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Revista Peruana de Biología

versión On-line ISSN 1727-9933

Rev. peru biol. vol.26 no.4 Lima oct./dic 2019

http://dx.doi.org/10.15381/rpb.v26i4.15829 

TRABAJOS ORIGINALES

Evaluación de dos secuencias de código de barras de ADN en germoplasmas de Arracacia xanthorrhiza (Apiaceae) de Ecuador

Evaluation of two sequences of DNA barcodes in germplasms of Arracacia xanthorrhiza (Apiaceae) from Ecuador

 

Marta Dávila 1 ORCID iD: 0000-0003-1031-4284, Hernán Laurentín 2 ORCID iD:, Carlos Vásquez* 1 ORCID iD: 0000-0002-8214-3632, Sara ParedesCarreño 1 ORCID iD: 0000-0003-1453-4209, Vanessa Frutos 1 ORCID iD: 0000-0002-2569-9431 y Olguer León 1 ORCID iD: 0000-0003-2521-8842

1 Universidad Técnica de Ambato. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Carretera Cevallos-Quero, 180350 Cevallos, Provincia de Tungurahua, Ecuador.

2 Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado, Decanato de Agronomía. Departamento de Ciencias Biológicas. Venezuela.


Resumen

El presente estudio evalua el gen de cloroplasto rbcL y la región espaciadora no codificante psbA-trnH de Arracacia xanthorrhiza como posible secuencia de código de barra. Se colectó material vegetal de A. xanthorrhiza en huertos de las provincias de Pichincha, Tungurahua y Cotopaxi, las cuales fueron sembradas en condiciones homogéneas en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Técnica. El análisis del locus rbcL identificó los cinco materiales de A. xanthorrhiza con entre 97 y 99% de homología. La alineación de secuencias del locus rbcL y de psbA-trnH permitió diferenciar dos grupos, el primer grupo con SJ, QU, PP y B, observándose poca diversidad entre ellos, mientras que el segundo grupo está conformado por el material CH cultivado a 3260 m de altitud. En el segundo árbol, se demostró la divergencia entre los materiales colectados en diferentes provincias de la Sierra ecuatoriana, separándolos de acuerdo a su localidad, así como al color de la pulpa de la raíz. La región intergénica no codificadora (psbA-trnH) permitió identificar y obtener la diversidad genética de materiales cultivados de A. xanthorrhiza, provenientes de diversas zonas geográficas de la sierra ecuatoriana, con características morfológicas distintivas. Adicionalmente, esta secuencia pudo diferenciar a A. xanthorrhiza de otras especies de la familia Apiaceae, con lo cual se recomienda como código de barra.

Palabras clave: Zanahoria blanca; rbcL; psbA-trnH; filogenia.


Abstract

The present study aimed to evaluate the Arracacia xanthorrhiza rbcL chloroplast gene and the non-coding spacer region psbA-trnH as a possible barcode sequence. Plant material of A. xanthorrhiza was collected in orchards of Pichincha, Tungurahua and Cotopaxi provinces. This material were cultivated in standard conditions in the la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Técnica. The rbcL locus analysis identified the five materials of A. xanthorrhiza with between 97 and 99% homology. The sequence alignment of rbcL locus and psbA-trnH allowed to differentiate two groups, the first group with SJ, QU, PP and B, showing low diversity among them, while the second group consisted of the CH material grown in 3260 m of altitude. In the second tree, the divergence between the materials collected in different provinces of the Ecuadorian Sierra was demonstrated, separating them according to their locality, as well as the color of the root pulp The non-coding intergenic region (psbA-trnH) allowed identify and obtain the genetic diversity of cultivated materials of A. xanthorrhiza, from various geographical areas of the Ecuadorian Sierra, with distinctive morphological characteristics. Additionally, this sequence was able to differentiate A. xanthorrhiza from other species of the Apiaceae family, which is recommended as a bar code.

Keywords: White carrot; rbcL; psbA-trnH; phylogeny.


