004). Se aislaron las colonias características de actinomycetes y se mantuvieron en ceparios de Agar Marino más glicerina (20% v/v) para estudios posteriores.

Caracterización de cultivos de actinomycetes

Las características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas y de cultivo de actinomycetes aislados se realizaron siguiendo la metodología y la guía práctica para identificación de Actinomycetes según esquemas de Holt et al. (1994). Las características culturales de colonias de actinomycetes marinos en medio líquido y sólido fueron descritas según su crecimiento en el Caldo Marino y Agar Marino respectivamente. Las observaciones microscópicas se realizaron a partir de microcultivos luego de su crecimiento por el método de "bloques de agar" y/o "laminilla en plano inclinado" e incubados en cámara húmeda a 28 ºC por 5—7 días.

Actividad enzimática de los actinomycetes marinos

La producción de enzimas extracelulares (proteasas y carbohidrasas) de los actinomycetes se determinó por pruebas convencionales seguidos por León et al. (2000) según el método de difusión radial en placas con Agar Marino más el sustrato específico consistente de caseína (1%), gelatina (5%) y almidón (2%). Asimismo, la producción de lipasas como esterasas y lecitinasas se determinaron utilizando Tween 80 y yema de huevo estéril como sustratos respectivos. En todos los casos se incubaron a 20 ºC hasta por 21 días. La determinación cualitativa positiva se determinó midiendo los halos de actividad en la zona de crecimiento de los actinomycetes.

Determinación de la actividad antibiótica

Cepas indicadoras

Las cepas patógenas multi-drogo-resistentes de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, así como de Candida albicans fueron otorgadas por los laboratorios respectivos de Microbiología y Micología del Instituto Especializado de Salud del Niño. Los hongos miceliales fueron proporcionados por el Laboratorio de Micología del Instituto de Medicina Tropical Daniel Alcides Carrión, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Actividad antibacteriana

Se realizó mediante el método de "doble capa" de Westerdahl et al., (1991) modificado por León y García-Tello (1998). Los actinomycetes fueron sembrados como macrocolonias en Agar Marino pH 7,6 e incubadas a 28 ºC por 5—7 días. Para las pruebas de antagonismo las cepas testigo de P. aeruginosa y S. aureus fueron previamente reactivadas en Caldo Tripticasa Soya y luego ajustadas a 10⁶ UFC/mL. Las pruebas de antagonismo se realizaron mediante la inoculación de cepas testigo en medio semisólido a modo de "segunda capa" sobre los cultivos de los actinomycetes marinos. Las placas en prueba fueron incubadas a 37 ºC por 24 a 48 h, realizándose luego las lecturas correspondientes mediante la medida del radio de los halos de inhibición.

Actividad antifúngica

La determinación de la actividad de los actinomycetes marinos frente a hongos levaduriformes se realizó de modo similar que para las bacterias. Las cepas de Candida albicans se agregaron sobre los actinomycetes a modo de segunda capa previamente preparados en el medio semisólido Extracto de Levadura-Peptona-Glucosado (YPG), las que fueron incubadas a 35—37 ºC por 24—48 h. La actividad antifúngica se determinó midiendo el radio de los halos de inhibición. La actividad antifúngica de actinomycetes frente a hongos filamentosos patógenos, se determinó según procedimientos seguidos por Zaror y Espinel-Ingroff (1989). Las cepas en prueba incluyeron a Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus y Trichophyton mentagrophytes.

Extracción del compuesto activo y prueba de su actividad inhibitoria

Los compuestos antibacterianos de una cepa seleccionada de actinomycete marino (cepa M10-77) fueron recobrados mediante extracción con Etil Acetato según procedimientos descritos por Zheng et al. (2004). El cultivo del actinomycete se realizó en el Caldo Marino y mantenido en constante agitación a 150 rpm a 20 ºC durante 15 días. El caldo se filtró y se trató con Etil Acetato (v/v) y agitado vigorosamente por una hora. La fase orgánica conteniendo el compuesto activo fue separada de la fase acuosa y luego evaporada hasta sequedad. El residuo obtenido fue usado para determinar la actividad antibacteriana frente a S. aureus cepa 457.

