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Revista Peruana de Biología

versión On-line ISSN 1727-9933

Rev. peru biol. v.17 n.1 Lima abr. 2010

 

Identificación de Yarrowia lipolytica (Ascomycota: Hemiascomycetes) como contaminante en la obtención de amplificados del gen 28S rRNA de moluscos

TRABAJOS ORIGINALES

 

Identificación de Yarrowia lipolytica (Ascomycota: Hemiascomycetes) como contaminante en la obtención de amplificados del gen 28S rRNA de moluscos

Identification of Yarrowia lipolytica (Ascomycota: Hemiascomycetes) as a contaminant in obtaining amplified 28S rRNA gene of mollusks

 

Jenny Chirinos1,2 ; Carlos Congrains1,2 ; Rina Ramírez1,2 ; Pablo Ramírez3

1 Laboratorio de Sistemática Molecular y Filogeografía. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
2 Departamento de Malacología y Carcinología, Museo de Historia Natural, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Av. Arenales 1256, Apartado 14-0434, Lima-14, Perú.
3 Laboratorio de Microbiología Molecular y Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
Email Jenny Chirinos: jennymartha.2609@gmail.com,
Email Rina Ramírez: rina_rm@yahoo.com


Resumen

En el presente trabajo se identifica una secuencia de DNA no esperada proveniente de los amplificados del gen 28S rRNA de moluscos terrestres. Las extracciones de DNA se realizaron del tejido del pie de caracoles terrestres por el método del CTAB modificado. Las PCRs fueron llevadas a cabo con primers universales para el gen COI e iniciadores diseñados para moluscos, para el marcador 16S rRNA, 28S rRNA y la región ITS-2. Los tamaños aproximados de las bandas de los amplificados de moluscos fueron de 706 pb para el COI, 330 pb para el 16S rRNA, 900 pb para el ITS-2 y 583 pb para el 28S rRNA; un amplificado del último marcador fue de una longitud inesperada, ~340 pb. Las secuencias de DNA fueron comparadas con la base de datos del GenBank mediante el programa BLASTn y la muestra con la banda de tamaño inesperado resultó en un 100% de identidad y cobertura del 99% con el gen 26S rRNA de la levadura Yarrowia lipolytica. El análisis filogenético con Neighbour-Joining y los valores de divergencia confirmaron la identificación, proporcionando resultados que apoyan la ubicación taxonómica de la especie dentro del clado de los Hemiascomycetes.

Palabras claves: 26S rRNA, Gastropoda, fungi, código de barras de DNA.

 


Abstract

In this paper we identify an unexpected DNA sequence from the amplicons of 28S rRNA gene of terrestrial mollusks. DNA extractions were performed from foot tissues of land snails using a modified CTAB protocol. PCRs were carried out with universal primers for COI gene and oligonucleotides designed for molluscs, for the markers 16S rRNA, 28S rRNA, and ITS-2. Amplified lengths were 706 pb for COI, 330 pb for 16S rRNA, 900 pb for ITS-2, and 583 pb for 28S rRNA. One amplicon of the last marker was of an unexpected length, ~340 pb. DNA sequences were compared in the GenBank database through the BLASTn program and the sample, with the unexpected length, resulted in 100% identity and 99% query coverage with 26S rRNA gene of the yeast Yarrowia lipolytica. Phylogenetic analysis with Neighbour-Joining and the divergence values confirmed the identification, providing results that support the taxonomic placement of the species within the Hemiascomycetes clade.

Keywords: 26S rRNA, Gastropoda, fungi, DNA barcode.

 


Introducción

Las técnicas moleculares basadas en el análisis del DNA constituyen herramientas muy poderosas que permiten establecer las relaciones filogenéticas y la identificación de especies. La técnica de PCR emplea primers universales y específicos para amplificar genes o segmentos de genes, siendo los primeros muy conservados en un amplio rango de especies (Liew et al. 1998, Palumbi 1996).

