A pesar de ser conceptos diferentes, los términos PIC (Contenido de Información Polimórfica) y H (Heterocigosidad) se utilizan como sinónimos para estimar la "diversidad genética" (Smith et al. 1997; Smith et al. 1992; Raina et al. 2001) y resultaría ser la probabilidad de que un marcador encuentre diferencias entre 2 individuos en al menos 1 locus (Duque 1998). Los valores del PIC varían desde 0 (monomórfico o no discriminatorio) hasta 1 (muy polimórfico o altamente discriminatorio, con varios alelos en igual frecuencia). (Smith et al. 1997).

Sin embargo para un locus con dos alelos se utiliza la siguiente fórmula:

donde "p" es la frecuencia de la presencia del marcador (alelo 1) y "q" es la frecuencia de la ausencia del marcador (alelo 2) (Ghislain et al. 1999; Powell et al. 1996).

Los valores PIC nos dan una idea de la capacidad de cada marcador generado para revelar loci polimórficos en nuestras entradas (Ghislain et al., 1999), así, como el valor de la frecuencia de ocurrencia de cada una de nuestras bandas (alelos) y es considerada además, una medida de diversidad genética (Senior et al. 1998; Smith et al. 1997; Raina et al. 2001).

Obtenidos los valores PIC de cada uno de los marcadores o bandas se procedió con la elección de aquellas cuyo PIC sea >0,1 y <0,5, por ser considerados estos niveles como los límites empíricos para detectar diferencias utilizando un gran número de repeticiones (Ghislain et al. 1999). Las demás bandas fueron descartadas por su bajo contenido de información polimórfica.

Los análisis de asociación en base a las similitudes genéticas se realizaron en el programa NTSYSpc 2.1, utilizando el coeficiente de similitud simple, ya que se asume que cada banda en el gel corresponde a un locus con 2 alelos: presencia (alelo 1) y ausencia de la banda (alelo 2). Al comparar 2 entradas que no posean una determinada banda serán consideradas que poseen el mismo alelo en ese locus (Powell et al. 1996; Ghislain 1999). Sin embargo, otras matrices de similitud fueron generadas en base a los coeficientes de Jaccard y el de DICE, las cuales fueron comparadas con la matriz de similitud simple matching, para encontrar posibles diferencias entre los valores de similitud genética y disminuir el sesgo por la elección del coeficiente de asociación.

Para construir nuestra matriz de similitud se consideró el criterio de selección para marcadores dominantes en base al PIC, el cual sólo considera a aquellos marcadores con frecuencias PIC > 0,10 y < 0,50, con lo cual se redujo el número de marcadores de nuestra matriz de datos, de 157 bandas polimórficas a 135 bandas polimórficas. Esta nueva matriz de datos de 135 bandas polimórficas y 65 entradas fue utilizada para obtener la matriz de similitud genética.

Luego de comparar de par en par todas las entradas, para generar la matriz de similitud, se procedió al análisis de agrupamiento para la obtención del dendrograma y los respectivos clusters. Los análisis de agrupamiento o clusters fueron realizados en base a la matriz de similitud "simple matching" (SM). Se utilizaron tres tipos de ligamiento: simple, completo y promedio, para construir los dendrogramas y visualizar las relaciones de similitud existente en las entradas. Las diferencias entre estos dendrogramas fueron evaluadas mediante la correlación entre los valores cofenéticos de cada dendrograma y la matriz de similitud mediante el test de Mantel.

Para validar el número de grupos generados (clusters) en el dendrograma de acuerdo a cada tipo de ligamiento, se utilizaron 3 controles: correlación entre la matriz de similitud y la matriz cofenética generada en base al dendrograma mediante el test de Mantel; reproducibilidad de los grupos por el análisis "bootstrap", mediante el programa Winboot (Yap 1996), aplicando 500 repeticiones en base al agrupamiento UPGMA; y la estructura de los grupos conformados, el cual nos permitió conocer la proporción de similitud entre los integrantes de un grupo, en base a las bandas compartidas y las bandas exclusivas de dicho grupo (Tabla 3).