Resultados y discusión

Enriquecimiento y aislamiento de actinomycetes marinos

De las muestras de sedimento procesadas por el método I (calor húmedo) y sembradas en Agar Caseína-Almidón, se llegaron a recuperar colonias de actinomycetes en el 50% del total de placas sembradas; en tanto, las que fueron sembradas en Agar Marino tuvieron mejor rendimiento llegando a alcanzar el 75% de placas con crecimiento característico de actinomycetales. Por otro lado, a partir de las muestras tratadas por el método II (calor seco) y sembradas en Agar Caseína-Almidón solo en el 12% de ellas hubo crecimiento favorable a actinomycetes, mientras que en el Agar Marino alcanzaron hasta el 25% de crecimiento. Sin duda, el pretratamiento de la muestra en calor fue eficaz para restringir el crecimiento de la flora acompañante, ya que en la mayoría de los cultivos se obtuvo colonias puras de actinomycetes. Estos resultados fueron similares a los obtenidos por Pisano et al. (1986), quienes además del calor aplicaron tratamientos con fenol y posterior cultivo en agar quitina. En nuestro estudio, como resultado de ambos métodos se llegaron a aislar un total de 62 cepas de actinomycetes marinos cuyas características culturales se indican en la Tabla 2. El protocolo de aislamiento que resultó más factible para obtener mayor número de cepas de actinomycetes marinos fue aquel en el que se realizó el tratamiento térmico húmedo y el cultivo en Agar Marino (75% de rendimiento). Este resultado difiere de otros trabajos, puesto que el Agar Marino muy útil generalmente en el aislamiento de heterótrofos marinos no es utilizado necesariamente para el aislamiento de actinomycetes, pero sí el Agar Caseína-Almidón, Agar Czapeck y otros medios enriquecidos, los cuales según otros autores (Pisano et al., 1986; Takizawa et al., 1993) tuvieron un óptimo rendimiento para la recuperación de actinomycetes marinos. En nuestro caso, el Agar Caseína-Almidón y el Agar Czapeck fueron ocasionalmente utilizados y tuvieron un rendimiento discreto.

Características culturales de los actinomycetes

Las características de cultivo tanto en medio sólido como líquido de los 62 aislados de actinomycetes se muestran en la Tabla 2. En Agar Marino los actinomycetes iniciaron su crecimiento generalmente a partir de 5—7 días de incubación hasta los 21 días. Formaron colonias de tamaño variable (desde pequeñas menores a 1 mm hasta colonias de 12 mm de diámetro). La mayoría (65%) formaron inicialmente colonias ligeramente húmedas y algo brillosas, pero con el transcurrir del tiempo se volvieron opacas y secas adquiriendo una apariencia yesosa y pulverulenta. Todo esto hacía referencia a los estados de conversión por los que pasan las hifas aéreas hasta llegar a la formación de esporas (conidias).

Se pudo observar que existe una variedad de formas de colonia de actinomycetes marinos, siendo las más frecuentes las colonias circulares con borde liso y las colonias de bordes muy irregulares (festoneados, dactiliformes y dentados). En muchos casos fue posible observar colonias con superficie crateriforme y corrugada con anillos concéntricos de pigmentación variable (Figura 1). Asimismo, el color de las colonias variaron desde blancas sin pigmentación en superficie (37,1%) a grisáceas (29,03%), tal como se puede observar en la Figura 2; presentándose además pigmentaciones intermedias como blanco-rosáceas (16,12%), cremas (12,9%) y blanco-amarillentas (4,83%). Los actinomycetes en la base de sus respectivas colonias presentaron pigmentación que variaron desde marrón oscuro, rojizo hasta amarillo pálido. Fue muy frecuente observar colonias grisáceas con puntos blancos en el centro y muchas veces con exudados. La capacidad de formar anillos concéntricos en el medio parece ser una respuesta quimiotrófica inducida por el gradiente de nutrientes en el medio y la temperatura de incubación, ya que en nuestro caso fue posible observar este comportamiento sobre todo en las colonias mantenidas en refrigeración. Muchas de estas características fueron también observadas por Magarvey et al. (2004) para actinobacterias miembros de la familia Micromonosporaceae. Observaciones microscópicas mostraron células filamentosas y finamente ramificadas, todas ellas Gram positivas. En medio líquido sin agitación se pudo observar que la gran mayoría de los actinomycetes iniciaron su desarrollo formando una gran película en superficie hasta formar colonias muy bien definidas (Figura 3A), en cambio otros se adhirieron fuertemente a las paredes del tubo, pero con el transcurrir del tiempo se observó la formación de micelios en la superficie de esta película, indicando que la colonia está en la fase de maduración de esporas por lo que adquiere una apariencia pulverulenta y yesosa. En los cultivos con agitación, los actinomycetes crecieron de manera peculiar (Figura 3B); pues algunos inicialmente formaron pequeños conglomerados de micelio en la parte inferior del medio para luego aparecer colonias secas en la superficie; por el contrario, otras cepas iniciaron su crecimiento en la parte superior a veces adheridas a las paredes del tubo y a manera de colonias pequeñas y brillosas que viene a ser la fase de crecimiento y formación de tirabuzón. Tardíamente formaron precipitados de colonias algodonosas. Estas características fueron también observadas por Maldonado et al. (2005) en la descripción de nuevos Actinomycetes de sedimentos marinos con especies dominantes del género Micromonospora, Rhodococcus y Streptomyces.