Introducción

Arracacia (Apiaceae) es un género de origen andino, del cual se han reportado entre 24 hasta 75 especies. Arracacia xanthorrhiza Bancr. es la única especies cultivada por pequeños productores en áreas de economía campesina y con poco desarrollo tecnológico (Blas et al. 2008). Por su importancia en la zona andina, A. xanthorrhiza material cultivado y endémico de Colombia y Perú ha sido estudiado morfológicamente, caracterizado agronómicamente y genéticamente (Rosso et al. 2014; Blas et al. 2008; Valderrama & Seminario 2002). Así mismo, Valderrama y Seminario (2002) describieron la variabilidad morfológica y distribución geográfica de una colección de arracacha de Perú y establecieron las zonas de mayor variabilidad basados en 17 descriptores cualitativos. Quilapanta et al. (2018) establecieron diferentes poblaciones de arracacha cultivadas en los Andes ecuatorianos, las cuales se corresponden con morfotipos bien distinguibles. También, han sido reportados caracterizaciones moleculares en bancos de germoplasmas de Ecuador y Perú (Morillo et al. 2004; Morillo & Sécond 2017). Morillo y Sécond (2017) utilizaron análisis de polimorfismos en AFLPs y de regiones no codificadoras de cloroplastos y determinaron que se podría establecer la hipótesis de que la domesticación de la arracacha pudo derivarse de la forma silvestre y que actualmente existen dos grupos de cultivares bien distinguibles a nivel molecular.

La tecnología de códigos de barra de ADN ha surgido como una herramienta importante en estudios de conservación (Vivas et al. 2014), así como para la trazabilidad de alimentos (Galimberti et al. 2013), puesto que provee una forma rápida y confiable la identidad taxonómica de una especie mediante la comparación de secuencias cortas del genoma con secuencias existentes en bases de datos. Basado en la facilidad de su amplificación, secuenciación, alineación múltiple y la variabilidad se han seleccionado tres loci de plastidio como "marcadores codificadores de barra" para plantas; porciones de las regiones codificantes de rbcL (Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylasa/oxygenasa), matK (Maturasa K) y trnHpsbA (intergenic spacer). Estas secuencias son segmentos pequeños de ADN universales de alta variabilidad, los cuales usando la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), proporcionan a los investigadores un protocolo estandarizado que permite establecer las diferencias entre organismos estrechamente relacionados (Liu et al. 2012; Kane et al. 2012); inventarios de ecosistemas complejos (Burgess et al. 2011; Costion et al. 2011), detectar contaminantes en productos terminados (Guo et al. 2011; Newmaster et al. 2013) , entre otras aplicaciones.

En virtud de esto y dada la importancia de la identificación correcta de A. xanthorrhiza por su utilidad y vulnerabilidad, siguiendo la recomendación de varios autores de trabajar con este tipo de marcadores para la separación inequívoca entre especies muy relacionadas (Chase et al. 2007), el objetivo de este trabajo es reportar un código de barras de ADN de A. xanthorrhiza, con la finalidad de obtener su correcta identificación así como la de sus productos derivados.

Materiales y métodos

Material vegetal.Se colectó material vegetal de A. xanthorrhiza en huertos de las provincias de Pichincha, Tungurahua y Cotopaxi (Fig. 1, Tabla 1). Todas las muestras fueron herborizadas y depositadas en el Herbario AMAS de la Universidad Técnica de Ambato. Para la obtención de estas plantas, se contó con el convenio entre el Ministerio del Ambiente de Ecuador y la Universidad Técnica de Ambato No. MAE-DNB-CM-2017-0070.