El gen RNA ribosomal (rRNA) está presente en todas las especies existentes y presumiblemente se remonta a las primeras formas de vida, por lo tanto, reflejaría la historia evolutiva de la vida y dilucidaría las relaciones evolutivas entre todas las especies de la tierra (Pace 1997). La unidad repetitiva del rDNA presenta diferentes regiones que varían en su tasa de mutación, proporcionando información para el análisis filogenético de poblaciones, especies y niveles taxonómicos superiores (Jorgensen & Cluster 1988, Schaal & Learn 1988). Las regiones codificantes constituyen secuencias muy conservadas y poseen la tasa más baja de divergencia. Los ITS muestran un nivel intermedio de variabilidad, mientras que los IGS presentan las regiones de evolución más rápida (Zhou et al. 1996). El rRNA constituye el componente estructural de los ribosomas. En moluscos, la subunidad mayor del rRNA nuclear es el 28S, mientras que en hongos es 25S-28S. Estudios realizados por Markmann y Tautz (2005), proponen a la región D3-D5 del 28S rRNA como marcador adecuado en la discriminación de una amplia gama de taxa. Los primers empleados en dicho estudio parecen ser universalmente aplicables a todos los taxa eucariotas. Sugieren además, que la región que comprende los dominios D1 y D2 podría discriminar taxa muy estrechamente relacionados.

El tipo de RNA más abundante en las células es el ribosomal. Los hongos poseen cien o más copias de genes ribosomales en su genoma (Maleszka & Clark-Walker 1993). Esta característica, aunada a la naturaleza altamente conservada de la molécula y a la alta sensibilidad de la técnica de PCR, puede conducirnos a resultados falso-positivos, en casos de contaminación con DNA de levaduras.

En el presente trabajo, mediante métodos in silico, es identificada una secuencia de DNA no esperada en los amplificados del gen 28S rRNA de moluscos.

Materiales y métodos

Entre los meses de enero y junio de 2009, en el laboratorio de Sistemática Molecular y Filogeografía de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima-Perú), se obtuvieron amplificados de DNA nuclear y mitocondrial de distintas especies de moluscos terrestres de la familia Scolodontidae y de los géneros Megalobulimus (Megalobulimidae) y Bostryx (Orthalicidae).

Se realizaron extracciones de DNA empleando una modificación del método del CTAB (Ramírez 2004). Para la remoción de las proteínas se utilizó cloroformo-alcohol isoamílico (96:4). El DNA fue precipitado usando etanol absoluto frío y acetato de amonio. El pellet obtenido fue lavado en alcohol absoluto y secado a temperatura ambiente. Luego se resuspendió en agua bidestilada y finalmente fue conservado a -20 ºC.

La amplificación de las secuencias siguió el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al. 1988). Las PCRs fueron realizadas con primers universales para el gen mitocondrial COI (Folmer 1994) e iniciadores diseñados específicamente para moluscos, para el marcador de los genes ribosomales mitocondrial, 16S rRNA (Ramírez 2004) y nucleares, 28S rRNA y la región ITS-2 (Wade & Mordan 2000).

La detección de los productos de amplificación se realizó mediante electroforesis submarina en geles de agarosa al 1% en buffer TBE 0,5X. Las bandas se visualizaron por tinción con bromuro de etidio en un transiluminador y sus tamaños fueron determinados por comparación con un marcador de tamaño molecular GeneRuler 100bp DNA Ladder (Fermentas).

Los amplificados fueron purificados y secuenciados en Macrogen USA (http://www.macrogenusa.com/). La muestra problema, codificada como cP13, fue secuenciada con el primer LSU4. Dicha secuencia se obtuvo de un amplificado con los primers LSU2 y LSU4, para el 28S rDNA de un individuo de Systrophia eatoni (Gastropoda, Scolodontidae), una especie procedente del bosque tropical lluvioso del Departamento de Madre de Dios (Perú); posteriormente se obtuvo de este mismo espécimen un segmento amplificado del tamaño esperado. Los electroferogramas, obtenidos en formato AB1, fueron evaluados con ayuda del programa Chromas (McCarthy 1996). Las secuencias editadas fueron comparadas con la base de datos del GenBank en el programa BLASTn (Altschul et al. 1997). La secuencia en estudio está depositada en el GenBank con el número de accesión HQ148659, así como la del molusco Systrophia eatoni (HM116229).