Utilizando el programa DIVA-GIS se analizó la distribución de los grupos generados (clusters) en base a las similitudes genéticas, con el objeto de dilucidar patrones geográficos, genéticos, mapeo de riqueza y diversidad basada en datos de marcadores moleculares. Para ello fue necesario utilizar la información registrada en el pasaporte de cada una de las entradas en cuanto a su ubicación geográfica (Latitud, longitud y la altitud).

Se realizó la búsqueda de áreas geográficas que posean la mayor concentración de grupos genéticos (clusters), utilizando para ello celdas (grids) de 0,15° (aproximadamente 225 Km²). Cada grid o cuadrícula representa un área en el cual están ubicadas las entradas colectadas que pertenecen a un determinado grupo genético.

Al comparar la cantidad de grupos genéticos existentes entre una cuadrícula y otra, podemos obtener diferencias entre la variabilidad presente en ellas; así como, ubicar las cuadrículas con el mayor número de grupos genéticos. Cada uno de los grupos obtenidos fueron graficados en sus respectivas zonas geográficas de colecta para observar su distribución.

Registro de las bandas informativas amplificadas.- Los patrones de bandas de las combinaciones de "primers" AFLP, de cada una de las entradas, fueron registrados en una matriz de datos en una hoja Excel de Windows. Se consideró 1, para la presencia de una banda y 0 para la ausencia de la misma.

Las 10 combinaciones de iniciadores AFLP amplificaron un total de 344 bandas reproducibles en nuestras 65 entradas, con un promedio de 34 bandas escoreables por combinación de iniciadores (Rango: 30 a 43 bandas) cuyos tamaños se encuentran comprendidas entre los 1100 y 250 pb.

De las 344 bandas reproducibles, sólo 157 bandas fueron informativas o polimórficas (45,6%), que son aquellas que muestran por lo menos 2 estados (alelos): presencia y ausencia del marcador. Las demás bandas son consideradas no informativas o monomórficas y son descartadas del análisis, porque no presentan 2 alelos o estados, por lo tanto no permiten encontrar diferencias entre 2 entradas. Se obtuvo en promedio 16 bandas informativas por combinación de iniciadores (Rango: 08 a 21 bandas).

Contenido del índice polimórfico (PIC).- Los marcadores con valores PIC menores a 0,1 y mayores a 0,5 no fueron considerados, por lo que se eliminaron un total de 22 bandas (14%), las cuales no alcanzaron los valores establecidos. Un total de 135 bandas polimórficas (86%) lograron los niveles de polimorfismo requerido. De estas 135 bandas el 68,8% son generadas por sólo 6 combinaciones de iniciadores, señaladas con asterisco (*) en la Tabla 2.

La combinación de iniciadores Eco-RI: AAC / Mse-I: CAG generó los mayores valores PIC entre nuestras entradas y revela la mejor calidad de bandas informativas. Por otro lado, la combinación de iniciadores Eco-RI: ACT / Mse-I: CAA produce los más bajos valores PIC y una baja calidad en el revelado de los productos de amplificación, al igual que las combinaciones Eco-RI: AAC / Mse-I: CAA y Eco-RI: AGC / Mse-I: CTT.

Los valores PIC promedio de cada combinación de iniciadores fluctúan entre los 0,097 y los 0,343, con un promedio global de 0,23, lo cual indica una variabilidad media, teniendo en consideración que el valor máximo que podría adquirir este índice es de 0,5 para marcadores de tipo dominante.

Similitud Genética.- El 47,5% de la población analizada posee una similitud genética comprendida entre los 0,7 y 0,8; el 24,3% de la población posee los mayores valores de similaridad genética, comprendido entre los 0,8 y 1; y el 28,2% de la población posee los menores valores de similitud genética comprendidos entre 0,5 y 0,7, lo cual indica nuevamente una variabilidad media. La mayor variabilidad genética estaría dentro de la cuenca del Ucayali, porque posee los menores valores de similitud genética (Tabla 3); sin embargo, dichos valores son muy cercanos al de las otras cuencas.