Todas las plantas se sembraron en condiciones homogéneas en la Granja Experimental Docente Querochaca, Facultad de Ciencias Agropecuarias, de la Universidad Técnica de Ambato (UTA) ubicada en el cantón Cevallos, provincia de Tungurahua, Ecuador (01°24’02"S; 78°35’20"W, altitud 2850 m de altitud) Las condiciones climáticas de la granja experimental fueron: temperatura media diaria 13.5 °C, humedad relativa media 75.8%, precipitación anual 494,0 mm, evapotranspiración anual 2.6 mm. Las plantas provenientes de San José de las Minas (SJ) [Quito, Prov. de Pichincha], Quillán (QU) [Píllaro, Prov. de Tungurahua] y El Triunfo (B) [Baños, Prov. de Tungurahua], tienen la raíz de pulpa blanca. El material de Quinchicoto (CH) [Tisaleo, Prov. Tungurahua], tiene la raíz de pulpa blanca y las hojas y peciolos de color púrpura y las raíces del material procedente de Penipe (PP) [Penipe, Prov. Chimborazo] tiene la pulpa amarilla (Fig. 2).

Extracción de ADN.Para la extracción del ADN de las hojas, se usó el método de Doyle y Doyle (1987), con pequeñas modificaciones. Cien miligramos (100 mg) de tejido de hojas jóvenes se trituraron con 1mL de buffer de extracción (2% CTAB, 1.5 M NaCl, 20mM EDTA pH 8.0, Tris 100 mM pH 8.0 y 2-mercaptoetanol 2%) recién preparado. Esta mezcla se incubó en baño de María a 65 °C durante 55 min con agitación cada 15 min para luego centrifugar a máxima velocidad por 5 min. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y se agregó igual volumen de una mezcla de cloroformo-isoamil alcohol mezclando por inversión varias veces. Se sometió a centrifugación a 10.000 rpm durante 10 min para transferir la fase acuosa a otro tubo donde se añadió RNAsa (10mg/ mL) y se incubó a 37 °C durante 30 min. Seguidamente, se agregó un volumen igual de isopropanol a -20 °C y se congeló para precipitar el ADN. A continuación se centrifugó nuevamente a 10.000 rpm por 10 min, se descartó el sobrenadante y el precipitado con el ADN se lavó dos veces con 200 µL de etanol 70%. Se dejó secar completamente y se resuspendió en buffer TBE 1X (Tris/Borato/ EDTA a pH 8,3)

Alícuotas de 5 µL se corrieron en geles de agarosa de 2% con SYBR safe DNA gel stain (Invitrogen™, USA) en buffer TBE1X a 100V y 200 mA por 35 min y fotodocumentados con un Enduro™ GDS Touch (Labnet, USA).

Amplificación de ADN.- Para la amplificación se utilizaron las regiones codificantes de cloroplasto rbcLa-F (ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC) (Levin et al. 2003) y rbcLa-R (GTAAAATCAAGTCCACCRCG) (Kress & Erickson 2007) y regiones espaciadoras intergénicas psbA3_f (GTTATGCATGAACGTAATGCTC) (Sang et al. 1997) y trnHf-05 (CGCGCATGGTGGATTCACAAATC) (Tate & Simpson 2003) sintetizados por Invitrogen™, siguiendo las recomendaciones del consorcio para código de barras de plantas (CBOL 2009). Se amplificó cada par de iniciadores por separado (rbcLa F-R y psbA-trnH). Las reacciones de PCR se hicieron a un volumen final de 25 µL, usando 25 ng de ADN de cada muestra, 0.2 nM de cada primer, . limerasa (Invitrogen™) bajo las siguientes condiciones: un primer paso de desnaturalización a 94 °C por 4 min, seguido por 35 ciclos de 30 s a 94 °C, 50 s a tres diferentes Ta ( 48, 55 y 60 °C) y 1 min a 72 °C con una extensión final de 10 min a 72 °C. La amplificación del ADN, se llevó a cabo en un termociclador SimpliAmp (AppliedBiosystems, CA, USA). Los productos de PCR para todos los iniciadores fueron resueltos en un gel de agarosa al 0.8% en buffer TBE 1,0X, visualizados con SYBR safe DNA gel stain (Invitrogen™) y registrados en un fotodocumentador Enduro GDS Touch (Labnet). Las secuencias obtenidas fueron depositadas en el GenBank (Tabla 3).