Por otro lado, el olor a "tierra húmeda" (geosmina) característica de muchos actinomycetes de origen terrestre, se percibe de manera indistinta en los actimomycetes marinos ya sea en el medio líquido o sólido. Al respecto, Zaitlin et al. (2003) considera que la producción de geosmina es particularmente variable sobre todo en actinomycetes de origen continental.

Asimismo, los microcultivos de actinomycetes realizados por el método de "bloques de agar" resultaron ser más útiles que el método de "laminilla en plano inclinado", ya que se pudo observar mejor microscópicamente las estructuras vegetativas y de fructificación de los actinomycetes marinos en estudio (Fig. 5).

Producción de Enzimas Extracelulares por actinomycetes marinos

La totalidad de cepas de actinomycetes marinos producen algún tipo de enzima extracelular (Tabla 3). Se ha determinado cualitativamente la producción de enzimas hidrolíticas en la mayoría de los aislados, siendo 96% productores de esterasas, 95% de gelatinasas, 92% de amilasas, 88% de lecitinasas y 74% de caseinasas. Los actinomycetes marinos que mostraron mayor actividad enzimática fueron los productores de caseinasa. Igualmente los actinomycetes productores de lipasas (Tween esterasas y lecitinasas) fueron muy significativas, tal como se puede observar en la Figura 4. Se resalta a las cepas M11-133, I-534, III-200E y III-200F como las más significativas en la producción de las 5 enzimas extracelulares determinadas en este estudio (Tabla 3). Con el advenimiento de la biotecnología la demanda y la búsqueda de enzimas microbianas con nuevas propiedades ha incrementado enormemente su interés por el estudio de actinomycetes marinos. Actualmente, han sido reconocidos muchos microorganismos marinos como potenciales fuentes de nuevas enzimas de uso industrial como fosfatasas, arilsulfatasas, quitinasas, L-asparaginasas, L-glutaminasas, amilasas, proteasas, lipasas, celulasas, ureasas y lactamasas. En la producción de estas y otras enzimas están involucradas bacterias marinas como Vibrio, Pseudomonas y miembros de Actinomycetes como Streptoverticillium (Chandrasekaran, 1997). Si se toma en cuenta que actualmente tienen importancia industrial prioritariamente los microorganismos ambientales termófilos y psicrófilos, los actinomycetes marinos por su hábitat son considerados psicrófilos moderados; por ello, los actinomycetes aislados en este trabajo adquieren relevancia biotecnológica debido a la capacidad de producir diversas enzimas extracelulares bajo condiciones de laboratorio.

Actividad antibacteriana

Del total de 62 actinomycetes marinos evaluados, 31 cepas (50%) mostraron actividad antibacteriana frente al patógeno multirresistente Staphylococcus aureus; 36 (59%) frente a Pseudomonas aeruginosa y 23 (37%) a ambos patógenos (Tabla 4). Las cepas de actinomycetes marinos signadas como M10-77 e I-400A identificadas respectivamente como Streptomyces y Thermoactinomyces (Tabla 5) fueron las que exhibieron mayor actividad inhibitoria frente a S. aureus 457 (Figura 6) y P. aeruginosa 657 (Figura 7) respectivamente. Se destaca la efectividad de los actinomycetes aislados demostrada por las pruebas de antagonismo in vitro frente a S. aureus cepa 457 un patógeno aislado de aspirado de catéter y declarado multidrogorresistente en el área de patología del Instituto Especializado del Niño con resistencia a 8 drogas de un total de 10 de uso convencional en el tratamiento de Gram positivas (Tabla 7). Estos resultados son prometedores si se considera que la aparición de cepas Staphylococcus aureus meticilino-resistentes (MRSA) son cada vez más frecuentes en todo el mundo. En el Perú, la presencia de MRSA está registrada en varios reportes, entre ellas los trabajos de Mendoza et al. (2003). En otras latitudes, Sujatha et al. (2005), describen el aislamiento y la caracterización de Streptomyces psammoticus cepa BT-480 productora de un antibiótico poliketide SBR-22 efectiva contra S. aureus meticilino-resistentes. Asimismo, Magarvey et al. (2004) describen a 17 cepas de actinomycetes aislados de sedimento marino con diversas actividades biológicas, entre ellas inhibitorias de S. aureus meticilino-resistentes, Enterococcus vancomicina-resistentes, Cryptococcus neoformans y Candida albicans. En el caso de Pseudomonas aeruginosa, la multirresistencia antibiótica es ampliamente conocida, sobre todo si el patógeno tiene un origen intrahospitalario. Si bien, los actinomycetes marinos aislados en este trabajo son cuantitativamente mayor que las que actuaron frente a S. aureus, cualitativamente mostraron actividad discreta sobre P. aeruginosa; sin embargo, se debe considerar que son muy pocas las bacterias ambientales que muestran actividad antagónica a Gram negativos patógenos como Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Aeromonas hydrophila, entre otros. En consecuencia, nuestros resultados difieren ampliamente de otros trabajos, en especial de los reportados por Kokare et al (2004), quienes de un total de 20 cepas bioactivas de actinomycetes, marinos determinan que 16 de ellas presentan fuerte actividad antagónica frente a microorganismos Gram positivos y solamente 2 de ellas frente a Gram negativos.