Ligamiento completo.- El dendrograma de ligamiento completo estableció la conformación de 8 grupos genéticos a un nivel de similitud de 0,65 (Fig. 1). Se puede notar cierta tendencia en las accesiones de agruparse de acuerdo al tipo de suelo en la cual fueron colectadas, ya que el 85% de las entradas colectadas en las zonas denominadas de "altura" (162 – 367 m de altitud) están ubicadas en el cluster 8, el cual es el más numeroso. El 63,2% de las entradas fueron colectadas en terrenos "bajos" (132 – 152 m), sin embargo, la mayoría de ellas pertenecen a diferentes clusters.

El 87,5% de los grupos están fuertemente estructurados, al ser similares entre sí los miembros de un grupo en un rango del 47 al 76%; excepto el grupo 8, el cual sólo alcanza un 7% de bandas compartidas (Tabla 4). Es interesante hacer notar que el 54% de los miembros de este grupo 8 están ubicados en zonas denominados de "altura" entre los 162 y 367 msnm, al igual que los grupos 3 y 5 hallados entre los 175 y 303 m de altitud.

Distribución espacial de la variabilidad genética del maní.- Las entradas de maní fueron colectadas en 7 distritos pertenecientes a 2 provincias (Coronel Portillo y Padre Abad) abarcando 3 cuencas y a 4 tipos distintos de suelos. La mayor cantidad de colectas (52%) se registran en el distrito de Callería, provincia Coronel Portillo, cuenca del Ucayali, cuyos suelos son predominantemente "bajos" (Barrizal, Playa y Restinga).

Riqueza de grupos.- La mayor riqueza de grupos genéticos de maní se encuentran en la cuenca del Ucayali (Fig. 2), distrito de Callería, provincia Coronel Portillo del departamento de Ucayali. En dicha cuenca se logra ubicar los 8 grupos genéticos, siendo los grupos 1 y 3 exclusivos de esta cuenca, con una riqueza de hasta 5 grupos diferentes en una solo celda.  En la cuenca del Aguaytía se logra ubicar hasta 5 grupos genéticos y en la cuenca del San Alejandro sólo se tiene 2 grupos. Es importante mencionar que todas las entradas de la Cuenca San Alejandro pertenecen al grupo 8.

Distancia genética.- Los datos de marcadores moleculares, asociados a la ubicación geográfica de las localidades, fueron analizados también con el programa DIVA-GIS con la finalidad de estimar la variabilidad genética entre nuestras entradas. Para ello se calcularon las distancias genéticas en base al coeficiente de Sokal & Michener (1958).

Los valores de distancia genética se encuentran comprendidos entre 0> y <0,5, lo cual indica una variabilidad predominantemente media; siendo la cuenca del Ucayali la que posee los mayores valores de distancia genética (0,375 – 0,500). (Fig. 3).

Variabilidad genética.- A pesar de que el maní posee una gran variabilidad morfológica (Kochert et. al. 1996; Williams 1989), dicha variabilidad no había podido ser demostrada molecularmente al utilizar diversas técnicas de marcadores para encontrar polimorfismo a nivel del ADN en el maní (Garcia et al. 1 995; Halward et al. 1991; Halward et al. 1992; Hopkins et al. 1999; Kochert et al. 1991; Subramanian et al. 2000).

Sin embargo algunos investigadores lograron encontrar polimorfismo genético a nivel del ADN del maní, empleando la técnica de marcadores AFLP (He & Prakash 1997), con lo cual fue posible estimar las relaciones genéticas entre las diferentes variedades botánicas del cultivo (He & Prakash, 2001), aunque anteriormente, habían sido estimadas las relaciones entre algunas especies silvestres del mismo (He et al. 1995).

Al trabajar nosotros con las 10 combinaciones de iniciadores AFLP que mostraron ser polimórficos en estudios previos, obtuvimos algunas diferencias. Las 10 combinaciones de iniciadores amplificaron un total de 344 bandas, de las cuales 157 fueron informativas; lo cual difiere de las 695 bandas totales y 53 informativas reportadas anteriormente. (He & Prakash 1997).