Secuenciación de ADN y análisis de datos.- Las reacciones de PCR fueron secuenciadas por la compañía Macrogen (USA) utilizando los primers rbcLa-F y psbA- 3. Las similitudes en las secuencias fueron comparadas usando BLASTn (Zhang et al. 2000) en el banco de genes disponible en el NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Relaciones filogenéticas.Las relaciones filogenéticas entre los materiales vegetales se analizaron por la alineación de secuencias en el programa ClustalW 2.0 (Larkin et al. 2007) para la construcción de árboles filogenéticos usando el programa MEGA 5.02 (Tamura et al. 2007) y los métodos de UPGMA (Sneath & Sokal 1973).

Resultados

Los amplicones obtenidos en las reacciones de amplificación con los dos pares de primers usados fueron de entre 576 a 1399 pb para el locus rbcL y entre 475 y 529 pb para el locus psbA (Tabla 2).

Taxonomía de germoplasmas de A. xanthorrhiza.- El análisis del locus rbcL identificó los cinco materiales de A. xanthorrhiza con entre 97 y 99% de homología, sin embargo, no hubo posibilidad de diferenciar a otras especies como Donnellsmithia cordata (97– 99%), Angelica acutiloba (98%), Zizia aurea (98– 99%) en los casos de QU, B, SJ y PP; mientras que el material de CH no mostró diferencia con las especies Spermolepis echinata; Musineon divaricatum y Pteryxia terebinthina (97%). La secuencia de nucleótidos del espacio intergénico psbAtrnH identificó los cinco materiales de A. xanthorrhiza con entre 93 y 95% de homología, en este caso la diferenciación con las especies más cercanas se logró con identidades por debajo de hasta un 7% (Tabla 3).

Filogenia de germoplasmas de Arracacia xanthorrhiza.- La alineación de secuencias del locus rbcL y de psbA-trnH (Figs. 3A-B) muestra la diversidad de los germoplasmas estudiados. En el primer caso se obtuvieron dos grupos, el primer grupo con SJ, QU, PP y B, observándose poca diversidad entre ellos, mientras que el segundo grupo está conformado por el material CH cultivado a 3260 m de altitud. En el segundo árbol, se demostró la divergencia entre los materiales colectados en diferentes provincias de la Sierra ecuatoriana, separándolos de acuerdo a su localidad, así como al color de la pulpa de la raíz.

Discusión

La secuencia nucleotídica de cloroplasto (rbcL) y la región intergénica (psbA-trnH) permitieron la identificación de materiales de zanahoria blanca colectadas en diferentes provincias de los Andes ecuatorianos identificándolas como A. xanthorrhiza, observándose un gap de 1% con el material de raíz amarilla (PP) y de 2% con uno de los materiales de raíz blanca, proveniente de una zona de sub-páramo (CH) y el cual mantiene consistentemente en las elevaciones más bajas, sus hojas de color verde oscuro y nervaduras y peciolos color púrpura (Quilapanta et al. 2018) Sin embargo, las secuencias rbcL no lograron discriminar estos materiales de otras especies de Apiaceae como Donnellsmithia cordata (U50225.1), Angelica acutiloba (KX352468.1), Zizia aurea (KT178117.1), Spermolepis echinata (KY627168.1), Musineon divaricatum (MG223530.1) y Pteryxia terebinthina (MG222157.1). Contrariamente, con el uso de psbA-trnH, se obtuvo un porcentaje de identidad entre nuestros materiales y la secuencia de A. xanthorrhiza (KY117235.1) depositada en el banco de genes más alto que aquel encontrado con otras especies de la misma familia: Angelica gigas (KX352468.1), Angelica anomala (U50225.1), Glehnia littoralis (KX352468.1), Tauschia parishii (KY627168.1) y Peucedanum officinale (MG222157.1). Concomitantemente, los valores del gap (conocido como una clara separación entre las distancias intraespecíficas promedio en relación a las distancias interespecíficas) entre las secuencias alcanzó hasta un 7%. La importancia del uso de marcadores moleculares en un grupo con divergencias recientes como es la familia Apiaceae ha sido señalada (Downie et al. 1998, 2015). Downie et al. (1998) pudieron separar tres tribus de Apioideae usando secuencias de regiones ITS y del intrón del gen de cloroplasto rpoC1. Los autores agruparon a los géneros de Mesoamérica, incluyendo Arracacia y Donnellsmithia, un grupo de géneros norteamericanos (p.e. Zizia y Musineon) y un tercer grupo de origen asiático (p.e. Angelica, Peucedanum) recalcando que la diferenciación de especies de estos dos últimos géneros es extremadamente difícil debido a que ambos son grupos grandes y morfológicamente muy heterogéneos.