Para el análisis filogenético, se levantó un total de 24 secuencias de especies de levaduras (Tabla 1) de la base de datos del GenBank. Las secuencias fueron sometidas a alineamiento múltiple usando el programa ClustalX2 (Larkin et al. 2007). Para la presentación de alineamientos de las figuras 2 y 3 se usó el programa BOXSHADE 3.21 (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html). El programa MEGAv4.0 (Tamura et al. 2007) se usó para la obtención de la frecuencia de bases nucleotídicas, distancias genéticas, reconstrucción filogenética por el método Neighbour-Joining (NJ) con corrección de distancias genéticas con el modelo de substitución nucleotídica Kimura 2-parámetros (Kimura 1980), y el método de bootstrap con 1000 réplicas para evaluación de la consistencia del árbol filogenético. Los gaps no fueron considerados en la obtención de la filogenia; el árbol fue enraizado con una secuencia del archiascomyceto Schizosaccharomyces pombe, siguiendo a Kurtzman y Robnett (1998).

 

 

Resultados

Los tamaños de las bandas obtenidas en la amplificación de marcadores mitocondriales, fueron de 706 pb para el COI y alrededor de 330 pb para el 16S rRNA. Para los marcadores nucleares, se amplificaron segmentos de alrededor de 900 pb para el ITS-2 y 583 pb para el 28S rRNA, evidenciando para este último marcador una muestra de tamaño inesperado con ~340pb (Fig. 1). Luego de contrastar las secuencias con la base de datos del GenBank, sólo la muestra con la banda de tamaño inesperado (cP13) no fue identificada como gastrópodo, mostrando un porcentaje de identidad del 100% y cobertura del 99% con el gen 26S rRNA de la levadura Yarrowia lipolytica (GQ121611). Los primers que flanquean tal fragmento se ubican en los sitios 252-271 (LSU2) y 599-580 (LSU4) de la secuencia completa del gen 26S rRNA de Yarrowia lipolytica (AJ616903); ambos primers difieren en un solo nucleótido de sus extremos 5´ con esta secuencia de Y. lipolytica (Figs. 2 y 3).

 

 

 

 

 

 

La secuencia de 583 pb del gen 28S rRNA del molusco terrestre Systrophia eatoni (HM116229) tiene sus extremos coincidentes con dos regiones conservadas del gen 26S rRNA de la levadura ascomiceta Yarrowia lipolytica, 138 sitios en su extremo 5´ y apenas 40 sitios en su extremo 3´ (Figs. 2 y 3).

El alineamiento de la secuencia problema junto con otras 24 secuencias del gen 26S rRNA de levaduras ascomicotas obtenidas del GenBank constó de 342 sitios (sólo incluye el primer LSU2), con 157 sitios conservados y 178 sitios variables, de los cuales 138 correspondieron a sitios parsimoniosamente informativos. En cuanto al contenido nucleotídico, la secuencia cP13 presenta 20,2% de timina, 20,5% de citosina, 29% de adenina y 30% de guanina, semejante al de Y. lipolytica, con un alto contenido de C+G (51%) para el gen 26S rRNA, a diferencia de la de otras levaduras (Tabla 2).

 

 

El árbol filogenético NJ mostró un clado muy robusto que agrupó las secuencias de la especie Yarrowia lipolytica y la secuencia en estudio con un valor de bootstrap del 99% (Fig. 4).

 

 

En relación a la distancia genética, la secuencia cP13 presenta una mínima divergencia (0,3%) con la especie Yarrowia lipolytica y un 10,7% con Candida deformans; con las demás tiene una alta divergencia que varía de 36,2% (Candida albicans) a 45,5% (Schizosaccharomyces pombe) (Tabla 3).

 

 

Discusión

Yarrowia lipolytica es el único taxón conocido del género. Según estudios realizados con el gen 18S rRNA (Barns et al. 1991) y el gen 26S rRNA (Kurtzman y Robnett 1998; Kurtzman y Robnett 1995) se ha demostrado que la especie se encuentra dentro del linaje Hemiascomycetes, que contiene grupos de levaduras ascomicotas muy divergentes, las cuales difieren en varias propiedades, tales como el alto contenido de C+G en el DNA nuclear (Kurtzman & Fell 1998), y en la organización genómica única de los genes del rRNA (Fournier et al. 1986). Sin embargo, posee regiones conservadas coincidentes con el gen 28S rRNA de moluscos, lo que permitió su amplificación con los primers LSU2 y LSU4 (Wade & Mordan 2000), como lo aquí reportado.