Dicha diferencia podría ser explicada por el número de entradas de maní evaluadas, ya que en dicho estudio sólo se trabajo con 6 entradas de maní, pertenecientes a 3 variedades botánicas, en cambio nosotros trabajamos con 65 entradas de maní, lo que tal vez haya facilitado a la obtención de un mayor número de bandas informativas.

Los valores PIC nos dan una medida de la variabilidad genética (Powell et. al. 1996; Agrama & Tuinstra, 2003), pero por ser los marcadores AFLP dominantes, no muestran la totalidad de alelos que existen en un locus, por lo que podríamos obtener resultados diferentes si analizamos nuestras muestras con marcadores codominantes. Sin embargo el gran poder de análisis multiloci de los marcadores AFLP nos permite encontrar un mayor número de diferencias y similitudes a nivel del ADN, con lo cual es posible obtener grupos genéticamente similares al aplicar técnicas de taxonomía numérica en el análisis de nuestros resultados.

Los valores PIC fueron de gran utilidad para la elección de las bandas informativas tomadas en cuenta para el análisis de similitud genética, porque nos permitió establecer las bandas que detectan diferencias entre nuestras entradas, para establecer un matriz de similitud genética. (Ghislain et al. 1999).

El coeficiente de asociación simple considera las presencias y ausencias de un marcador como similitudes genéticas. (Powell et al. 1996; Ghislain et al. 1999); sin embargo la ausencia de un marcador no implica necesariamente una similitud genética, por lo tanto algunos investigadores utilizan los coeficientes de Jaccard y DICE, los cuales sólo consideran las presencias de las bandas como una similitud genética. (Vipa & Huestis 1997; Erschadi et. al. 2 000; Teulat et. al. 2000).

Por ello, se generaron matrices de similitud genética utilizando diferentes coeficientes de asociación para establecer si existían diferencias entre las matrices de similitud generadas. Los altos niveles de correlación entre las distintas matrices nos permitió determinar que no existían mayores diferencias entre ellas, por lo tanto podríamos trabajar indistintamente con cualquier tipo de coeficiente de asociación genética, sin que ello ocasione grandes distorsiones al realizar nuestro análisis de agrupamiento o dendrograma.

Los análisis de agrupamiento son realizados principalmente con el ligamiento promedio, sin embargo nosotros optamos por el ligamiento completo (a pesar de que su correlación cofenética no es buena), porque fue el único dendrograma que nos permitió distinguir los 8 grupos genéticos o clusters generados en el análisis de reproducibilidad "bootstrap". Además los dendrogramas generados por los ligamientos simple y promedio no establecieron una clara distinción de grupos entre las entradas, revelados en el análisis "bootstrap".

Distribución espacial de la variabilidad genética.- El programa DIVA – GIS, permitió visualizar la distribución espacial de los grupos genéticos obtenidos, los cuales están distribuidos principalmente en la cuenca del Ucayali. Al parecer dicha distribución obedece principalmente al tipo de suelo (barrizales y playas) de la cuenca del Ucayali, el cual es inundable durante la temporada de crecida de los ríos, lo que permite sembrar en un terreno suave, ideal para el desarrollo de las vainas del maní, posibilitando un mayor número de comunidades dedicadas a su cultivo; a comparación de las comunidades de las zonas de "altura", la cuales no son inundadas por los ríos, por lo que el terreno es duro y compacto, limitando el desarrollo de las vainas. (David Williams, comunicación personal).

Sin embargo, en la cuenca del Ucayali se efectuó la mayor cantidad de colectas (52 %) lo que tal vez haya influido en que la zona agrupe a la mayor cantidad de grupos, pero no debemos dejar de considerar que 2 grupos, son exclusivos de la cuenca. Los valores de distancia genética generados por el programa DIVA – GIS, reafirma a la cuenca del Ucayali como la que posee la mayor variabilidad genética del cultivo de maní.

Email: Luis Rimachi: lrimachi@inia.gob.pe

Rolando Estrada: restradaj@gmail.com

Presentado: 24/07/2012

Aceptado: 29/11/2012

Publicado online: 15/01/2013