Downie y Jansen (2015) indicaron que la región psbA-trnH no arrojó diferencias notables en el análisis de genomas de plastidios completos de Apiales para identificar regiones no codificadoras altamente divergentes. Estos autores recalcaron que una región de plastidio que haya sido identificada como altamente variable para el análisis filogenético de un grupo, puede no serlo en otro. Liu et al. (2014) reportaron una eficiencia de 56% de identificación en especies de la familia Apiaceae con psbA-trnH, indicando que es mucho más alta que la obtenida con rbcL o matK , una de las regiones codificadoras del genoma de plastidio de más rápida evolución (Hollingsworth et al. 2011). Con relación a los datos obtenidos en la presente investigación, la secuencia de la región inter espaciadora psbA-trnH permitió analizar las relaciones entre los materiales de zanahoria blanca de la región central de Ecuador (475-529pb). Esta región no codificadora es altamente variable en las angiospermas, por lo que se ha propuesto como código de barra (Kress et al. 2005).

El análisis de la secuencia psbA-trnH de los cinco materiales de A. xanthorrhiza estudiados mostraron que existe variabilidad genética entre ellos, estos materiales se agruparon de manera correcta, por su distribución geográfica, así como por el color de la pulpa de su raíz.

En contraste con los resultados de la secuencia psbAtrnH, el gen rbcL, que codifica para la sub-unidad más grande de la enzima ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa oxadasa en los cloroplastos (Cuénoud et al. 2002) esta constatado que evoluciona lentamente, por lo cual se usa en estudios filogenéticos (Braukmann et al. 2017). El uso del gen rbcL en este estudio, no reportó divergencia entre los materiales de las diferentes localidades, agrupando a cuatro de los mismos y discriminando solo al material proveniente de Quinchicoto (CH), el cual crece a 3260 m, la zona más alta que se consiguió producción de este cultivo.

Las divergencias entre los materiales estudiados no está clara, el hecho que los cultivos de raíces y tubérculos andinos son propagados vegetativamente, incluyendo la zanahoria blanca, una característica única dentro de las Apiaceae (Knudsen et al. 2006), es posible que se haya adquirido alguna mutación que haga distinguibles a los materiales vegetales de este tipo. McKey et al. (2010) indicaron que un gran número de cultivos que son propagados clonalmente (vegetativamente) son mucho más diversos en términos ecológicos, morfológicos y filogenéticos que aquellos propagados por semillas, aunque esta variabilidad eventualmente pueda resultar erosiva. Morillo et al. (2004) reportaron 14 secuencias microsatélite polimórficas en accesiones de A. xanthorrhiza, de estas solo dos loci (AxD82 y AxD85) se desviaron significativamente mostrando un exceso en heterocigosis. Igualmente, estos autores atribuyeron el alto polimorfismo al hecho de que este cultivo se propaga asexualmente. Morillo y Sécond (2017) trabajaron con 27 materiales cultivados de zanahoria blanca que eran mantenidos en el Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) de Ecuador, usando AFLPs, con el objetivo de establecer la domesticación de este cultivo y uno de los resultados que obtuvieron indica que 42% de las bandas eran polimórficas entre los cultivares. El análisis de los polimorfismos, contribuyó a establecer dos grupos de A. xanthorrhiza cultivados, uno de los grupos se relacionó con una especie silvestre perenne (A.x. var. andina) mientras que el otro grupo estuvo más cerca de la especie silvestre monocárpica (A.x.var. monocarpa). Estos resultados confirman la alta diversidad que se obtuvo en nuestro estudio, cuando se usó el espaciador intergénico no codificante (psbA-trnH).