En el análisis filogenético NJ, la secuencia problema (cP13) se ubicó en el clado de Yarrowia lipolytica. Ello indicaría que el segmento de 340 pb obtenido de entre amplificados del marcador 28S rRNA de moluscos terrestres corresponde al gen 26S rRNA de Yarrowia lipolytica. Al mismo tiempo, este segmento que corresponde parcialmente a los dominios D1 y D2 del gen 26S rRNA, ha sido suficiente como para agrupar a las especies utilizadas en los mismos clados que formaron en una filogenia de los dominios D1/D2 de levaduras ascomicetas, con ~600 pb (Kurtzman & Robnett 1998).

Las estrategias de identificación basadas en secuencias constituyen el nuevo gold standard en la identificación de especies (Hebert et al. 2003, Hajibabaei et al. 2006). El DNA barcoding es una nueva técnica de diagnóstico molecular que emplea una corta secuencia de DNA para la identificación a nivel de especie (CBOL: www.barcoding.si.edu). En el presente, la metodología que emplea esta técnica se basa en la asignación de identidad referida a una mínima distancia genética con la secuencia consultada (Ratnasingham & Hebert 2007). En este contexto, se han propuesto valores estimativos para el mtDNA del 1-2% de variación intraespecífica y valores mayores para separar especies. Estudios utilizando la región D1/D2 del gen 26S rRNA para identificar especies de Candida mostraron un rango de variación de 0 a 2 nucleótidos (Kurtzman & Robnett, 1997), menos del 1% de divergencia en Issatchenkia, Pichia y Saccharomyces (Peterson & Kurtzman, 1991). Aunque al presente aun no hay consenso en el marcador "universal" para obtener código de barras de DNA en hongos, la región D1/D2 del 26S rDNA ofrece buena resolución en análisis filogenéticos (Kurtzman & Robnett 1998), y sirvió, en este trabajo, también para identificar un fragmento de 307 pb, que fue prácticamente idéntico al de Yarrowia lipolytica, con apenas 0,3% de divergencia. Cabe mencionar que la especie Candida deformans se mostró muy relacionada a Yarrowia lipolytica y a la secuencia problema, tanto en el árbol filogenético NJ, como en los valores de divergencia (10,4 y 10,7%, respectivamente). Mediante comparaciones fenotípicas, Candida deformans fue considerada como un sinónimo de Y. lipolytica (Kurtzman & Fell 1998; Barnett et al. 2000). Los resultados del presente estudio demuestran que Y. lipolytica y C. deformans forman taxa diferentes aunque muy relacionados, coincidente con lo obtenido por Bigey et al. (2003) y Knutsen et al. (2007). Además, sugieren un claro ejemplo de la utilidad del DNA Barcoding en la identificación de especies pertenecientes a taxa difícilmente diagnosticables sobre la base morfológica.

Yarrowia lipolytica es un habitante común de materia en descomposición y tiene una amplia distribución geográfica y de hábitats, tal como lo evidencia el trabajo realizado por Knutsen et al. (2007). Su población puede verse incrementada en condiciones de humedad elevada. Aunque este factor pudo haber influenciado en los resultados obtenidos en este estudio, no fue determinante, ya que de un total de 60 amplificados empleando DNA de moluscos terrestres, 10 de ellos designados para el marcador 28S rRNA, sólo se detectó un caso de contaminación. Sin embargo, cabe la posibilidad de que haya sido un contaminante que estuvo en el pie del caracol (Systrophia eatoni), y que aun luego de los lavados con etanol 96º no fue removido. Un caso semejante ha sido reportado entre amplificados de las regiones ITS y 5,8S del rDNA de bambús (Bambuseae) con hongos no-ascomycetos, por lo que los autores remarcan la posibilidad de amplificaciones por PCR de DNAs contaminantes en estudios filogenéticos, particularmente cuando son usados primers universales (Zhang et al. 1997).

Agradecimientos

Este trabajo fue parte del proyecto 091001041, financiado por el Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Agradecemos a V. Borda por la edición de las figuras.

 

Literatura Citada

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Trabajo presentado a la XVIII Reunión Científica del Instituto de Investigaciones en Ciencias Biológicas Antonio Raimondi, “200 años del nacimiento de Charles Darwin y el 150 aniversario de la publicación de On the Origin of Species by Means of Natural Selection”. Del 19 al 21 de agosto de 2009.

 

Publicado impreso: 20/10/2010
Publicado online: 29/09/2010