Actividad antifúngica

De las 62 cepas de actinomycetes marinos evaluados por su actividad antifúngica, 17 actinomycetes (27,42%) mostraron tener actividad frente a cultivos de Candida albicans cepa 1511 y 13 (20,97%) frente a Candida albicans cepa 1511MIC (Tabla 6; Figura 8 y Figura 9), siendo las cepas M11-120 (Thermoactinomycete) y M12-141 (Maduromycete) las de mayor actividad antagónica frente a la levadura patógena Candida albicans cepa 1511, pero no así a la cepa 1511 MIC. Cabe resaltar que estos resultados son prometedores si se considera que los antimicóticos de uso clínico son escasos, las candidiasis y micosis causadas por hongos dematiáceos constituyen enfermedades emergentes y en general tiene creciente importancia como agentes oportunistas en pacientes inmunocomprometidos e incluso inmunocompetentes, a lo cual hay que agregar el incremento de la resistencia al escaso número de antifúngicos existentes (Pujol et al., 2000). Por otro lado, en el presente trabajo ningún actinomycete marino presentó actividad inhibitoria frente a otros hongos miceliales de origen clínico tales como Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus y Trichophyton mentagrophytes (Tabla 6). Al respecto, existen muy pocos datos sobre el rol antagónico de actinomycetes marinos frente a hongos causantes de micosis en humanos, aunque Magarvey et al. (2004) describen el aislamiento de 3 cepas marinas con actividad antagónica a Candida albicans; y Kokare et al. (2004) señalan que de un total de 80 actinomycetes marinos lograron aislar 7 con gran actividad antifúngica. Igualmente, Kathiresan et al. (2005), señalan que de 160 actinomycetes marinos enfrentados contra 4 principales hongos fitopatógenos, el 51% fueron eficaces contra Helminthosporium oryzae y Pyricularia oryzae, el 31% contra Rhizoctonia solani y el 12,5% contra Colletotrichum falcatum. Ante estos resultados, queda como tarea inmediata determinar si los actinomycetes aislados en el presente trabajo tienen algún efecto inhibitorio sobre hongos fitopatógenos de nuestro medio.

Actividad inhibitoria de extractos de cultivos obtenidos con etil acetato

El uso de solventes orgánicos para la obtención de principios activos a partir de cultivos microbianos es de aplicación frecuente en biotecnología. En este caso, a partir de un cultivo en agitación de la cepa elegida (M10-77) se ha logrado recoger extractos crudos con etil acetato, los cuales mostraron tener limitada capacidad inhibitoria contra el patógeno S. aureus cepa 457. Si bien, el resultado en este estudio es aún discreto, pues las medidas de los halos de inhibición generados por los extractos no superaron a 26 mm de radio, muy posiblemente una estandarización de la metodología brindará buen rendimiento en la extracción de principios activos a partir de cultivos de actinomycetes marinos. Trabajos similares al presente indican que es necesario probar varios solventes orgánicos y varias cepas indicadoras; así, Leiva et al. (2004) utilizando 5 solventes diferentes obtuvo mejores resultados con etilmetilcetona que tuvo un rendimiento muy activo contra Bacillus subtilis.

Futuros estudios de este tipo permitirán conocer la biodiversidad, biogeografía, distribución y el rol que cumplen los actinomycetes en los ecosistemas marinos; así como el potencial uso de sus productos en diversos campos de la biotecnología microbiana.

Agradecimientos

Literatura citada

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Correspondencia