El uso de psbA-trnH como código de barra tiene sus detractores, las inversiones intraespecífica pueden conducir a una sobreestimación de la variabilidad intraespecífica y las inversiones interespecíficas pueden confundir las relaciones genéticas entre especies estrechamente relacionadas (Whitlock et al., 2010). Sin embargo, otros autores han hecho análisis filogenéticos usando uno o más loci o combinándolo con espaciadores intergénicos (p.e. rbcL+ matK+ psbA-trnH) y no obtuvieron una diferencia significativa en el poder de identificación (Yang et al. 2012).

Hasta el presente, existen pocos estudios que permita establecer correlaciones entre los diferentes análisis genéticos en A. xanthorrhiza, además que no existe un banco de germoplasmas donde estén identificados los materiales cultivados en Ecuador. Por lo que se requieren más investigaciones en este cultivo para su mejor aprovechamiento en programas de mejoramiento.

En conclusión, usando la región intergénica no codificadora (psbA-trnH), se logró identificar y obtener la diversidad genética de materiales cultivados de A. xanthorrhiza, provenientes de diversas zonas geográficas de la Sierra ecuatoriana, con características morfológicas distintivas. Adicionalmente, esta secuencia pudo diferenciar a A. xanthorrhiza de otras especies de la familia Apiaceae, con lo cual se recomienda como código de barra.

 

Agradecimientos:

Los autores desean expresar su agradecimiento a la Universidad Técnica de Ambato, Dirección de Investigación y Desarrollo, por el apoyo financiero a través del proyecto 2443-CU-P-2015. A los Srs. Olga Ortiz de la Granja Agroecológica San Martin, Elvira Moposita, Ana Bonilla y José Aguirre por los materiales de zanahoria blanca suministrados.

Conflicto de intereses:

Los autores no incurren en conflictos de intereses.

Rol de los autores:

MD, CV: Diseño del proyecto, análisis de datos y redacción del manuscrito, NP, VF: participaron en el trabajo de laboratorio y en el muestreo en campo, HL: Análisis de datos, OL: Participó en el muestreo en campo.

Fuentes de financiamiento:

Universidad Técnica de Ambato, Dirección de Investigación y Desarrollo, proyecto 2443-CU-P-2015

Aspectos éticos / legales:

Los autores declaran que en el presente trabajo no se trasgredió ninguna norma ética ni legal.

Citación:

Dávila M., H. Laurentín, C. Vásquez, S. Paredes- Carreño, V. Frutos & O. León. 2019. Evaluación de dos secuencias de código de barras de ADN en germoplasmas de Arracacia xanthorrhiza (Apiaceae) de Ecuador. Revista peruana de biología 26(4): 491 498 (Diciembre 2019). doi: http://dx.doi.org/10.15381/rpb.v26i4.15829

 

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Correspondencia:

*Autor de correspondencia

Marta Dávila: mb.davila@uta.edu.ec

Hernan Laurentín: hlaurentin@ucla.edu.ve

Carlos Vásquez: ca.vasquez@uta.edu.ec

Sara Paredes-Carreño: nathy_paredes@yahoo.com

Vanessa Frutos: vanefrp91@gmail.com

Olguer León: oa.leon@uta.edu.ec

 

Presentado: 01/02/2019

Aceptado: 26/04/2019

Publicado online: 16/12/2019

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